Трихромное окрашивание в гистологии: методы и применение.

Введение

Метод гистологического окрашивания

Трихромное окрашивание – это гистологический метод окрашивания, использующий два или более кислотных красителя в сочетании с поликислотой. Окрашивание позволяет различать ткани, придавая им контрастные цвета. Оно повышает контрастность микроскопических структур в клетках и тканях, что облегчает их визуализацию при микроскопии. Слово "трихром" означает "три цвета". Первым протоколом окрашивания, описанным как "трихромный", был трихромный метод Малори, который дифференциально окрашивал эритроциты в красный цвет, мышечную ткань в красный цвет, а коллаген – в синий цвет. К другим протоколам трихромного окрашивания относятся трихромный метод Массона, трихромный метод Лилли и трихромный метод Гомори.

Цель

Без трихромного окрашивания распознать одну структуру от другой может быть крайне затруднительно. Например, гладкую мышечную ткань сложно отличить от коллагена. Трихромное окрашивание позволяет окрасить мышечную ткань в красный цвет, а коллагеновые волокна – в зеленый или синий. В биоптатах печени между клетками печени могут присутствовать тонкие коллагеновые волокна, а количество коллагена можно оценить, основываясь на методе окрашивания. Трихромные методы сейчас используются для дифференцировки мышц от коллагена, альфа-клеток гипофиза от бета-клеток, фибрина от коллагена, а также для визуализации митохондрий в свежезамороженных срезах мышц и для других целей. Это помогает выявлять увеличение количества коллагеновой ткани (то есть фибротические изменения), например, при циррозе печени, и различать опухоли, происходящие из мышечных клеток и фибробластов.

Процедура

В методах трихромного окрашивания используются два или более кислотных красителя. Обычно кислотные красители окрашивают одни и те же основные белки, но последовательное их применение позволяет манипулировать рисунком окрашивания. Поликислота (например, фосфомолибденовая кислота или вольфрамофосфорная кислота) используется для селективного удаления красителя. Считается, что поликислоты ведут себя как красители с высокой молекулярной массой: они вытесняют легко удаляемый краситель из коллагена. Как правило, сначала наносят красный краситель в разбавленной уксусной кислоте для предварительного окрашивания всех компонентов. Затем поликислота удаляет красный краситель из коллагена и некоторых других компонентов путем вытеснения. После этого наносят второй кислотный краситель (синий или зеленый) в разбавленной уксусной кислоте, который, в свою очередь, вытесняет поликислоту, в результате чего коллаген окрашивается в цвет, контрастный первоначальному красителю. Если необходимо окрасить эритроциты, перед окрашиванием красным красителем наносят желтый или оранжевый краситель с небольшой молекулярной массой. Обычно его наносят из насыщенного раствора в 80% этаноле, часто в сочетании с пикриновой кислотой (которая сама является красителем) и поликислотой. Методы основаны на незначительных различиях в реакции тканей на красители, их плотности, доступности и т.д. Трихромные окрашивания, в которых красители и поликислота наносятся последовательно, называются многоступенчатыми трихромами. В "одноступенчатых" методах все красители – с поликислотой или без нее – объединяются в один раствор. Одним из старейших одноступенчатых подходов к трихромному окрашиванию является метод ван Гизона, который окрашивает мышцы и цитоплазму в желтый цвет, а коллаген – в красный. Другой пример – трихромное окрашивание по Гомори, которое тесно имитирует трихром Массона. В методах "yellowsolve" сначала наносят красный краситель в разбавленной уксусной кислоте, а затем образец очень тщательно обезвоживают, чтобы полностью удалить влагу. Затем красный краситель вытесняется желтым красителем в растворителе, таком как целлозольв (2-этоксиэтанол). Название "yellowsolve" является комбинацией слов "yellow" (желтый) и "cellosolve" (целлозольв). Флоксин тартразин Лендрума для окрашивания клеточных включений – один из примеров "yellowsolve" окрашивания.

Trichrome staining techniques employ two or more acid dyes. Normally acid dyes would stain the same basic proteins, but by applying them sequentially the staining pattern can be manipulated. A polyacid (such as phosphomolybdic acid or tungstophosphoric acid) is used to remove dye selectively. Polyacids are thought to behave as dyes with a high molecular weight: they displace easily removed dye from collagen. Usually a red dye in dilute acetic acid is applied first to overstain all components. Then a polyacid is applied to remove the red dye from collagen and some other components by displacement. A second acid dye (blue or green) in dilute acetic acid is applied which, in turn, displaces the polyacid, resulting in collagen stained in a contrasting colour to the initial dye used. If erythrocytes are to be stained, a small molecular weight yellow or orange dye is applied before staining with the red dye. It is usually applied from a saturated solution in 80% ethanol and often in conjunction with picric acid (itself a dye) and a polyacid. The methods exploit minor differences in tissue reaction to dyes, density, accessibility and so on. Trichrome stains in which dyes and a polyacid are applied sequentially are called multi step trichromes. In "one step" methods, all the dyes—with or without a polyacid—are combined in a single solution. One of the oldest single step approaches to trichrome staining is van Gieson's method, which stains muscle and cytoplasm yellow, and collagen red. Another is the Gömöri trichrome stain, which closely mimics Masson's trichrome. In "yellowsolve" methods, a red dye in dilute acetic acid is first applied, then the section is very thoroughly dehydrated to ensure that no moisture remains. The red dye is then displaced by a yellow dye in a solvent, such as cellosolve (2 ethoxy ethanol). The name yellowsolve is a blend of the terms yellow and cellosolve. Lendrum's phloxine tartrazine for cell inclusions is one example of a yellowsolve stain.