Тіндік сұйықтықтың микродиализі: сынама алу әдісі

Кіріспе

Биологиялық сұйықтықтан сынама алу әдісі

Микродиализ – кез келген тіндердің клеткадан тыс сұйықтығында еркін, байланыспаған аналиттердің концентрациясын үздіксіз өлшеуге қолданылатын минималды инвазивті сынама алу әдісі. Аналиттерге эндогенді молекулалар (мысалы, нейротрансмиттерлер, гормондар, глюкоза және т.б.) организмдегі биохимиялық функцияларын бағалау үшін, немесе экзогенді қосылыстар (мысалы, фармацевтикалық препараттар) олардың организмде таралуын анықтау үшін кіруі мүмкін. Микродиализ әдісі үшін микродиализ катетері (немесе микродиализ зонды) қажетті тіндерге енгізілуі қажет. Микродиализ зонды қан капиллярын имитациялауға арналған және оның ұшында кіріс және шығыс түтікшелеріне қосылған жартылай өткізгіш қуыс талшықты мембранасы бар білік орналасқан. Зондқа айналадағы тіндер сұйықтығының (иондық) құрамына ұқсас сулы ерітінді (перфузат) 0,1-5 мкл/мин төмен жылдамдықпен үздіксіз беріледі. Зонд қажетті тіндерге немесе (дене) сұйықтығына енгізілгеннен кейін, кішкентай молекулалар жартылай өткізгіш мембрана арқылы пассивті диффузиямен өте алады. Аналит ағынының бағыты тиісті концентрация градиентімен анықталады және микродиализ зондарын сынама алу және жеткізу құралдары ретінде пайдалануға мүмкіндік береді. Жануарлар тіндеріне, әсіресе кеміргіштердің миына, тіндердің биохимиясын тікелей зерттеу үшін диализ қаптары имплантацияланды. Диалитрод тұжырымын одан әрі жетілдіру 1974 жылы диаметрі ~200-300 мкм болатын түтікшелі жартылай өткізгіш мембрана – «бос талшық» ойлап табуға әкелді. Бүгінгі таңда ең көп қолданылатын форма – инелі зонд, оның ұшында қуыс талшық орналасқан және оны жетекші канюла арқылы миға және басқа тіндерге енгізуге болады. Ашық ағынды микроперфузия (OFM) деп аталатын баламалы әдіс, липофильді және гидрофильді қосылыстар, ақуызға байланысқан және байланыспаған дәрілер, нейротрансмиттерлер, пептидтер мен ақуыздар, антиденелер, нанобөлшектер мен нанотасымалдаушылар, ферменттер және везикулалардың сынамаларын алуды жеңілдететін макроскопиялық ашылулармен мембрананы алмастырады.

Microdialysis is a minimally invasive sampling technique that is used for continuous measurement of free, unbound analyte concentrations in the extracellular fluid of virtually any tissue. Analytes may include endogenous molecules (e. g. neurotransmitter, hormones, glucose, etc.) to assess their biochemical functions in the body, or exogenous compounds (e. g. pharmaceuticals) to determine their distribution within the body. The microdialysis technique requires the insertion of a small microdialysis catheter (also referred to as microdialysis probe) into the tissue of interest. The microdialysis probe is designed to mimic a blood capillary and consists of a shaft with a semipermeable hollow fiber membrane at its tip, which is connected to inlet and outlet tubing. The probe is continuously perfused with an aqueous solution (perfusate) that closely resembles the (ionic) composition of the surrounding tissue fluid at a low flow rate of approximately 0.1 5μL/min. Once inserted into the tissue or (body)fluid of interest, small solutes can cross the semipermeable membrane by passive diffusion. The direction of the analyte flow is determined by the respective concentration gradient and allows the usage of microdialysis probes as sampling as well as delivery tools. and dialysis sacs were implanted into animal tissues, especially into rodent brains, to directly study the tissues' biochemistry. Further improvement of the dialytrode concept resulted in the invention of the "hollow fiber", a tubular semipermeable membrane with a diameter of ~200 300μm, in 1974. Today's most prevalent shape, the needle probe, consists of a shaft with a hollow fiber at its tip and can be inserted by means of a guide cannula into the brain and other tissues. An alternative method, open flow micro perfusion (OFM), replaces the membrane with macroscopic openings which facilitates sampling of lipophilic and hydrophilic compounds, protein bound and unbound drugs, neurotransmitters, peptides and proteins, antibodies, nanoparticles and nanocarriers, enzymes and vesicles.

Микродиализ зондтары

Мембрана мен білік ұзындығының әртүрлі комбинациялары бар сондалар қолжетімді. Саудадағы микродиализ зондтарының молекулалық салмағының шегі шамамен 6 100 кД-ға дейін, ал кейбіреулері 1 МД-ға дейін жетеді. Суда еритін заттар микродиализ мембранасы арқылы еркін диффузияланады, бірақ жоғары липофильді аналиттер үшін жағдай осылай емес, сәтті (мысалы, кортикостероидтар) және сәтсіз (мысалы, эстрадиол, фузид қышқылы) микродиализ тәжірибелері туралы хабарламалар бар. Дегенмен, суда еритін заттардың қалпына келтірілуі, аналиттің молекулалық салмағы мембрананың молекулалық салмағы шегінің 25% -ын асып кеткен жағдайда әдетте тез төмендейді.

Қайта қалпына келтіру және калибрлеу әдістері

Микродиализ зондының жаңадан құйылған перфузатпен үнемі шаюына байланысты толық тепе-теңдік орнату мүмкін емес. Қалпына келтіруді тұрақты күйде микродиализ мембранасы арқылы аналит алмасуының тұрақты жылдамдығын пайдалану арқылы анықтауға болады. Аналиттың жартылай өткізгіш мембрана арқылы алмасу жылдамдығы әдетте аналиттің экстракция тиімділігі ретінде көрсетіледі. Экстракция тиімділігі – зонд арқылы өту кезінде аналиттің жоғалуы/пайда болуы арасындағы қатынас (Cin−Cout) және перфузат пен алыс сынама алу орны арасындағы концентрация айырмашылығы (Cin−Csample). Теориялық тұрғыдан алғанда, микродиализ зондының экстракция тиімділігін: 1) дәрілік заттардың концентрациясын өзгертіп, ағын жылдамдығын тұрақты ұстап немесе 2) дәрілік заттардың тиісті концентрациясын тұрақты ұстап, ағын жылдамдығын өзгерту арқылы анықтауға болады. Тұрақты күйде, аналит перфузатта байытылса немесе азайтылса да, бірдей экстракция тиімділігі алынады. Динамикалық (ұзартылған) таза ағынсыз әдіс және ретродиализ әдісі қолданылады. Микродиализ экспериментінің сәттілігі үшін тиісті калибрлеу әдісін дұрыс таңдау өте маңызды. Сондықтан жануарлар мен адамдарда қолданудан бұрын in vitro зерттеулер жүргізу ұсынылады. Қазіргі қолданылу саласы барлық тіндерде эндогенді және экзогенді қосылыстардың еркін концентрациясын бақылауға дейін кеңейді. Микродиализ әлі де негізінен жануарлармен жүргізілетін клиникалық зерттеулерде (мысалы, зертханалық кеміргіштер, иттер, қойлар, шошқалар) қолданылса да, қазір адамдарда дәрі-дәрмектің тіндеріндегі бос, байланыспаған концентрациясын, сондай-ақ тамақтану және/немесе жаттығу сияқты гомеостаздық өзгерістерге жауап ретінде реттеуші цитокиндер мен метаболиттердің интерстициалдық концентрациясын бақылау үшін жиірек қолданылады. Микродиализ ми зерттеулерінде нейротрансмиттерлерді (мысалы, допамин, серотонин, норадреналин, ацетилхолин, глутамат, ГАМК) және олардың метаболиттерін, сондай-ақ шағын нейромодуляторларды (мысалы, кАМП, кГМП, НО), аминоқышқылдарды (мысалы, глицин, цистеин, тирозин) және энергия субстраттарын (мысалы, глюкоза, лактат, пируват) өлшеу үшін жиі қолданылады. Микродиализ арқылы сарапталатын экзогендік дәрілерге жаңа антидепрессанттар, антипсихотиктер, сондай-ақ антибиотиктер және басқа да көптеген дәрілер кіреді, олардың фармакологиялық әсер ету орны мида. Адам миында микродиализ арқылы in vivo талданатын бірінші препарат – рифампицин. Басқа органдарда қолдану теріге (жергілікті түрде қолданылатын дерматологиялық препараттардың биожетімділігі мен биоэквиваленттілігін бағалау) және диабетпен ауыратын науқастарда глюкоза концентрациясын бақылау (интраваскулярлық немесе тері астындағы зондты орналастыру) жатады. Соңғысы тіпті инсулинді автоматты түрде енгізу үшін жасанды бүйрек безі жүйесіне енгізілуі мүмкін. Микродиализ экологиялық зерттеулерде де кеңінен қолданыла бастады, оның ішінде су және топырақтан алынған сахаридтер, металл иондар, микроэлементтер, органикалық қышқылдар және төмен молекулалық азот сияқты түрлі қосылыстар алынды. Топырақтан үлгі алудың дәстүрлі әдістерінің бұзушылығын ескере отырып, микродиализ топырақ иондарының ағынын бағалауға мүмкіндік береді, олар топырақтың бұзылмаған ортасын жақсырақ көрсетеді.

Due to the constant perfusion of the microdialysis probe with fresh perfusate, a total equilibrium cannot be established. The recovery can be determined at steady state using the constant rate of analyte exchange across the microdialysis membrane. The rate at which an analyte is exchanged across the semipermeable membrane is generally expressed as the analyte’s extraction efficiency. The extraction efficiency is defined as the ratio between the loss/gain of analyte during its passage through the probe (Cin−Cout) and the difference in concentration between perfusate and distant sampling site (Cin−Csample). In theory, the extraction efficiency of a microdialysis probe can be determined by: 1) changing the drug concentrations while keeping the flow rate constant or 2) changing the flow rate while keeping the respective drug concentrations constant. At steady state, the same extraction efficiency value is obtained, no matter if the analyte is enriched or depleted in the perfusate. the dynamic (extended) no net flux method, and the retrodialysis method. The proper selection of an appropriate calibration method is critically important for the success of a microdialysis experiment. Supportive in vitro experiments prior to the use in animals or humans are therefore recommended. Today's area of application has expanded to monitoring free concentrations of endogenous as well as exogenous compounds in virtually any tissue. Although microdialysis is still primarily used in preclinical animal studies (e. g. laboratory rodents, dogs, sheep, pigs), it is now increasingly employed in humans to monitor free, unbound drug tissue concentrations as well as interstitial concentrations of regulatory cytokines and metabolites in response to homeostatic perturbations such as feeding and/or exercise. When employed in brain research, microdialysis is commonly used to measure neurotransmitters (e. g. dopamine, serotonin, norepinephrine, acetylcholine, glutamate, GABA) and their metabolites, as well as small neuromodulators (e. g. cAMP, cGMP, NO), amino acids (e. g. glycine, cysteine, tyrosine), and energy substrates (e. g. glucose, lactate, pyruvate). Exogenous drugs to be analyzed by microdialysis include new antidepressants, antipsychotics, as well as antibiotics and many other drugs that have their pharmacological effect site in the brain. The first non metabolite to be analyzed by microdialysis in vivo in the human brain was rifampicin. Applications in other organs include the skin (assessment of bioavailability and bioequivalence of topically applied dermatological drug products), and monitoring of glucose concentrations in patients with diabetes (intravascular or subcutaneous probe placement). The latter may even be incorporated into an artificial pancreas system for automated insulin administration. Microdialysis has also found increasing application in environmental research, sampling a diversity of compounds from waste water and soil solution, including saccharides, metal ions, micronutrients, organic acids, and low molecular weight nitrogen. Given the destructive nature of conventional soil sampling methods, microdialysis has potential to estimate fluxes of soil ions that better reflect an undisturbed soil environment.

Артықшылықтар

Бүгінгі таңда микродиализ – кез келген тіндердің клеткадан тыс сұйықтығындағы дәрілік заттардың немесе метаболиттердің концентрациясын үздіксіз бақылауға мүмкіндік беретін жалғыз in vivo үлгі алу әдісі. Қолданылуына қарай, аналиттердің концентрациясы бірнеше сағат, күн немесе апталар бойы қадағалануы мүмкін. Көп жағдайда, бос, байланыспаған клеткадан тыс тіндердегі концентрациялар ерекше қызығушылық туғызады, себебі олар әсер ететін орындағы немесе оған жақын жердегі фармакологиялық белсенді концентрацияларға ұқсайды. Микродиализді қазіргі заманғы бейнелеу техникаларымен, мысалы, позитрондық эмиссиялық томографиямен үйлестіру, клеткаішілік концентрацияларды анықтауға мүмкіндік береді. Зондты таңдалған тіннің нақты орнына енгізу, транспортерлік белсенділік немесе перфузияның айырмашылығы сияқты факторларға байланысты клеткадан тыс концентрация градиенттерін бағалауға мүмкіндік береді. Сондықтан, бұл әдіс тіндердің таралуын зерттеу үшін ең тиімді техника ретінде ұсынылған. Аналиттің жартылай өткізгіш мембрана арқылы алмасуы және сынама алу сұйықтығын жаңа перфузатпен үнемі ауыстыру, сынама алу орнынан сұйықтықтың ағып кетуін болдырмайды, бұл сұйықтық жоғалтпай үлгі алуға мүмкіндік береді. Осылайша, микродиализ тіндердің жағдайын жергілікті сұйықтық жоғалту немесе қысым артефактілері арқылы бұзбайды, бұл микроинъекция немесе «push-pull» перфузиясы сияқты басқа әдістерді қолданғанда болуы мүмкін. Жартылай өткізгіш мембрана жасушалардың, жасуша қалдықтарының және ақуыздардың диализатқа енуіне кедергі келтіреді. Диализатта ақуыздың болмауына байланысты, талдау алдында тазалау қажет емес және ферменттік ыдырау туралы алаңдаудың қажеті жоқ.

Шектеулер

Микродиализ зондтарын кішірейту және тиімділігін арттырудағы ғылыми жетістіктерге қарамастан, осы техниканың инвазивті сипаты әлі де бірқатар практикалық және этикалық шектеулер тудырады. Мысалы, микродиализдік зондты имплантациялау тіндердің морфологиясын өзгерте алатыны көрсетілді, нәтижесінде микроциркуляция, метаболизм жылдамдығы немесе қан-ми тосқауылы сияқты физиологиялық кедергілердің тұтастығы бұзылуы мүмкін. Зондты енгізуге байланысты, мысалы имплантация салдарынан туындаған жедел реакциялар, жеткілікті қалпына келтіру уақытын қажет етеді, сондай-ақ некроз, қабыну реакциялары сияқты қосымша факторлар да әсер етеді. Микродиализ, мысалы электрохимиялық биосенсорлармен салыстырғанда, салыстырмалы түрде төмен уақыт және кеңістіктік ажыратымдылыққа ие. Уақыт ажыратымдылығы үлгі алу аралықтарының ұзақтығымен (әдетте бірнеше минут) анықталады, ал кеңістіктік ажыратымдылығы зондтың өлшемдерімен анықталады. Зондтың мөлшері қолданылатын салаға байланысты өзгеруі мүмкін және ұзындығы бірнеше миллиметрден (ми ішінде қолдану үшін) бірнеше сантиметрге дейін (тері астында қолдану үшін) және диаметрі бірнеше жүз микрометрге дейін жетеді. Микродиализ техникасын қолдану жиі, әсіресе in vivo эксперименттерде, зондтың қалпына келтіру деңгейін анықтаумен шектеледі. Қалпына келтіруді анықтау көп уақытты қажет етуі мүмкін және қосымша зерттеушілерді немесе алдын ала тәжірибелерді қажет етуі мүмкін. Қалпына келтіру деңгейі көбінесе ағын жылдамдығына байланысты: ағын жылдамдығы неғұрлым төмен болса, қалпына келтіру деңгейі соғұрлым жоғары болады. Дегенмен, тәжірибеде ағын жылдамдығын тым көп төмендетуге болмайды, өйткені талдау үшін алынған үлгінің көлемі жеткіліксіз болып қалуы немесе эксперименттің уақыт ажыратымдылығы жоғалуы мүмкін. Сондықтан ағын жылдамдығы мен аналитикалық әдістің сезімталдығы арасындағы қатынасты оңтайландыру маңызды. Липофильді қосылыстар үшін жағдай одан да күрделі болуы мүмкін, өйткені олар түтіктерге немесе зондтың басқа да бөліктеріне жабысып қалуы мүмкін, нәтижесінде аналиттың қалпына келтіру деңгейі төмен немесе мүлдем болмайды.