Введение

Физические взаимодействия и комплексы между несколькими белками

Взаимодействия белков с белками (ВББ) – это физические контакты высокой специфичности, устанавливающиеся между двумя или более молекулами белков в результате биохимических событий, обусловленных взаимодействиями, включающими электростатические силы, водородные связи и гидрофобный эффект. Многие из них представляют собой физические контакты с молекулярными ассоциациями между цепями, происходящими в клетке или в живом организме в определенном биомолекулярном контексте. Белки редко действуют изолированно, поскольку их функции, как правило, регулируются. Многие молекулярные процессы внутри клетки осуществляются молекулярными машинами, построенными из многочисленных белковых компонентов, организованных посредством ВББ. Эти физиологические взаимодействия составляют так называемую интерактомику организма, в то время как аномальные ВББ лежат в основе множества заболеваний, связанных с агрегацией, таких как болезнь Крейцфельдта-Якоба и болезнь Альцгеймера. ВББ изучались с использованием различных методов и с разных точек зрения: биохимия, квантовая химия, молекулярная динамика, передача сигналов и другие. Вся эта информация позволяет создавать крупные сети взаимодействия белков – аналогичные метаболическим или генетическим/эпигенетическим сетям – которые расширяют современные знания о биохимических каскадах и молекулярной этиологии заболеваний, а также способствуют выявлению потенциальных белковых мишеней для терапевтических целей.

Белки переноса электронов

Во многих метаболических реакциях белок, выполняющий функцию переносчика электронов, связывается с ферментом, действующим как его редуктаза. После принятия электрона он диссоциирует и затем связывается со следующим ферментом, выполняющим функцию оксидазы (то есть акцептора электрона). Эти взаимодействия между белками зависят от высокоспецифичного связывания белков, обеспечивающего эффективный перенос электронов. Примеры: компоненты митохондриальной цепи окислительного фосфорилирования – цитохром c редуктаза / цитохром c / цитохром c оксидаза; микросомальные и митохондриальные системы P450. В случае митохондриальных систем P450 специфические аминокислотные остатки, участвующие в связывании белка-переносчика электронов адренодоксина с его редуктазой, были идентифицированы как два основных Arg-остатка на поверхности редуктазы и два кислых Asp-остатка на адренодоксине. Более поздние исследования филогенеза редуктазы показали, что эти остатки, участвующие в белок-белковых взаимодействиях, консервативны в ходе эволюции этого фермента.

Трансдукция сигнала

Активность клетки регулируется внеклеточными сигналами. Распространение сигнала внутри и/или по внутренней части клеток зависит от белок-белковых взаимодействий между различными сигнальными молекулами. Активация сигнальных путей посредством белок-белковых взаимодействий называется трансдукцией сигнала и играет фундаментальную роль во многих биологических процессах и во многих заболеваниях, включая болезнь Паркинсона и рак.

Транспорт мембран

Белок может транспортировать другой белок (например, из цитоплазмы в ядро или обратно, в случае импортинов ядерных пор).

Метаболизм клеток

Во многих биосинтетических процессах ферменты взаимодействуют друг с другом, образуя небольшие соединения или другие макромолекулы.

Сокращение мышц

Физиология сокращения мышц включает в себя несколько взаимодействий. Миозиновые нити выступают в роли молекулярных двигателей и, связываясь с актином, обеспечивают скольжение нитей. Кроме того, белки семейства, ассоциированные с липидными каплями скелетной мышцы, взаимодействуют с другими белками, такими как активатор адипозной триглицеридной липазы и ее коактиватор Comparative Gene Identification 58, для регуляции липолиза в скелетной мышце.

Типы

Для описания типов белково-белковых взаимодействий (ББВ) важно учитывать, что белки могут взаимодействовать "транзиторно" (для достижения определенного эффекта за короткий промежуток времени, например, при передаче сигнала) или "стабильно", образуя комплексы, которые становятся молекулярными машинами в живых системах. Формирование белкового комплекса может приводить к образованию гомоолигомерных или гетероолигомерных комплексов. Помимо общепринятых комплексов, таких как ингибитор фермента и антиген антитела, взаимодействия могут устанавливаться между доменом и доменом, а также между доменом и пептидом. Важным аспектом при идентификации белково-белковых взаимодействий является способ их определения, поскольку существуют методы, измеряющие прямые физические взаимодействия между парами белков – так называемые "бинарные" методы, и другие методы, измеряющие физические взаимодействия между группами белков без установления парных партнеров – "методы ко-комплексов".

Гомо-олигомеры против гетеро-олигомеров

Олигомеры гомо – это макромолекулярные комплексы, состоящие только из одного типа белковой субъединицы. Сборка белковых субъединиц направляется установлением нековалентных взаимодействий в четвертичной структуре белка. Разрушение олигомеров гомо с целью возвращения к исходным отдельным мономерам часто требует денатурации комплекса. В то время как некоторые Gq-связанные рецепторы, такие как мускариновый рецептор M3, предварительно связываются с Gq-белками до связывания лиганда с рецептором. Взаимодействия между внутренне неупорядоченными областями белка и глобулярными доменами белка (т.е. MoRF) являются транзиторными взаимодействиями.

Ковалентные и нековалентные

Ковалентные взаимодействия характеризуются наиболее прочной связью и формируются за счет дисульфидных связей или обобщения электронов. Хотя они встречаются нечасто, эти взаимодействия играют определяющую роль в некоторых посттрансляционных модификациях, таких как убиквитинирование и SUMOилирование. Нековалентные связи обычно устанавливаются при временных взаимодействиях посредством комбинации более слабых связей, таких как водородные связи, ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса или гидрофобные взаимодействия. Кристаллические структуры комплексов, полученные с высоким разрешением из различных, но гомологичных белков, показали, что некоторые молекулы воды на границе раздела сохраняются между гомологичными комплексами. Большинство молекул воды на границе раздела образуют водородные связи с обоими партнерами в каждом комплексе. Некоторые аминокислотные остатки или атомные группы одного белкового партнера участвуют как в прямых, так и в опосредованных водой взаимодействиях с другим белковым партнером. Двойные косвенные взаимодействия, опосредованные двумя молекулами воды, более распространены в гомологичных комплексах с низкой аффинностью. Тщательно спланированные эксперименты по мутагенезу, например, замена остатка тирозина на фенилаланин, показали, что опосредованные водой взаимодействия могут вносить вклад в энергию взаимодействия. Таким образом, молекулы воды могут способствовать взаимодействию и взаимному распознаванию между белками.

Структура

Молекулярные структуры многих белковых комплексов были установлены с помощью метода рентгеновской кристаллографии. Первой структурой, определенной этим методом, была структура миоглобина кашалота, полученная сэром Джоном Каудери Кендрю. В этой технике углы и интенсивности пучка рентгеновских лучей, дифрагированных кристаллическими атомами, регистрируются на пленке, что позволяет создать трехмерное изображение электронной плотности внутри кристалла. Позднее, ядерный магнитный резонанс также начали использовать для определения молекулярной структуры белковых комплексов. Одним из первых примеров стала структура доменов связывания кальмодулина, связанных с кальмодулином. Эта техника основана на изучении магнитных свойств атомных ядер, что позволяет определить физические и химические свойства соответствующих атомов или молекул. Ядерный магнитный резонанс особенно полезен для характеристики слабых белок-белковых взаимодействий.

Скрининг двухгибридных дрожжей

Эта система была впервые описана в 1989 году Филдсом и Сонгом с использованием *Saccharomyces cerevisiae* в качестве биологической модели. Дрожжевой двухгибридный анализ позволяет идентифицировать парные белок-белковые взаимодействия (ББВ) (бинарный метод) *in vivo*, при котором два белка тестируются на биофизически прямое взаимодействие. Метод Y2H основан на функциональной реконструкции дрожжевого транскрипционного фактора Gal4 и последующей активации селективного репортера, такого как His3. Для тестирования двух белков на взаимодействие создаются две экспрессионные конструкции: один белок (X) сливается с доменом связывания с ДНК Gal4 (DB), а второй белок (Y) – с доменом активации Gal4 (AD). В ходе анализа дрожжевые клетки трансформируют этими конструкциями. Транскрипция репортерных генов не происходит, если приманка (DB X) и добыча (AD Y) не взаимодействуют друг с другом и не формируют функциональный транскрипционный фактор Gal4. Таким образом, о взаимодействии между белками можно судить по наличию продуктов, полученных в результате экспрессии гена-репортера. В случаях, когда репортерный ген экспрессирует ферменты, позволяющие дрожжам синтезировать незаменимые аминокислоты или нуклеотиды, рост дрожжей в селективной среде указывает на то, что два протеина взаимодействуют. Недавно было опубликовано программное обеспечение для обнаружения и приоритизации белковых взаимодействий. Несмотря на свою полезность, система дрожжевого двухгибридного анализа имеет ограничения. Она использует дрожжи в качестве основной системы-хозяина, что может быть проблемой при изучении белков, содержащих посттрансляционные модификации, специфичные для млекопитающих. Количество идентифицированных ББВ обычно невелико из-за высокого уровня ложноотрицательных результатов и, например, недооценивает количество мембранных белков. В первоначальных исследованиях с использованием Y2H часто не проводили надлежащий контроль ложноположительных результатов (например, когда DB X активирует репортерный ген без присутствия AD Y), что приводило к более высокому, чем обычно, уровню ложноположительных результатов. Для контроля этих ложноположительных результатов необходимо внедрить эмпирический подход. Ограничения в охвате мембранных белков были преодолены благодаря появлению вариантов дрожжевого двухгибридного анализа, таких как мембранный дрожжевой двухгибридный анализ (MYTH).

Очистка аффинности в сочетании с масс-спектрометрией

Аффинная очистка в сочетании с масс-спектрометрией преимущественно выявляет стабильные взаимодействия и, следовательно, точнее отражает функциональные белок-белковые взаимодействия in vivo.

Внутреннее дополнение

Когда несколько копий полипептида, закодированного геном, образуют комплекс, эта белковая структура называется мультимером. Когда мультимер формируется из полипептидов, произведенных двумя различными мутантными аллелями одного и того же гена, смешанный мультимер может проявлять более высокую функциональную активность, чем мультимеры, образованные каждым из мутантов по отдельности. В этом случае явление называется внутригенной комплементацией (также известной как интер-аллельная комплементация). Внутригенная комплементация была продемонстрирована во многих различных генах в разнообразных организмах, включая грибы *Neurospora crassa*, *Saccharomyces cerevisiae* и *Schizosaccharomyces pombe*; бактерию *Salmonella typhimurium*; вирус бактериофаг T4, РНК-вирус и человека. В подобных исследованиях часто изолировались и картировались в линейном порядке многочисленные мутации, дефектные в одном и том же гене, на основе частот рекомбинации для построения генетической карты гена. Мутанты тестировались попарно для измерения комплементации. Анализ результатов этих исследований привел к выводу, что внутригенная комплементация, как правило, возникает в результате взаимодействия различных дефектных полипептидных мономеров с образованием мультимера. Гены, кодирующие полипептиды, формирующие мультимеры, встречаются довольно часто. Одно из возможных объяснений данных заключается в том, что полипептидные мономеры часто выстраиваются в мультимере таким образом, что мутантные полипептиды с дефектами в близлежащих участках генетической карты склонны образовывать смешанный мультимер с низкой функциональностью, в то время как мутантные полипептиды с дефектами в отдаленных участках склонны образовывать смешанный мультимер с более высокой эффективностью. Прямое взаимодействие двух новосинтезируемых белков, выходящих из соседних рибосом, представляется общим механизмом образования гомоолигомеров (мультимеров). Сотни белковых олигомеров, собирающихся в клетках человека посредством такого взаимодействия, были идентифицированы.

Другие возможные методы

Различные методы идентификации взаимодействий белков (ИБП) появляются по мере развития технологий. К ним относятся ко-иммунопреципитация, белковые микромассивы, аналитическая ультрацентрифугация, рассеяние света, флуоресцентная спектроскопия, картографирование интерактом млекопитающих на основе люминесценции (LUMIER), системы резонансного переноса энергии, ловушки для взаимодействия белков млекопитающих, электропереключаемые биоповерхности, анализ комплементации белковых фрагментов, а также измерения в реальном времени без использования меток с помощью поверхностного плазмонного резонанса и калориметрии. Таким образом, мы можем предсказать, могут ли два белка взаимодействовать, определяя, имеет ли каждый из них неперекрывающееся сходство последовательностей с областью одной белковой последовательности в другом геноме. Метод «Сохраняющегося соседства» основан на гипотезе, что если гены, кодирующие два белка, являются соседними на хромосоме во многих геномах, то они, вероятно, функционально связаны (и, возможно, физически взаимодействуют). Метод «Филогенетического профиля» основан на гипотезе, что если два или более белков одновременно присутствуют или отсутствуют в нескольких геномах, то они, вероятно, функционально связаны. Для общего пользования доступно большое разнообразие приложений для извлечения и/или прогнозирования ИБП, а также репозитории, которые часто хранят вручную проверенные и/или вычислительно предсказанные ИБП. Текстовая добыча данных может быть реализована в два этапа: поиск информации, где извлекаются тексты, содержащие названия одного или обоих взаимодействующих белков, и извлечение информации, где извлекается целевая информация (взаимодействующие белки, предполагаемые остатки, типы взаимодействий и т. д.). Существуют также исследования, использующие филогенетическое профилирование, основывающие свою функциональность на теории о том, что белки, участвующие в общих путях, коэволюционируют коррелирующим образом у разных видов. Некоторые более сложные методы текстовой добычи данных используют передовые методы обработки естественного языка (NLP) и создают сети знаний (например, рассматривая названия генов как узлы, а глаголы как ребра). Другие разработки включают методы ядра для прогнозирования белковых взаимодействий.

Методы машинного обучения

Для прогнозирования взаимодействий белок-белок было предложено и рассмотрено множество вычислительных методов. Подходы к прогнозированию можно сгруппировать по категориям, основанным на доказательной базе: последовательность белка, сравнительная геномика, белковые домены, третичная структура белка и топология сети взаимодействий. Из 705 интегральных мембранных белков было прослежено 1985 различных взаимодействий, в которых участвовали 536 белков. Для сортировки и классификации взаимодействий использовалась машина опорных векторов для определения взаимодействий с высокой, средней и низкой степенью достоверности. Система двухгибридного анализа с использованием дрожжей и разделенной убиквитином мембраны использует транскрипционные репортеры для идентификации дрожжевых трансформантов, кодирующих пары взаимодействующих белков. В 2006 году случайный лес, являющийся примером метода контролируемого обучения, был признан наиболее эффективным методом машинного обучения для прогнозирования белковых взаимодействий. Эти методы применялись для выявления белковых взаимодействий в человеческой интерактоме, в частности, интерактоме мембранных белков и интерактоме белков, связанных с шизофренией. RCC – это вычислительное векторное пространство, имитирующее пространство свернутых состояний белков и включающее все одновременно контактирующие наборы аминокислотных остатков, которое может быть использовано для анализа взаимосвязи структуры, функции белка и эволюции.

Базы данных

Крупномасштабная идентификация белок-белковых взаимодействий (ББВ) привела к сотням тысяч взаимодействий, которые были собраны в специализированных биологических базах данных, постоянно обновляемых для обеспечения полных интерактом. Первой из этих баз данных была База данных взаимодействующих белков (DIP). Первичные базы данных собирают информацию об опубликованных ББВ, существование которых доказано экспериментальными методами, как в малых, так и в крупных масштабах. Примеры: DIP, Biomolecular Interaction Network Database (BIND), Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID), Human Protein Reference Database (HPRD), IntAct Molecular Interaction Database, Molecular Interactions Database (MINT), MIPS Protein Interaction Resource on Yeast (MIPS MPact) и MIPS Mammalian Protein–Protein Interaction Database (MIPS MPPI). Метабазы данных обычно формируются путем интеграции информации из первичных баз данных, но могут также собирать собственные данные. Базы данных прогнозов включают множество ББВ, предсказанных с использованием различных методов (описано в отдельной статье). Примеры: Human Protein–Protein Interaction Prediction Database (PIPs), Interlogous Interaction Database (I2D), Known and Predicted Protein–Protein Interactions (STRING db) и Unified Human Interactive (UniHI). Все вышеупомянутые вычислительные методы опираются на исходные базы данных, данные которых могут быть экстраполированы для предсказания новых ББВ. Полнота охвата значительно различается между базами данных. В целом, первичные базы данных содержат наименьшее количество зарегистрированных ББВ, поскольку не интегрируют данные из других источников, в то время как базы данных прогнозов содержат наибольшее количество, поскольку включают в себя и другие типы доказательств, помимо экспериментальных. Например, первичная база данных IntAct содержит 572 063 взаимодействия, метабаза данных APID – 678 000 взаимодействий, а прогнозная база данных STRING – 25 914 693 взаимодействия. Однако важно отметить, что некоторые взаимодействия в базе данных STRING предсказаны только вычислительными методами, такими как Genomic Context, и не подтверждены экспериментально.

Сети взаимодействия

Информация, содержащаяся в базах данных белок-белковых взаимодействий (ББВ), способствует построению сетей взаимодействия. Хотя сеть ББВ для конкретного запросного белка может быть представлена в учебниках, диаграммы ББВ для целых клеток, откровенно говоря, сложны и трудны в создании. Одним из примеров вручную созданной карты молекулярных взаимодействий является карта контроля клеточного цикла, разработанная Куртом Коном в 1999 году. Исходя из карты Кона, Швиковски и соавторы в 2000 году опубликовали статью о ББВ в дрожжах, связав 1548 взаимодействующих белков, определенных методом двухгибридного скрининга. Они использовали метод рисования слоистых графов для первоначального размещения узлов, а затем улучшили компоновку с помощью алгоритма, основанного на силах. Биоинформатические инструменты были разработаны для упрощения сложной задачи визуализации сетей молекулярных взаимодействий и дополнения их другими типами данных. Например, Cytoscape – это широко используемое программное обеспечение с открытым исходным кодом, для которого доступно множество плагинов. Программное обеспечение Pajek полезно для визуализации и анализа очень больших сетей, модулей и MoBaS. Jactive modules интегрируют сети ББВ и данные об экспрессии генов, в то время как MoBaS интегрируют сети ББВ и полногеномные исследования ассоциаций. Белок-белковые связи часто являются результатом множества типов взаимодействий или выводятся из различных подходов, включая ко-локализацию, прямое взаимодействие, подавляющее генетическое взаимодействие, аддитивное генетическое взаимодействие, физическое связывание и другие ассоциации.

Подписываемые сети взаимодействия

Взаимодействие белок-белок часто приводит к активации или репрессии одного из взаимодействующих белков. Такие эффекты могут быть обозначены в сети PPI "знаками" (например, "активация" или "ингибирование"). Хотя такие атрибуты добавляются к сетям уже давно, Vinayagam et al. (2014) ввели для них термин "знаковая сеть". Знаковые сети часто представляются путем обозначения взаимодействия как положительного или отрицательного. Положительное взаимодействие – это взаимодействие, приводящее к активации одного из белков. И наоборот, отрицательное взаимодействие указывает на инактивацию одного из белков. Сети взаимодействия белок-белок часто строятся на основе лабораторных экспериментов, таких как гибридные скрининги на дрожжах или аффинная очистка с последующими методами масс-спектрометрии. Однако эти методы не предоставляют достаточного объема информации для определения типа взаимодействия и, следовательно, для присвоения знаков сетевым схемам.

РНК-интерференционные экраны

Экран интерференции РНК (РНКi) (подавление экспрессии отдельных белков между транскрипцией и трансляцией) является одним из методов, который может быть использован для выявления признаков белково-белковых взаимодействий. Отдельные белки подавляются, и полученные фенотипы анализируются. Коррелирующая фенотипическая связь (то есть, когда ингибирование любого из двух белков приводит к одному и тому же фенотипу) указывает на положительную, или активирующую связь. Фенотипы, которые не коррелируют (то есть, когда ингибирование любого из двух белков приводит к двум различным фенотипам), указывают на отрицательную, или инактивирующую связь. Если белок А зависит от белка В для активации, то ингибирование белка А или В приведет к тому, что клетка лишится функции, обеспечиваемой белком А, и фенотипы будут одинаковыми при ингибировании как А, так и В. Однако, если белок А инактивируется белком В, то фенотипы будут различаться в зависимости от того, какой белок ингибирован (ингибирование белка В предотвратит его способность инактивировать белок А, оставляя А активным; однако, ингибирование А лишит B возможности активации, поскольку А неактивен, и фенотип изменится). Для надежного определения признака для данного белково-белкового взаимодействия необходимо провести несколько РНКi-скринингов. Винаягам и соавторы, разработчики этой методики, утверждают, что требуется минимум девять РНКi-скринингов, при этом уверенность возрастает с увеличением их числа. Несколько свойств белково-белковых взаимодействий, таких как аллостерические сайты и горячие точки, были включены в стратегии разработки лекарств. Тем не менее, лишь немногие белково-белковые взаимодействия являются прямыми мишенями для малых молекул-ингибиторов, одобренных FDA, что подчеркивает огромный нереализованный потенциал для открытия лекарств. В 2014 году Амит Джайсвал и другие смогли разработать 30 пептидов, ингибирующих рекрутмент теломеразы к теломерам, используя исследования белково-белковых взаимодействий. Аркин и соавторы смогли разработать ингибиторы на основе фрагментов антител для регуляции специфических белково-белковых взаимодействий. Поскольку "модуляция" белково-белковых взаимодействий включает не только ингибирование, но и стабилизацию четвертичных белковых комплексов, молекулы с таким механизмом действия (так называемые молекулярные клеи) также интенсивно изучаются.