Фотостимуляция: методы и перспективы в нейробиологии и терапии.

Введение

Фотостимуляция – это использование света для искусственной активации биологических соединений, клеток, тканей или даже целых организмов. Фотостимуляцию можно использовать для неинвазивного изучения различных взаимосвязей между различными биологическими процессами, используя только свет. В перспективе фотостимуляция обладает потенциалом для применения в различных видах терапии, таких как лечение мигрени. Кроме того, фотостимуляция может быть использована для картирования нейронных связей между различными областями мозга путем «освобождения» (uncaging) сигнальных биомолекул светом. Терапию с использованием фотостимуляции называют светотерапией, фототерапией или фотобиомодуляцией. Методы фотостимуляции делятся на две основные категории: один набор методов использует свет для освобождения соединения, которое затем становится биохимически активным, связываясь с нисходящим эффектором. Например, освобождение глутамата полезно для выявления возбуждающих связей между нейронами, поскольку освобожденный глутамат имитирует естественную синаптическую активность одного нейрона, воздействующего на другой. Другой основной метод фотостимуляции – использование света для активации светочувствительного белка, такого как родопсин, который затем может возбуждать клетку, экспрессирующую опсин. Ученые давно постулировали необходимость контролировать один тип клеток, не затрагивая и не стимулируя окружающие их клетки. Хорошо известные научные достижения, такие как использование электрических стимулов и электродов, добились успеха в нейронной активации, но не достигли вышеупомянутой цели из-за их неточности и неспособности различать различные типы клеток. Использование оптогенетики (искусственная активация клеток посредством световых стимулов) уникально в своей способности доставлять световые импульсы точно и своевременно. Оптогенетика в некоторой степени двунаправленна в своей способности контролировать нейроны. Каналы могут быть либо деполяризованы, либо гиперполяризованы в зависимости от длины волны света, воздействующего на них. Например, этот метод может быть применен к катионным каналам родопсина для инициирования деполяризации нейронов и, в конечном итоге, активации при освещении. И наоборот, ингибирование активности нейрона может быть вызвано с помощью оптогенетики, как в случае хлоридного насоса галородопсина, который функционирует для гиперполяризации нейронов. Было показано, что канальный родопсин 2, монолитный белок, содержащий световой сенсор и катионный канал, обеспечивает электрическую стимуляцию достаточной скорости и величины для активации нейронного спайка. Недавно фотоингибирование, ингибирование нейронной активности светом, стало возможным благодаря применению таких молекул, как светоактивированный хлоридный насос галородопсин для нейронного контроля. Вместе, активированный синим светом канальный родопсин 2 и активированный желтым светом хлоридный насос галородопсин позволяют осуществлять многоцветную оптическую активацию и подавление нервной активности. (См. также Фотобиомодуляция)

Photostimulation is the use of light to artificially activate biological compounds, cells, tissues, or even whole organisms. Photostimulation can be used to noninvasively probe various relationships between different biological processes, using only light. In the long run, photostimulation has the potential for use in different types of therapy, such as migraine headache. Additionally, photostimulation may be used for the mapping of neuronal connections between different areas of the brain by “uncaging” signaling biomolecules with light. Therapy with photostimulation has been called light therapy, phototherapy, or photobiomodulation. Photostimulation methods fall into two general categories: one set of methods uses light to uncage a compound that then becomes biochemically active, binding to a downstream effector. For example, uncaging glutamate is useful for finding excitatory connections between neurons, since the uncaged glutamate mimics the natural synaptic activity of one neuron impinging upon another. The other major photostimulation method is the use of light to activate a light sensitive protein such as rhodopsin, which can then excite the cell expressing the opsin. Scientists have long postulated the need to control one type of cell while leaving those surrounding it untouched and unstimulated. Well known scientific advancements such as the use of electrical stimuli and electrodes have succeeded in neural activation but fail to achieve the aforementioned goal because of their imprecision and inability to distinguish between different cell types. The use of optogenetics (artificial cell activation via the use of light stimuli) is unique in its ability to deliver light pulses in a precise and timely fashion. Optogenetics is somewhat bidirectional in its ability to control neurons. Channels can be either depolarized or hyperpolarized depending on the wavelength of light that targets them. For instance, the technique can be applied to channelrhodopsin cation channels to initiate neuronal depolarization and eventually activation upon illumination. Conversely, activity inhibition of a neuron can be triggered via the use of optogenetics as in the case of the chloride pump halorhodopsin which functions to hyperpolarize neurons. It has been shown that channelrhodopsin 2, a monolithic protein containing a light sensor and a cation channel, provides electrical stimulation of appropriate speed and magnitude to activate neuronal spike firing. Recently, photoinhibition, the inhibition of neural activity with light, has become feasible with the application of molecules such as the light activated chloride pump halorhodopsin to neural control. Together, blue light activated channelrhodopsin 2 and the yellow light activated chloride pump halorhodopsin enable multiple color, optical activation and silencing of neural activity. (See also Photobiomodulation)

Методы

Белок в клетке – это белок, который активируется в присутствии стимулирующего источника света. В большинстве случаев, фоторазблокировка – это техника, высвобождающая активную область соединения посредством фотолиза экранирующей молекулы (cage). Однако, для разблокировки белка требуются подходящая длина волны, интенсивность и время воздействия света. Достижение этого возможно благодаря модификации оптического волокна для доставки определенных количеств света. Кроме того, короткие импульсы стимуляции позволяют получить результаты, близкие к физиологическим. Этапы фотостимуляции не зависят от времени, поскольку доставка белка и световая активация могут выполняться в разное время. Это обусловлено тем, что оба этапа взаимозависимы для активации белка. Некоторые белки изначально светочувствительны и функционируют в присутствии света. Белки, известные как опсины, составляют основу светочувствительных белков. Эти белки часто встречаются в глазу. Кроме того, многие из них функционируют как ионные каналы и рецепторы. Например, при воздействии определенной длины волны света на определенные каналы, блокада в порах снимается, обеспечивая ионный транспорт. Для разблокировки молекул необходима фотолизная система, способная расщепить ковалентную связь. Пример такой системы может состоять из источника света (обычно лазера или лампы), регулятора количества поступающего света, световода и системы доставки. Часто конструкция предусматривает баланс между рассеянным светом, который может вызвать дополнительный, нежелательный фотолиз, и затуханием света – обе эти проблемы существенны для фотолизной системы. Термин “клетка” был введен Дж. Ф. Хоффманом в 1978 году. К сожалению, этот термин вызвал некоторую путаницу среди ученых, поскольку он часто используется для описания молекулы, заключенной в другую молекулу. Его также можно спутать с “эффектом клетки” при рекомбинации радикалов. Поэтому некоторые авторы предпочли использовать термин “светоактивированный” вместо “клетка”. В настоящее время используются оба термина. Первой “молекулой в клетке”, синтезированной Хоффманом и др. в Йельском университете, был заключенный предшественник производного АТФ 1.

A caged protein is a protein that is activated in the presence of a stimulating light source. In most cases, photo uncaging is the technique revealing the active region of a compound by the process of photolysis of the shielding molecule (‘cage’). However, uncaging the protein requires an appropriate wavelength, intensity, and timing of the light. Achieving this is possible due to the fact that the optical fiber may be modified to deliver specific amounts of light. In addition, short bursts of stimulation allow results similar to the physiological norm. The steps of photostimulation are time independent in that protein delivery and light activation can be done at different times. This is because the two steps are dependent on each other for activation of the protein. Some proteins are innately photosensitive and function in the presence of light. Proteins known as opsins form the crux of the photosensitive proteins. These proteins are often found in the eye. In addition, many of these proteins function as ion channels and receptors. One example is when a certain wavelength of light is put onto certain channels, the blockage in the pore is relieved and allows ion transduction. To uncage molecules, a photolysis system is required to cleave the covalent bond. An example system can consist of a light source (generally a laser or a lamp), a controller for the amount of light that enters, a guide for the light, and a delivery system. Often, the design function in such a way that a medium is met between the diffusing light that may cause additional, unwanted photolysis and light attenuation; both being significant problems with a photolysis system. In 1978, J. F. Hoffman invented the term “caging”. Unfortunately, this term caused some confusion among scientists due to the fact that the term is often used to describe a molecule which is trapped within another molecule. It could also be confused with the “caged effect” in the recombination of radicals. Therefore, some authors decided to use the term “light activated” instead of “caging”. Both terms are currently in use. The first “caged molecule” synthesized by Hoffman et al. at Yale was the caged precursor to ATP derivative 1.

Приложения

Фотостимуляция отличается высокой временной точностью, которую можно использовать для точного определения момента начала активации заключенных в клетку эффекторов. В сочетании с заключенными в клетку ингибиторами можно изучать роль биомолекул в конкретные моменты жизненного цикла организма. Для изучения временной зависимости NSF использовался заключенный в клетку ингибитор N-этилмалеимид-чувствительного белка слияния (NSF) – ключевого медиатора синаптической передачи. В ряде других исследований достигалось возбуждение потенциалов действия с использованием заключенных в клетку нейротрансмиттеров, таких как глутамат. Заключенные в клетку нейротрансмиттеры, включая фотолабильные прекурсоры глутамата, дофамина, серотонина и ГАМК, доступны в продаже. Сигнализация во время митоза изучалась с использованием репортерных молекул с заключенным в клетку флуорофором, который не фосфорилируется, если фотолиз не произошел. Преимущество этой техники заключается в том, что она предоставляет «снимок» активности киназы в определенные моменты времени, а не регистрирует всю активность с момента введения репортера. Ионы кальция играют важную роль в передаче сигналов, и контроль их высвобождения с помощью заключенных в клетку каналов широко изучался. К сожалению, не все организмы производят или содержат достаточное количество опсинов. Таким образом, ген опсина необходимо вводить в целевые нейроны, если они еще не присутствуют в исследуемом организме. Добавление и экспрессия этого гена достаточны для использования оптогенетики. Возможные способы достижения этого включают создание трансгенных линий, содержащих ген, или острую передачу гена в определенную область или регион внутри организма. Эти методы известны как трансгенез зародышевой линии и доставка генов в соматические клетки соответственно. Оптогенетика продемонстрировала значительный потенциал в лечении ряда неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона и эпилепсия. Оптогенетика способна облегчить манипулирование и нацеливание на конкретные типы клеток или нейронные цепи, что является недоступным для современных методов стимуляции мозга, таких как DBS. На данный момент практическое применение оптогенетики в лечении нейродегенеративных заболеваний ограничено областью нейробиологии и направлено на более глубокое понимание механизмов конкретных расстройств. Прежде чем эту технику можно будет применять для непосредственного лечения этих расстройств, необходимы разработки в смежных областях, таких как генная терапия, опсин-инженерия и оптоэлектроника.

Photostimulation is notable for its temporal precision, which may be used to obtain an accurate starting time of activation of caged effectors. In conjunction with caged inhibitors, the role of biomolecules at specific timepoints in an organism's lifecycle may be studied. A caged inhibitor of N ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF), a key mediator of synaptic transmission, has been used to study the time dependency of NSF. Several other studies have effected action potential firing through use of caged neurotransmitters such as glutamate. Caged neurotransmitters, including photolable precursors of glutamate, dopamine, serotonin, and GABA, are commercially available. Signaling during mitosis has been studied using reporter molecules with a caged fluorophore, which is not phosphorylated if photolysis has not occurred. The advantage of this technique is that it provides a “snapshot” of kinase activity at specific timepoints rather than recording all activity since the reporter's introduction. Calcium ions play an important signaling role, and controlling their release with caged channels has been extensively studied. Unfortunately, not all organisms produce or hold sufficient amounts of opsins. Thus, the opsin gene must be introduced to target neurons if they are not already present in the organism of study. The addition and expression of this gene is sufficient for the use of optogenetics. Possible means of achieving this include the construction of transgenic lines containing the gene or acute gene transfer to a specific area or region within an individual. These methods are known as germline transgenesis and somatic gene delivery, respectively. Optogenetics has shown significant promise in the treatment of a series of neurological disorders such as Parkinson's disease and epilepsy. Optogenetics has the potential to facilitate the manipulation and targeting of specific cell types or neural circuits, characteristics that are lacking in current brain stimulation techniques like DBS. At this point, the use of optogenetics in treating neural diseases has only been practically implemented in the field of neurobiology to reveal more about the mechanisms of specific disorders. Before the technique can be implemented to directly treat these disorders developments in other related fields such as gene therapy, opsin engineering, and optoelectronics must also make certain developments.