Введение
Семейство белков
Поли (АДФ-рибоза) полимераза (ПАРП) — это семейство белков, участвующих в ряде клеточных процессов, таких как репарация ДНК, геномная стабильность и запрограммированная клеточная гибель.
Члены семейства PARP
Семейство PARP включает 17 членов (10 предполагаемых). Они значительно различаются по структуре и функции в клетке. Активность PARP подтверждена для PARP1, PARP2, VPARP (PARP4), танкиразы 1 и 2 (PARP 5a или TNKS, и PARP 5b или TNKS2). К другим относятся PARP3, TIPARP (или "PARP7"), PARP8, PARP10, PARP12 и PARP16.
Структура
PARP состоит из четырех доменов, представляющих интерес: домена связывания ДНК, домена, расщепляемого каспазами (см. ниже), домена аутомодификации и каталитического домена. Домен связывания ДНК состоит из двух мотивов «цинковые пальцы». В присутствии поврежденной ДНК (после удаления основания) домен связывания ДНК связывается с ДНК и индуцирует конформационный сдвиг. Показано, что это связывание происходит независимо от других доменов. Это является ключевым элементом в модели программируемой клеточной гибели, основанной на ингибировании расщепления PARP каспазами. Домен аутомодификации отвечает за высвобождение белка из ДНК после катализа, а также играет важную роль в инактивации, вызванной расщеплением.
Функции
Основная роль PARP (находится в ядре клетки) заключается в обнаружении и инициировании немедленного клеточного ответа на метаболические, химические или радиационные повреждения одноцепочечной ДНК (SSB), сигнализируя ферментативным механизмам, участвующим в восстановлении SSB. Как только PARP обнаруживает SSB, он связывается с ДНК, претерпевает структурные изменения и начинает синтез полимерной цепи аденозиндифосфат-рибозы (поли(АДФ-рибоза) или PAR), которая действует как сигнал для других ферментов, восстанавливающих ДНК. Целевые ферменты включают ДНК лигазу III (LigIII), ДНК полимеразу бета (polβ) и каркасные белки, такие как ген, комплементирующий рентгеновское перекрестное излучение 1 (XRCC1). После восстановления цепи PAR разлагаются посредством поли(АДФ-рибозо)гликогидролазы (PARG). NAD+ необходим в качестве субстрата для генерации мономеров АДФ-рибозы. Долгое время считалось, что чрезмерная активация PARP может истощить запасы клеточного NAD+ и вызвать прогрессирующее истощение АТФ и некротическую гибель клеток, поскольку окисление глюкозы ингибируется. Однако в последнее время было предложено, что ингибирование активности гексокиназы приводит к нарушениям гликолиза (Андраби, PNAS 2014). Базальная активность PARP также регулирует базовую биоэнергетику. Следует отметить, что PARP инактивируется расщеплением каспазой 3 во время запрограммированной клеточной гибели. Ферменты PARP необходимы для ряда клеточных функций, включая экспрессию воспалительных генов: PARP1 необходим для индукции экспрессии гена ICAM 1 кардиомиоцитами и клетками гладкой мускулатуры в ответ на TNF.
Активность
Каталитический домен отвечает за полимеризацию поли(АДФ-рибозы). Этот домен содержит высококонсервативный мотив, общий для всех членов семейства PARP. Полимер PAR может достигать длины до 200 нуклеотидов, прежде чем индуцировать апоптотические процессы. Формирование полимера PAR аналогично формированию полимера ДНК из нуклеозидтрифосфатов. Нормальный синтез ДНК требует, чтобы пирофосфат выступал в роли уходящей группы, оставляя одну фосфатную группу, связывающую дезоксирибозные сахара. PAR синтезируется с использованием никотинамида (NAM) в качестве уходящей группы. Это приводит к тому, что пирофосфат становится связующей группой между рибозными сахарами, а не одиночными фосфатными группами. Это придает мосту PAR определенный объем, который может играть дополнительную роль в клеточной сигнализации.
Роль в восстановлении ДНК
Одной из важных функций PARP является участие в восстановлении одноцепочечных повреждений ДНК. Он связывается с участками одноцепочечных разрывов посредством N-концевых цинковых пальцев и рекрутирует к повреждению XRCC1, ДНК-лигазу III, ДНК-полимеразу β и киназу. Этот процесс называется восстановлением по удалению основания (BER). Показано, что PARP 2 олигомеризует с PARP 1 и, следовательно, также вовлечен в BER. Олигомеризация также стимулирует каталитическую активность PARP. PARP 1 также известен своей ролью в транскрипции, осуществляемой посредством ремоделирования хроматина путем PAR-модификации гистонов и расслабления структуры хроматина, что обеспечивает доступ транскрипционного комплекса к генам. PARP 1 и PARP 2 активируются при одноцепочечных разрывах ДНК, и у мышей с нокаутом по генам PARP 1 и PARP 2 наблюдаются серьезные дефекты в восстановлении ДНК и повышенная чувствительность к алкилирующим агентам или ионизирующему излучению.
Активность и срок службы ПАРП
Активность PARP (которая в основном обусловлена PARP1), измеренная в проницаемых мононуклеарных лейкоцитах крови тринадцати видов млекопитающих (крысы, морские свинки, кролики, мармосеты, овцы, свиньи, крупный рогатый скот, карликовый шимпанзе, лошади, ослы, гориллы, слоны и человек), коррелирует с максимальной продолжительностью жизни этих видов. Разница в активности между наиболее долгоживущими (людьми) и наименее долгоживущими (крысами) исследованными видами составила 5 раз. Хотя кинетика ферментов (одномолекулярная константа скорости (kcat), Km и kcat/km) двух ферментов не имела существенных различий, было обнаружено, что у человека PARP1 специфическая способность к аутомодификации в два раза выше, чем у фермента крысы, что, по мнению авторов, может частично объяснять более высокую активность PARP у людей по сравнению с крысами. Лимфобластоидные клеточные линии, полученные из образцов крови людей, достигших возраста 100 лет и старше, демонстрируют значительно более высокую активность PARP, чем клеточные линии от более молодых людей (в возрасте от 20 до 70 лет), что вновь указывает на связь между долголетием и способностью к репарации. Эти данные позволяют предположить, что способность к репарации ДНК, опосредованная PARP, вносит вклад в долголетие млекопитающих. Таким образом, эти результаты подтверждают теорию повреждения ДНК, согласно которой невосстановленное повреждение ДНК является основной причиной старения, а способность к репарации ДНК способствует увеличению продолжительности жизни.
Роль танкираз
Танкиразы (ТНК) – это PARP, состоящие из повторов анкирина, домена олигомеризации (SAM) и каталитического домена PARP (PCD). Танкиразы также известны как PARP 5a и PARP 5b. Своё название они получили благодаря взаимодействию с белками TERF1, ассоциированными с теломерами, и анкириновыми повторами. Они могут способствовать удалению комплексов, ингибирующих теломеразу, с концов хромосом, обеспечивая поддержание теломер. Через свой SAM-домен и ANK они способны олигомеризоваться и взаимодействовать со многими другими белками, такими как TRF1, TAB182 (TNKS1BP1), GRB14, IRAP, NuMa, EBNA 1 и Mcl 1. Они выполняют множество функций в клетке, например, участвуют в везикулярном транспорте посредством взаимодействия в везикулах GLUT4 с инсулиночувствительной аминопептидазой (IRAP). Они также играют роль в сборке митотического веретена через взаимодействие с белком ядерного митотического аппарата 1 (NuMa), обеспечивая необходимую биполярную ориентацию. В отсутствие ТНК наблюдается остановка митоза на преанафазе посредством контрольной точки шпинделя Mad2. ТНК также могут PAR-силировать Mcl 1L и Mcl 1S и ингибировать как их про-апоптотическую, так и антиапоптотическую функции; значимость этого пока не установлена.
Роль в гибели клеток
PARP может быть активирован в клетках, подвергающихся стрессу и/или повреждению ДНК. Активированный PARP может истощать клетку АТФ в попытке восстановить поврежденную ДНК. Истощение АТФ в клетке приводит к лизису и гибели клеток (некрозу). PARP также обладает способностью индуцировать запрограммированную клеточную гибель посредством продукции PAR, который стимулирует митохондрии к высвобождению AIF. Этот механизм, по-видимому, не зависит от каспаз. Расщепление PARP ферментами, такими как каспазы или катепсины, обычно приводит к его инактивации. Размер фрагментов расщепления может дать представление о том, какой фермент был ответственен за расщепление, и может быть полезен для определения активированного пути клеточной гибели.
Роль в эпигенетической модификации ДНК
Фактор связывания CCCTC (CTCF) индуцирует накопление PAR. Полимеры ADP-рибозы, как свободные, так и связанные с PARP1, способны ингибировать активность ДНК-метилтрансферазы в CpG-сайтах. Таким образом, CTCF участвует в перекрестных взаимодействиях между поли(ADP-рибозилированием) и метилированием ДНК – важным эпигенетическим регуляторным фактором. Значительный объем данных также относится к роли PARP при определенных неонкологических состояниях. При ряде тяжелых острых заболеваний (таких как инсульт, нейротравма, циркуляторный шок и острый инфаркт миокарда) ингибиторы PARP оказывают терапевтический эффект (например, уменьшение размера инфаркта или улучшение функции органов). Имеются также наблюдательные данные, демонстрирующие активацию PARP в образцах тканей человека. При этих состояниях переактивация PARP, вызванная окислительным и нитративным стрессом, приводит к некрозу клеток и провоспалительной экспрессии генов, что способствует развитию патологии. По мере продвижения клинических испытаний ингибиторов PARP при различных формах рака, есть надежда на начало второй линии клинических исследований, направленных на оценку ингибиторов PARP для различных неонкологических состояний, в процессе, называемом «терапевтическим перепрофилированием».
Инективация
PARP инактивируется расщеплением каспазами. Считается, что нормальная инактивация происходит в системах с обширным повреждением ДНК. В этих случаях на восстановление повреждений потребовалось бы больше энергии, чем это возможно, поэтому энергия вместо этого направляется другим клеткам ткани посредством запрограммированной клеточной гибели. Помимо деградации, имеются недавние данные о механизмах обратимой регуляции PARP, в том числе об "авторегуляторной петле", которая инициируется самим PARP1 и модулируется транскрипционным фактором YY1. Хотя in vitro расщепление каспазами происходит во всех семействах каспаз, предварительные данные указывают на то, что каспазы 3 и 7 ответственны за расщепление in vivo. Расщепление происходит в позициях аспарагиновой кислоты 214 и глицина 215, разделяя PARP на фрагменты 24 кДа и 89 кДа. Меньший фрагмент содержит мотив цинковых пальцев, необходимый для связывания ДНК. Фрагмент 89 кДа включает в себя домен аутомодификации и каталитический домен. Предполагаемый механизм активации ПКД через инактивацию PARP основан на разделении области связывания ДНК и домена аутомодификации. Область связывания ДНК способна функционировать независимо от остальной части белка, как расщепленного, так и нерасщепленного. Однако она не может диссоциировать без домена аутомодификации. Таким образом, домен связывания ДНК присоединяется к поврежденному участку и не может инициировать восстановление, поскольку лишен каталитического домена. Домен связывания ДНК препятствует доступу к поврежденному участку и началу восстановления другими, нерасщепленными молекулами PARP. Эта модель предполагает, что этот "блокирующий элемент" также может инициировать сигнал для апоптоза.
ПАРП растений
Изучались роли поли(ADP-рибозилирования) в реакциях растений на повреждение ДНК, инфекцию и другие стрессы. Растительная PARP1 очень похожа на животную PARP1, но, что примечательно, у Arabidopsis thaliana и, вероятно, у других растений, PARP2 играет более важную роль, чем PARP1, в защитных реакциях на повреждение ДНК и бактериальный патогенез. Растительная PARP2 содержит регуляторные и каталитические домены PARP, демонстрирующие лишь умеренное сходство с PARP1, а также N-концевые мотивы связывания ДНК SAP, в отличие от мотивов связывания ДНК в виде цинковых пальцев, характерных для растительных и животных белков PARP1.