Введение

Семейство белковых комплексов транскрипционных факторов.

Ядерный фактор каппа B-клеток (NF κB) – это семейство белковых комплексов транскрипционных факторов, контролирующих транскрипцию ДНК, продукцию цитокинов и выживаемость клеток. NF κB обнаруживается почти во всех типах клеток животных и участвует в клеточных реакциях на такие стимулы, как стресс, цитокины, свободные радикалы, тяжелые металлы, ультрафиолетовое облучение, окисленный ЛПНП, а также бактериальные или вирусные антигены. NF κB играет ключевую роль в регуляции иммунного ответа на инфекцию. Нарушенная регуляция NF κB связана с раком, воспалительными и аутоиммунными заболеваниями, септическим шоком, вирусными инфекциями и нарушением развития иммунитета. NF κB также вовлечен в процессы синаптической пластичности и формирования памяти.

Открытие

NF κB был обнаружен Ранджаном Сеном в лаборатории нобелевского лауреата Дэвида Балтимора благодаря его взаимодействию с 11-парной последовательностью в энхансере легкой цепи иммуноглобулина в B-клетках. Последующие работы Александра Полторака и Бруно Лемейтра на мышах и плодовой мушке Drosophila показали, что Toll-подобные рецепторы являются универсально консервативными активаторами NF κB-сигнализации. Эти работы в конечном итоге привели к присуждению Нобелевской премии Брюсу Бютлеру и Жюлю А. Хоффману, которые были ведущими исследователями в этих исследованиях.

Структура

Все белки семейства NF κB содержат Rel-гомологический домен в N-конце. Подсемейство белков NF κB, включающее RelA, RelB и c-Rel, обладает трансактивационным доменом в C-конце. В отличие от этого, белки NF κB1 и NF κB2 синтезируются в виде крупных предшественников, p105 и p100, которые подвергаются процессингу с образованием зрелых субъединиц p50 и p52 соответственно. Процессинг p105 и p100 опосредован убиквитин-протеасомным путем и включает селективную деградацию их C-терминальной области, содержащей анкириновые повторы. В то время как образование p52 из p100 является строго регулируемым процессом, p50 образуется в результате конститутивного процессинга p105. Белки p50 и p52 не обладают собственной способностью активировать транскрипцию и поэтому предположительно действуют как транскрипционные репрессоры при связывании с κB-элементами в виде гомодимеров. Фактически, это затрудняет интерпретацию исследований нокаута по p105, где генетическая манипуляция удаляет IκB (p105 полной длины) и вероятный репрессор (гомодимеры p50) в дополнение к транскрипционному активатору (гетеродимер RelA p50).

Эффект активации

NF κB имеет решающее значение для регуляции клеточных реакций, поскольку относится к категории "быстродействующих" первичных факторов транскрипции, то есть факторов транскрипции, которые присутствуют в клетках в неактивном состоянии и не требуют нового синтеза белка для активации (другие члены этого семейства включают факторы транскрипции, такие как c Jun, STAT и ядерные гормональные рецепторы). Это позволяет NF κB быть первым реагирующим на вредные клеточные стимулы. Известные индукторы активности NF κB весьма разнообразны и включают в себя активные формы кислорода (ROS), фактор некроза опухоли альфа (TNFα), интерлейкин 1 бета (IL 1β), бактериальные липополисахариды (LPS), изопротеренол, кокаин, эндотелин 1 и ионизирующее излучение. Подавление NF κB цитотоксичности фактора некроза опухоли (апоптоза) обусловлено индукцией антиоксидантных ферментов и устойчивым подавлением c Jun N-концевых киназ (JNK). Активатор рецептора NF κB (RANK), являющийся типом TNFR, является центральным активатором NF κB. Остеопротегерин (OPG), который представляет собой гомологичный рецептор-приманку для лиганда RANK (RANKL), ингибирует RANK путем связывания с RANKL, и таким образом, остеопротегерин тесно вовлечен в регуляцию активации NF κB. Многие бактериальные продукты и стимуляция широкого спектра клеточных поверхностных рецепторов приводят к активации NF κB и относительно быстрым изменениям в экспрессии генов. TLR являются ключевыми регуляторами как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. В отличие от RelA, RelB и c Rel, субъединицы NF κB p50 и p52 не содержат доменов трансактивации в своих C-концевых участках. Тем не менее, p50 и p52 играют важную роль в модуляции специфичности функции NF κB. Хотя гомодимеры p50 и p52, как правило, являются репрессорами транскрипции κB-сайтов, и p50, и p52 участвуют в трансактивации генов-мишеней, формируя гетеродимеры с RelA, RelB или c Rel. Кроме того, гомодимеры p50 и p52 также связываются с ядерным белком Bcl 3, и такие комплексы могут функционировать как транскрипционные активаторы.

Ингибирование

В нестимулированных клетках димеры NF κB удерживаются в цитоплазме семейством ингибиторов, называемых IκB (ингибитор κB), которые представляют собой белки, содержащие несколько копий последовательности, называемой анкириновыми повторами. Благодаря своим анкириновым доменам, белки IκB маскируют сигналы ядерной локализации (NLS) белков NF κB и поддерживают их в неактивном состоянии в цитоплазме. IκB – это семейство родственных белков, имеющих N-концевой регуляторный домен, за которым следуют шесть или более анкириновых повторов и PEST-домен вблизи C-конца. Хотя семейство IκB состоит из IκBα, IκBβ, IκBε и Bcl 3, наиболее изученным и основным белком IκB является IκBα. Благодаря наличию анкириновых повторов в своих C-концевых половинах, p105 и p100 также функционируют как белки IκB. C-концевая половина p100, которую часто называют IκBδ, также выполняет функцию ингибитора. Деградация IκBδ в ответ на сигналы развития, такие как те, которые передаются через LTβR, усиливает активацию димера NF κB по NIK-зависимому неканоническому пути.

Процесс активации (канонический/классический)

Активация NF κB инициируется сигналом, индуцирующим деградацию белков IκB. Это происходит главным образом посредством активации киназы, называемой киназой IκB (IKK). IKK состоит из гетеродимера каталитических субъединиц IKKα и IKKβ и "главного" регуляторного белка, называемого NEMO (NF κB essential modulator) или IKKγ. При активации сигналами, обычно поступающими извне клетки, киназа IκB фосфорилирует два сериновых остатка, расположенных в регуляторном домене IκB. При фосфорилировании на этих серинах (например, серины 32 и 36 в человеческом IκBα), белки IκB модифицируются посредством процесса, называемого убиквитинированием, что затем приводит к их деградации клеточной структурой, называемой протеасомой. С деградацией IκB, комплекс NF κB освобождается для проникновения в ядро, где он может "включить" экспрессию специфических генов, имеющих сайты связывания ДНК для NF κB поблизости. Активация этих генов NF κB затем приводит к определенному физиологическому ответу, например, к воспалительному или иммунному ответу, ответу на выживание клеток или клеточной пролиферации. Транслокация NF κB в ядро может быть обнаружена иммуноцитохимически и измерена с помощью лазерной сканирующей цитометрии. NF κB активирует экспрессию собственного репрессора, IκBα. Новосинтезированный IκBα затем повторно ингибирует NF κB и, таким образом, формирует петлю ауторегуляции, что приводит к колебаниям уровня активности NF κB. Кроме того, несколько вирусов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), имеют сайты связывания для NF κB, который контролирует экспрессию вирусных генов, что, в свою очередь, способствует репликации вируса или его патогенности. В случае ВИЧ-1, активация NF κB может, по крайней мере частично, участвовать в активации вируса из латентного, неактивного состояния. YopP – это фактор, секретируемый бактерией Yersinia pestis, возбудителем чумы, который предотвращает убиквитинирование IκB. Это позволяет данному патогену эффективно ингибировать путь NF κB и, таким образом, блокировать иммунный ответ организма, инфицированного Yersinia.

Ингибиторы активности NF-κB

Что касается известных ингибиторов белка NF κB, один из них – IFRD1, который подавляет активность NF κB p65, усиливая дезацетилирование субъединицы p65 в лизине 310 посредством HDAC, и способствуя рекрутированию HDAC3 к p65. Фактически, IFRD1 формирует тримолекулярные комплексы с p65 и HDAC3. NAD-зависимая белковая деацетилаза и фактор долголетия SIRT1 ингибирует экспрессию генов NF κB, деацетилируя субъединицу RelA/p65 NF κB в лизине 310.

Неканонический/альтернативный путь

Выбранный набор клеточных дифференцирующих или стимулов развития, таких как рецептор лимфотоксина β (LTβR), BAFF или RANKL, активируют неканонический путь NF κB для индукции димера NF κB/RelB:p52 в ядре. В этом пути активация киназы, индуцирующей NF κB (NIK), при лигации рецептора приводит к фосфорилированию и последующей протеасомной обработке белка-прекурсора NF κB2 p100 в зрелую субъединицу p52 в зависимости от IKK1/IKKa. Затем p52 димеризируется с RelB, образуя ядерную ДНК-связывающую активность RelB:p52. RelB:p52 регулирует экспрессию гомеостатических лимфокинов, которые направляют органогенез лимфоидных органов и трафик лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. В отличие от канонической сигнализации, основанной на деградации IκBα, β, ε, опосредованной NEMO IKK2, неканоническая сигнализация зависит от NIK-опосредованной обработки p100 в p52. Учитывая их различные механизмы регуляции, эти два пути считались независимыми друг от друга. Однако было обнаружено, что синтез компонентов неканонического пути, а именно RelB и p52, контролируется канонической сигнализацией IKK2 IκB RelA:p50. Более того, генерация канонических и неканонических димеров, а именно RelA:p50 и RelB:p52, в клеточной среде механически взаимосвязана. Механически, TNF инактивировал NIK в клетках, стимулированных LTβR, и индуцировал синтез мРНК Nfkb2, кодирующей p100; вместе они эффективно накапливали необработанный p100, что ослабляло активность RelB. Роль p100/Nfkb2 в определении проникновения лимфоцитов в воспаленную лимфоидную ткань может иметь широкие физиологические последствия. Помимо своей традиционной роли в лимфоидном органогенезе, неканонический путь NF κB также напрямую усиливает воспалительные иммунные реакции на микробные патогены, модулируя каноническую сигнализацию NF κB. Было показано, что p100/Nfkb2 опосредует стимул-специфическое и клеточно-специфическое взаимодействие между двумя путями NF κB, и что кросс-талок, опосредованный Nfkb2, защищает мышей от кишечных патогенов. С другой стороны, отсутствие регуляции, опосредованной p100, переводит RelB под контроль канонической сигнализации, индуцированной TNF. Фактически, мутационная инактивация p100/Nfkb2 при множественной миеломе позволила TNF индуцировать длительную активность RelB, что придало устойчивость клеткам миеломы к химиотерапевтическому препарату.

В иммунитете

NF κB — основной фактор транскрипции, регулирующий гены, ответственные как за врожденный, так и за адаптивный иммунный ответ. При активации Т- или В-клеточного рецептора NF κB активируется посредством различных сигнальных компонентов. При связывании с Т-клеточным рецептором рекрутируется протеинкиназа Lck, которая фосфорилирует ITAM цитоплазматического хвоста CD3. Затем ZAP70 рекрутируется к фосфорилированным ITAM и способствует рекрутированию LAT и PLC γ, что приводит к активации PKC. В результате каскада фосфорилирования активируется киназный комплекс, и NF κB получает возможность входить в ядро для повышения экспрессии генов, участвующих в развитии, созревании и пролиферации Т-клеток.

В нервной системе

В дополнение к роли в опосредовании выживания клеток, исследования Марка Маттсона и других показали, что NF κB выполняет разнообразные функции в нервной системе, включая участие в пластичности, обучении и памяти. Помимо стимулов, активирующих NF κB в других тканях, NF κB в нервной системе может быть активирована факторами роста (BDNF, NGF) и синаптической передачей, такой как глутамат, а также регулированием роста дендритов и дендритных шипов. Цитокины (TNF-альфа, TNFR) и киназы (PKAc) также участвуют в этом процессе. Несмотря на функциональные доказательства роли транскрипционных факторов семейства Rel в нервной системе, до сих пор неясно, отражают ли неврологические эффекты NF κB транскрипционную активацию в нейронах. Большинство манипуляций и анализов проводятся в смешанных клеточных средах, наблюдаемых in vivo, в "нейронных" клеточных культурах, содержащих значительное количество глии, или в опухолевых "нейронных" клеточных линиях. Когда трансфекции или другие манипуляции направлены специально на нейроны, измеряемые конечные точки обычно представляют собой электрофизиологические параметры или другие показатели, далекие от транскрипции генов. Тщательные исследования NF κB-зависимой транскрипции в высокоочищенных культурах нейронов обычно демонстрируют незначительную или отсутствующую активность NF κB. Некоторые сообщения об обнаружении NF κB в нейронах, по-видимому, являются артефактом неспецифичности антител. Разумеется, артефакты клеточной культуры, например, удаление нейронов из-под влияния глии, также могут приводить к ложным результатам. Однако этот вопрос был рассмотрен, по крайней мере, в двух подходах с использованием совместной культуры. Moerman и соавторы использовали формат кокультуры, в котором нейроны и глия могли быть разделены после обработки для анализа EMSA, и обнаружили, что NF κB, индуцированная глутаматергическими стимулами, ограничивалась глией (и, что интересно, только глией, находившейся в присутствии нейронов в течение 48 часов). Те же исследователи изучили этот вопрос другим способом, используя нейроны от трансгенной мыши-репортера NF κB, культивированные с глией дикого типа; глутаматергические стимулы снова не приводили к активации в нейронах. Некоторые данные об активности связывания ДНК, полученные при определенных условиях (особенно те, которые описываются как конститутивные), по-видимому, являются результатом связывания Sp3 и Sp4 с подмножеством κB-усиливающих последовательностей в нейронах. Эта активность фактически ингибируется глутаматом и другими условиями, повышающими внутринейронный уровень кальция. В конечном счете, роль NF κB в нейронах остается неясной из-за сложности измерения транскрипции в клетках, которые одновременно идентифицируются по типу. Безусловно, обучение и память могут подвергаться влиянию транскрипционных изменений в астроцитах и других глиальных элементах. И следует учитывать, что эффекты NF κB могут быть обусловлены механизмами, отличными от прямой трансактивации генов.

Раковые заболевания

NF κB широко используется эукариотическими клетками в качестве регулятора генов, контролирующих пролиферацию и выживание клеток. Соответственно, при многих типах опухолей человека наблюдается нарушение регуляции NF κB, то есть NF κB находится в конститутивно активном состоянии. Активный NF κB включает экспрессию генов, поддерживающих пролиферацию клеток и защищающих их от условий, которые в противном случае привели бы к гибели посредством апоптоза. При раке белки, контролирующие сигналинг NF κB, мутируют или аберрантно экспрессируются, что приводит к нарушению координации между злокачественной клеткой и остальным организмом. Это проявляется как в метастазировании, так и в неэффективном уничтожении опухоли иммунной системой. Нормальные клетки могут погибать при удалении из ткани, к которой они принадлежат, или когда их геном не может функционировать согласованно с функцией ткани: эти события зависят от обратной связи в регуляции NF κB, которая нарушается при раке. Дефекты в NF κB приводят к повышенной чувствительности к апоптозу и, как следствие, к увеличению гибели клеток. Это связано с тем, что NF κB регулирует антиапоптотические гены, особенно TRAF1 и TRAF2, и, следовательно, подавляет активность семейства ферментов каспаз, играющих центральную роль в большинстве апоптотических процессов. В опухолевых клетках активность NF κB повышена, например, в 41% случаев рака носоглотки, колоректального рака, рака предстательной железы и опухолей поджелудочной железы. Это может быть обусловлено мутациями в генах, кодирующих сами факторы транскрипции NF κB, или в генах, контролирующих активность NF κB (таких как гены IκB); кроме того, некоторые опухолевые клетки секретируют факторы, вызывающие активацию NF κB. Блокирование NF κB может привести к остановке пролиферации опухолевых клеток, их гибели или повышению чувствительности к противоопухолевым препаратам. Таким образом, NF κB является объектом активных исследований фармацевтических компаний в качестве мишени для противораковой терапии. Однако, несмотря на убедительные экспериментальные данные, подтверждающие критическую роль NF κB в развитии опухолей, что обосновывает разработку противоопухолевой терапии, основанной на подавлении активности NF κB, следует проявлять осторожность при рассмотрении анти-NF κB терапии в качестве широкой стратегии лечения рака, поскольку данные также показывают, что активность NF κB повышает чувствительность опухолевых клеток к апоптозу и сенесценции. Кроме того, было показано, что канонический NF κB является активатором транскрипции Fas, а альтернативный NF κB – репрессором транскрипции Fas. Следовательно, NF κB способствует апоптозу, опосредованному Fas, в раковых клетках, и, таким образом, ингибирование NF κB может подавлять апоптоз, опосредованный Fas, и ослаблять подавление опухоли иммунными клетками организма.

Воспаление

Поскольку NF κB контролирует множество генов, участвующих в воспалении, неудивительно, что NF κB обнаруживается хронически активным при многих воспалительных заболеваниях, таких как воспалительные заболевания кишечника, артрит, сепсис, гастрит, астма, атеросклероз и другие. Важно отметить, что повышение уровня некоторых активаторов NF κB, таких как остеопротегерин (OPG), связано с повышенной смертностью, особенно от сердечно-сосудистых заболеваний. Повышенная активность NF κB также ассоциируется с шизофренией. Недавно активация NF κB была предложена в качестве возможного молекулярного механизма катаболического действия табачного дыма на скелетные мышцы и саркопению. Исследования показали, что во время воспаления функция клетки зависит от сигналов, которые она активирует в ответ на контакт с соседними клетками и комбинации гормонов, особенно цитокинов, действующих на нее через специфические рецепторы. Фенотип клетки в ткани формируется посредством взаимной стимуляции сигналов обратной связи, координирующих ее функцию с другими клетками; это особенно заметно во время перепрограммирования функции клетки, когда ткань подвергается воспалению, поскольку клетки изменяют свой фенотип и постепенно экспрессируют комбинации генов, подготавливающих ткань к регенерации после устранения причины воспаления. Особое значение имеют сигналы обратной связи, возникающие между резидентными клетками ткани и циркулирующими клетками иммунной системы. Это приводит не только к аномальному функционированию раковых клеток: клетки окружающей ткани также изменяют свою функцию и перестают оказывать организму исключительную поддержку. Кроме того, различные типы клеток в микроокружении опухоли могут изменять свои фенотипы, способствуя росту рака. Таким образом, воспаление – это процесс, проверяющий надежность компонентов ткани, поскольку процесс, ведущий к регенерации ткани, требует координации экспрессии генов между различными типами клеток.

NEMO

Синдром дефицита NEMO — редкое генетическое заболевание, связанное с нарушением в гене IKBKG, что приводит к активации NF κB. В основном оно поражает мужчин и характеризуется широким спектром симптомов и прогнозов.

Как цель для наркотиков

Аберрантная активация NF κB часто наблюдается при многих видах рака. Кроме того, подавление NF κB ограничивает пролиферацию раковых клеток. NF κB также играет ключевую роль в воспалительной реакции. Следовательно, методы ингибирования сигнализации NF κB обладают потенциальным терапевтическим применением при раке и воспалительных заболеваниях. Как канонические, так и неканонические пути NF κB требуют протеасомальной деградации компонентов регуляторного пути для осуществления сигнализации NF κB. Ингибитор протеасомы бортезомиб широко блокирует эту активность и одобрен для лечения лимфомы мантийной клетки и множественной миеломы, обусловленных NF κB. Открытие того, что активация ядерной транслокации NF κB может быть отделена от повышения окислительного стресса, открывает перспективное направление для разработки стратегий, направленных на ингибирование NF κB. Препарат деносумаб повышает минеральную плотность костной ткани и снижает частоту переломов у многих подгрупп пациентов, ингибируя RANKL. RANKL действует через свой рецептор RANK, который, в свою очередь, стимулирует NF κB. Обычно RANKL обеспечивает дифференцировку остеокластов из моноцитов. Дисульфирам, ольмесартан и дитиокарбаматы способны ингибировать каскад сигнализации NF κB. Ведутся работы по разработке прямых ингибиторов NF κB с использованием таких соединений, как ( ) DHMEQ, PBS 1086, IT 603 и IT 901. ( ) DHMEQ и PBS 1086 являются необратимыми связывающими веществами для NF κB, в то время как IT 603 и IT 901 – обратимыми. DHMEQ ковалентно связывается с Cys 38 субъединицы p65. Утверждается, что противовоспалительные эффекты анатобина обусловлены модуляцией активности NF κB. Однако в исследованиях, демонстрирующих его эффективность, используются аномально высокие дозы в миллимолярном диапазоне (сопоставимые с внеклеточной концентрацией калия), которые вряд ли достижимы у человека. BAY 11 7082 также был идентифицирован как препарат, способный ингибировать каскад сигнализации NF κB. Он способен необратимо предотвращать фосфорилирование IKK α, что приводит к снижению регуляции активации NF κB. Показано, что введение BAY 11 7082 восстанавливает функцию почек у крыс Sprague Dawley с индуцированным диабетом, подавляя NF κB-регулируемый окислительный стресс. Исследования показали, что N-ацилэтаноламин, пальмитоилэтаноламид, способен к PPAR-опосредованному ингибированию NF κB. Биологическая мишень игуратимода, препарата, продаваемого для лечения ревматоидного артрита в Японии и Китае, оставалась неизвестной по состоянию на 2015 год, но основным механизмом действия, по-видимому, является предотвращение активации NF κB.