Пируваткарбоксилаза: структура, функция и регуляция.

Введение

Энзим пируваткарбоксилаза (PC), кодируемый геном PC, является ферментом класса лигаз, который катализирует (в зависимости от вида) физиологически необратимое карбоксилирование пирувата с образованием оксалоацетата (OAA). Реакция, которую он катализирует, выглядит следующим образом: пируват + CO₂ + АТФ → оксалоацетат + АДФ + Ф.

Это важная анаплеротическая реакция, создающая оксалоацетат из пирувата. Фермент представляет собой митохондриальный белок, содержащий протезную группу биотина. С тех пор он был обнаружен у широкого разнообразия прокариотов и эукариотов, включая грибы, бактерии, растения и животных. У млекопитающих PC играет важнейшую роль в глюконеогенезе и липогенезе, в биосинтезе нейротрансмиттеров и в глюкозоиндуцированной секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы. Оксалоацетат, образующийся при участии PC, является важным промежуточным продуктом, используемым в этих биосинтетических путях. У млекопитающих PC экспрессируется в тканях специфическим образом, при этом его активность наиболее высока в печени и почках (глюконеогенных тканях), в жировой ткани и молочной железе (липогенных тканях) и в β-клетках поджелудочной железы. Активность умеренная в мозге, сердце и надпочечниках, а наименьшая – в лейкоцитах и фибробластах кожи.

Структура

Структурные исследования ПК проводились с помощью электронной микроскопии, ограниченного протеолиза, клонирования и секвенирования генов и кДНК, кодирующих фермент. Наиболее хорошо охарактеризованные формы активного ПК состоят из четырех идентичных субъединиц, расположенных в тетраэдрической структуре. Каждая субъединица содержит одну биотинную группу, действующую как подвижный рычаг для транспортировки углекислого газа к каталитическому центру, который формируется на границе между соседними мономерами. Каждая субъединица функционального тетрамера содержит четыре домена: домен биотин-карбоксилирования (BC), домен транскарбоксилирования (CT), домен биотин-карбоксил-переносчика (BCCP) и недавно обозначенный домен ПК-тетрамеризации (PT). По двум наиболее полным доступным кристаллическим структурам была визуализирована асимметричная и симметричная формы белка. Тетрамер *Staphylococcus aureus* в комплексе с активатором коферментом А обладает высокой симметрией, имея симметрию 222, что подтверждено криоэлектронной микроскопией. и преобразуется в глюкозу цитозольными глюконеогенными ферментами. Однако во время голодания, когда концентрация цитозольного NADH низкая, а уровень митохондриального NADH высокий, оксалоацетат может использоваться в качестве переносчика восстановительных эквивалентов. В связи с этим ОАА преобразуется в малат митохондриальной малатдегидрогеназой (МДГ). После экспорта в цитозоль малат вновь преобразуется в ОАА, с одновременным восстановлением NAD+; ОАА затем преобразуется в ФЕФ, который становится доступным для глюконеогенеза в цитозоле вместе с транспортируемым восстановительным эквивалентом NADH. У крыс и мышей было показано, что изменение статуса питания влияет на активность печеночного ПК. Голодание стимулирует продукцию глюкозы в печени, поддерживаемую повышенным потоком пирувата, и увеличивает активность ПК и концентрацию белка; диабет аналогичным образом усиливает глюконеогенез за счет повышенного поглощения субстрата и увеличения потока через печеночный ПК у мышей и крыс. Подобно другим глюконеогенным ферментам, ПК положительно регулируется глюкагоном и глюкокортикоидами и отрицательно – инсулином. Помимо роли ПК в глюконеогенезе, ПК выполняет анаплеротическую функцию (ферментативно-катализируемая реакция, которая может восполнить запасы промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты) для трикарбоновой кислоты (необходимой для обеспечения оксалоацетата), когда промежуточные продукты удаляются для различных биосинтетических целей.

Structural studies of PC have been conducted by electron microscopy, by limited proteolysis, and by cloning and gasa sequencing of genes and cDNA encoding the enzyme. Most well characterized forms of active PC consist of four identical subunits arranged in a tetrahedron like structure. Each subunit contains a single biotin moiety acting as a swinging arm to transport carbon dioxide to the catalytic site that is formed at the interface between adjacent monomers. Each subunit of the functional tetramer contains four domains: the biotin carboxylation (BC) domain, the transcarboxylation (CT) domain, the biotin carboxyl carrier (BCCP) domain and the recently termed PC tetramerization (PT) domain. From the two most complete crystal structures available, an asymmetric and symmetric form of the protein have been visualized. The Staphylococcus aureus tetramer in complex with the activator coenzyme A is highly symmetric, possessing 222 symmetry, and has been confirmed by cryo EM studies. and converted into glucose by cytosolic gluconeogenic enzymes. However, during starvation when cytosolic NADH concentration is low and mitochrondrial NADH levels are high oxaloacetate can be used as a shuttle of reducing equivalents. As such OAA is converted into malate by mitochondrial malate dehydrogenase (MDH). After export into the cytosol, malate is converted back into OAA, with concomitant reduction of NAD+; OAA is subsequently converted to PEP which is available for gluconeogenesis in the cytosol along with the transported reducing equivalent NADH. In rats and mice, alteration of nutrition status has been shown to affect hepatic PC activity. Fasting promotes hepatic glucose production sustained by an increased pyruvate flux, and increases in PC activity and protein concentration; diabetes similarly increases gluconeogenesis through enhanced uptake of substrate and increased flux through liver PC in mice and rats. Similarly to other gluconeogenic enzymes, PC is positively regulated by glucagon and glucocorticoids while negatively regulated by insulin. Aside from the role of PC in gluconeogenesis, PC serves an anaplerotic role (an enzyme catalyzed reaction that can replenish the supply of intermediates in the citric acid cycle) for the tricarboxylic acid cycle (essential to provide oxaloacetate), when intermediates are removed for different biosynthetic purposes.

Регулирование

Пируваткарбоксилаза аллостерически регулируется ацетил-КоА, Mg-АТФ и пируватом.

Клиническое значение

Как перекресток между углеводным и липидным метаболизмом, экспрессия пируваткарбоксилазы в глюконеогенных тканях, жировой ткани и островках поджелудочной железы должна быть скоординирована. В условиях избыточного питания уровни пируваткарбоксилазы (PC) повышаются в β-клетках поджелудочной железы для увеличения цикла пирувата в ответ на хронически повышенный уровень глюкозы. В отличие от этого, уровни фермента PC в печени снижаются инсулином; в периоды избыточного питания жировая ткань расширяется с экстремальной экспрессией PC и других липогенных ферментов. Печеночный контроль уровня глюкозы все еще сохраняется в условиях избыточного питания, но при диабете 2 типа, индуцированном ожирением, регуляция периферического уровня глюкозы больше не находится под контролем инсулина. У крыс с диабетом 2 типа хроническое воздействие глюкозы на β-клетки из-за периферической инсулинорезистентности приводит к снижению активности фермента PC и уменьшению цикла пирувата. Продолжающаяся перепродукция глюкозы гепатоцитами вызывает резкое изменение экспрессии генов в β-клетках, с существенным увеличением экспрессии генов, обычно подавляемых, и эквивалентным снижением экспрессии мРНК для инсулина, ионных насосов, необходимых для секреции инсулина, и метаболических ферментов, связанных с секрецией инсулина, включая пируваткарбоксилазу. Одновременно в жировой ткани развивается инсулинорезистентность, вызывающая накопление триацилглицеролов и неэтерифицированных жирных кислот в кровотоке; это не только еще больше ухудшает функцию β-клеток, но и дополнительно снижает экспрессию PC. Эти изменения приводят к снижению фенотипа β-клеток при декомпенсированном диабете. Дефицит пируваткарбоксилазы может вызвать молочнокислый ацидоз в результате накопления лактата. Обычно избыток пирувата направляется в глюконеогенез посредством преобразования пирувата в оксалоацетат, но из-за дефицита фермента избыток пирувата превращается в лактат. Поскольку ключевая роль глюконеогенеза заключается в поддержании уровня глюкозы в крови, дефицит пируваткарбоксилазы также может привести к гипогликемии.

As a crossroad between carbohydrate and lipid metabolism, pyruvate carboxylase expression in gluconeogenic tissues, adipose tissues and pancreatic islets must be coordinated. In conditions of over nutrition, PC levels are increased in pancreatic β cells to increase pyruvate cycling in response to chronically elevated levels of glucose. In contrast, PC enzyme levels in the liver are decreased by insulin; during periods of overnutrition adipocyte tissue is expanded with extreme expression of PC and other lipogenic enzymes. Hepatic control of glucose levels is still regulated in an over nutrition situation, but in obesity induced type 2 diabetes the regulation of peripheral glucose levels is no longer under regulation of insulin. In type 2 diabetic rats, chronic exposure of β cells to glucose due to peripheral insulin resistance results in decreased PC enzyme activity and decreased pyruvate cycling. The continued overproduction of glucose by hepatocytes causes dramatic alteration of gene expression in β cells with large increases in normally suppressed genes, and equivalent decreases in expression of mRNA for insulin, ion pumps necessary for insulin secretion, and metabolic enzymes related to insulin secretion, including pyruvate carboxylase. Concurrently adipose tissue develops insulin resistance causing accumulation of triacylglycerols and non esterified fatty acids in circulation; these not only further impairing β cell function, but also further decreasing PC expression. These changes result in the decline of the β cell phenotype in decompensated diabetes. A deficiency of pyruvate carboxylase can cause lactic acidosis as a result of lactate build up. Normally, excess pyruvate is shunted into gluconeogenesis via conversion of pyruvate into oxaloacetate, but because of the enzyme deficiency, excess pyruvate is converted into lactate instead. As a key role of gluconeogenesis is in the maintenance of blood sugar, deficiency of pyruvate carboxylase can also lead to hypoglycemia.