Микродиализ: метод забора биологических жидкостей.

Введение

Метод отбора проб биологических жидкостей

Микродиализ – это минимально инвазивный метод отбора проб, используемый для непрерывного измерения концентраций свободных, несвязанных аналитов во внеклеточной жидкости практически любой ткани. Аналиты могут включать эндогенные молекулы (например, нейротрансмиттеры, гормоны, глюкозу и т. д.) для оценки их биохимических функций в организме, или экзогенные соединения (например, фармацевтические препараты) для определения их распределения в организме. Метод микродиализа требует введения небольшого микродиализного катетера (также называемого микродиализным зондом) в ткань, представляющую интерес. Микродиализный зонд имитирует кровяной капилляр и состоит из стержня с полупроницаемой полой волокнистой мембраной на конце, которая соединена с входной и выходной трубками. Зонд непрерывно перфузируется водным раствором (перфузатом), который близко соответствует (ионному) составу окружающей тканевой жидкости при низкой скорости потока, приблизительно 0,1–5 мкл/мин. После введения в ткань или (биологическую) жидкость, представляющую интерес, небольшие растворенные вещества могут пересекать полупроницаемую мембрану путем пассивной диффузии. Направление потока аналита определяется соответствующим градиентом концентрации, что позволяет использовать микродиализные зонды как для отбора проб, так и для доставки веществ. Диализные мешки имплантировались в ткани животных, особенно в мозг грызунов, для непосредственного изучения биохимии тканей. Дальнейшее усовершенствование концепции диалитрода привело к изобретению «полого волокна» – трубчатой полупроницаемой мембраны диаметром ~200–300 мкм в 1974 году. Наиболее распространенная форма на сегодняшний день – игольчатый зонд, состоящий из стержня с полым волокном на конце, который можно вводить с помощью направляющей канюли в мозг и другие ткани. Альтернативный метод – микроперфузия с открытым потоком (OFM) – заменяет мембрану макроскопическими отверстиями, что облегчает отбор проб липофильных и гидрофильных соединений, лекарств, связанных с белками и не связанных с ними, нейротрансмиттеров, пептидов и белков, антител, наночастиц и наноносителей, ферментов и везикул.

Microdialysis is a minimally invasive sampling technique that is used for continuous measurement of free, unbound analyte concentrations in the extracellular fluid of virtually any tissue. Analytes may include endogenous molecules (e. g. neurotransmitter, hormones, glucose, etc.) to assess their biochemical functions in the body, or exogenous compounds (e. g. pharmaceuticals) to determine their distribution within the body. The microdialysis technique requires the insertion of a small microdialysis catheter (also referred to as microdialysis probe) into the tissue of interest. The microdialysis probe is designed to mimic a blood capillary and consists of a shaft with a semipermeable hollow fiber membrane at its tip, which is connected to inlet and outlet tubing. The probe is continuously perfused with an aqueous solution (perfusate) that closely resembles the (ionic) composition of the surrounding tissue fluid at a low flow rate of approximately 0.1 5μL/min. Once inserted into the tissue or (body)fluid of interest, small solutes can cross the semipermeable membrane by passive diffusion. The direction of the analyte flow is determined by the respective concentration gradient and allows the usage of microdialysis probes as sampling as well as delivery tools. and dialysis sacs were implanted into animal tissues, especially into rodent brains, to directly study the tissues' biochemistry. Further improvement of the dialytrode concept resulted in the invention of the "hollow fiber", a tubular semipermeable membrane with a diameter of ~200 300μm, in 1974. Today's most prevalent shape, the needle probe, consists of a shaft with a hollow fiber at its tip and can be inserted by means of a guide cannula into the brain and other tissues. An alternative method, open flow micro perfusion (OFM), replaces the membrane with macroscopic openings which facilitates sampling of lipophilic and hydrophilic compounds, protein bound and unbound drugs, neurotransmitters, peptides and proteins, antibodies, nanoparticles and nanocarriers, enzymes and vesicles.

Пробы микродиализа

Существует широкий выбор зондов с различными комбинациями длины мембраны и штока. Предельный уровень отсечки по молекулярной массе коммерчески доступных микродиализных зондов охватывает широкий диапазон, примерно от 6 кД до 100 кД, но также доступен 1 МД. В то время как водорастворимые соединения обычно свободно диффундируют через мембрану микродиализа, ситуация менее ясна для высоколипофильных аналитов, для которых сообщалось как об успешных (например, кортикостероиды), так и о неуспешных экспериментах по микродиализу (например, эстрадиол, фузидовая кислота). Однако, выход водорастворимых соединений обычно быстро снижается, если молекулярная масса аналита превышает 25% от предельного уровня отсечки по молекулярной массе мембраны.

Методы восстановления и калибровки

Из-за постоянной перфузии микродиализного зонда свежим перфузатом установить полное равновесие невозможно. Восстановление можно определить в стационарном состоянии, используя постоянную скорость обмена аналита через мембрану микродиализа. Скорость обмена аналита через полупроницаемую мембрану обычно выражается как эффективность извлечения аналита. Эффективность извлечения определяется как отношение между потерей/приобретением аналита при его прохождении через зонд (Cin−Cout) и разностью концентраций между перфузатом и удаленной точкой отбора проб (Cin−Csample). Теоретически, эффективность извлечения микродиализного зонда может быть определена путем: 1) изменения концентрации лекарственного вещества при постоянном расходе или 2) изменения расхода при постоянных концентрациях лекарственного вещества. В стационарном состоянии получается одинаковое значение эффективности извлечения, независимо от того, обогащен или обеднен аналит в перфузате. Существуют динамический (расширенный) метод нулевого чистого потока и метод ретродиализа. Правильный выбор подходящего метода калибровки критически важен для успешного проведения эксперимента микродиализа. Поэтому рекомендуется проведение вспомогательных экспериментов in vitro перед использованием на животных или людях. Сегодня область применения расширилась до мониторинга свободных концентраций эндогенных и экзогенных соединений практически в любой ткани. Хотя микродиализ по-прежнему в основном используется в доклинических исследованиях на животных (например, лабораторных грызунах, собаках, овцах, свиньях), он все чаще применяется у людей для мониторинга свободных, несвязанных концентраций лекарственных веществ в тканях, а также интерстициальных концентраций регуляторных цитокинов и метаболитов в ответ на гомеостатические нарушения, такие как прием пищи и/или физические упражнения. При использовании в исследованиях мозга микродиализ обычно используется для измерения нейротрансмиттеров (например, дофамина, серотонина, норадреналина, ацетилхолина, глутамата, ГАМК) и их метаболитов, а также небольших нейромодуляторов (например, цАМФ, цГМФ, NO), аминокислот (например, глицина, цистеина, тирозина) и энергетических субстратов (например, глюкозы, лактата, пирувата). К экзогенным препаратам, которые анализируются с помощью микродиализа, относятся новые антидепрессанты, антипсихотики, а также антибиотики и многие другие препараты, место фармакологического действия которых находится в мозге. Первым неметаболитом, проанализированным микродиализом in vivo в мозге человека, был рифампицин. Области применения в других органах включают кожу (оценка биодоступности и биоэквивалентности дерматологических лекарственных средств для местного применения) и мониторинг концентрации глюкозы у пациентов с диабетом (внутрисосудистое или подкожное введение зонда). Последнее может быть даже включено в систему искусственной поджелудочной железы для автоматического введения инсулина. Микродиализ также находит все большее применение в экологических исследованиях, позволяя отбирать образцы различных соединений из сточных вод и почвенных растворов, включая сахара, ионы металлов, микроэлементы, органические кислоты и азот с низкой молекулярной массой. Учитывая деструктивный характер традиционных методов отбора проб почвы, микродиализ может быть использован для оценки потоков ионов почвы, которые лучше отражают невозмущенную почвенную среду.

Due to the constant perfusion of the microdialysis probe with fresh perfusate, a total equilibrium cannot be established. The recovery can be determined at steady state using the constant rate of analyte exchange across the microdialysis membrane. The rate at which an analyte is exchanged across the semipermeable membrane is generally expressed as the analyte’s extraction efficiency. The extraction efficiency is defined as the ratio between the loss/gain of analyte during its passage through the probe (Cin−Cout) and the difference in concentration between perfusate and distant sampling site (Cin−Csample). In theory, the extraction efficiency of a microdialysis probe can be determined by: 1) changing the drug concentrations while keeping the flow rate constant or 2) changing the flow rate while keeping the respective drug concentrations constant. At steady state, the same extraction efficiency value is obtained, no matter if the analyte is enriched or depleted in the perfusate. the dynamic (extended) no net flux method, and the retrodialysis method. The proper selection of an appropriate calibration method is critically important for the success of a microdialysis experiment. Supportive in vitro experiments prior to the use in animals or humans are therefore recommended. Today's area of application has expanded to monitoring free concentrations of endogenous as well as exogenous compounds in virtually any tissue. Although microdialysis is still primarily used in preclinical animal studies (e. g. laboratory rodents, dogs, sheep, pigs), it is now increasingly employed in humans to monitor free, unbound drug tissue concentrations as well as interstitial concentrations of regulatory cytokines and metabolites in response to homeostatic perturbations such as feeding and/or exercise. When employed in brain research, microdialysis is commonly used to measure neurotransmitters (e. g. dopamine, serotonin, norepinephrine, acetylcholine, glutamate, GABA) and their metabolites, as well as small neuromodulators (e. g. cAMP, cGMP, NO), amino acids (e. g. glycine, cysteine, tyrosine), and energy substrates (e. g. glucose, lactate, pyruvate). Exogenous drugs to be analyzed by microdialysis include new antidepressants, antipsychotics, as well as antibiotics and many other drugs that have their pharmacological effect site in the brain. The first non metabolite to be analyzed by microdialysis in vivo in the human brain was rifampicin. Applications in other organs include the skin (assessment of bioavailability and bioequivalence of topically applied dermatological drug products), and monitoring of glucose concentrations in patients with diabetes (intravascular or subcutaneous probe placement). The latter may even be incorporated into an artificial pancreas system for automated insulin administration. Microdialysis has also found increasing application in environmental research, sampling a diversity of compounds from waste water and soil solution, including saccharides, metal ions, micronutrients, organic acids, and low molecular weight nitrogen. Given the destructive nature of conventional soil sampling methods, microdialysis has potential to estimate fluxes of soil ions that better reflect an undisturbed soil environment.

Преимущества

На сегодняшний день микродиализ является единственной методикой отбора проб in vivo, позволяющей непрерывно контролировать концентрацию лекарственных средств или метаболитов во внеклеточной жидкости практически любой ткани. В зависимости от конкретной задачи, концентрации анализируемых веществ могут контролироваться в течение нескольких часов, дней или даже недель. Концентрации свободных, несвязанных веществ во внеклеточной жидкости часто представляют особый интерес, поскольку они отражают фармакологически активные концентрации в месте действия или вблизи него. Комбинирование микродиализа с современными методами визуализации, такими как позитронно-эмиссионная томография, позволяет дополнительно определять внутриклеточные концентрации. Точное введение зонда в выбранную ткань также позволяет оценить градиенты концентрации во внеклеточном пространстве, обусловленные активностью транспортеров или другими факторами, например, различиями в перфузии. Поэтому микродиализ был предложен в качестве наиболее подходящей методики для изучения распределения веществ в тканях. Обмен аналита через полупроницаемую мембрану и постоянная замена жидкости для отбора проб свежим перфузатом предотвращают отток жидкости из места пробоотбора, что обеспечивает возможность отбора проб без потери жидкости. Следовательно, микродиализ можно использовать, не нарушая состояние ткани из-за локальной потери жидкости или артефактов давления, которые могут возникать при использовании других методов, таких как микроинъекции или перфузия "push-pull". Полупроницаемая мембрана предотвращает попадание клеток, клеточного детрита и белков в диализат. Благодаря отсутствию белков в диализате, предварительная очистка образца перед анализом не требуется, и не возникает опасений по поводу ферментативного разложения.

Ограничения

Несмотря на научный прогресс в уменьшении размера и повышении эффективности микродиализных зондов, инвазивный характер этой техники по-прежнему накладывает определенные практические и этические ограничения. Например, было показано, что имплантация микродиализного зонда может изменять морфологию тканей, приводя к нарушению микроциркуляции, скорости метаболизма или целостности физиологических барьеров, таких как гематоэнцефалический барьер. В то время как острые реакции на введение зонда, такие как травмы, связанные с имплантацией, требуют достаточного времени для восстановления, дополнительные факторы, такие как некроз и воспалительные реакции, также играют роль. Микродиализ имеет относительно низкое временное и пространственное разрешение по сравнению, например, с электрохимическими биосенсорами. Временное разрешение определяется продолжительностью интервалов отбора проб (обычно несколько минут), а пространственное разрешение – размерами зонда. Размер зонда может варьироваться в зависимости от области применения, составляя от нескольких миллиметров (при внутримозговом применении) до нескольких сантиметров (при подкожном применении) в длину и несколько сотен микрометров в диаметре. Применение метода микродиализа часто ограничено определением эффективности извлечения вещества зондом (recovery), особенно в экспериментах in vivo. Определение эффективности извлечения может быть трудоемким и потребовать дополнительных субъектов или предварительных экспериментов. Эффективность извлечения в значительной степени зависит от скорости потока: чем ниже скорость потока, тем выше эффективность извлечения. Однако на практике скорость потока нельзя снижать слишком сильно, поскольку либо объем образца, полученного для анализа, окажется недостаточным, либо будет потеряно временное разрешение эксперимента. Поэтому важно оптимизировать соотношение между скоростью потока и чувствительностью аналитического метода. Ситуация может быть более сложной для липофильных соединений, поскольку они могут прилипать к трубкам или другим компонентам зонда, что приводит к низкой или нулевой эффективности извлечения аналита.