Введение

В биологии субкультура – это либо новая клеточная культура, либо микробиологическая культура, созданная путем переноса части или всех клеток из предыдущей культуры в свежую питательную среду. Эта процедура называется субкультивированием или пассированием клеток. Субкультивирование используется для продления жизнеспособности и/или увеличения числа клеток или микроорганизмов в культуре.

Роль

Линии клеток и микроорганизмы не могут находиться в культуре неограниченно долго из-за постепенного накопления метаболитов, которые могут быть токсичными, истощения питательных веществ в среде культивирования и увеличения числа клеток или размера популяции в результате роста. Когда питательные вещества истощаются, а уровень токсичных продуктов метаболизма повышается, микроорганизмы в культуре переходят в стационарную фазу, где пролиферация значительно замедляется или прекращается (наблюдается плато плотности клеток). При переносе микроорганизмов из этой культуры в свежую среду питательные вещества стимулируют их рост, который начинается с лаг-фазы – периода медленного роста и адаптации к новой среде, за которым следует лог-фаза – период экспоненциального роста. Лог-фазные микроорганизмы необходимы для проведения экспериментов (например, бактериальной трансформации). Обычно субкультивирование проводят из культуры определенного объема в свежую среду для роста того же объема, что позволяет поддерживать клеточную линию в течение длительного времени. Субкультивирование в больший объем среды роста используют, когда требуется увеличить количество клеток, например, для применения в промышленном процессе или научном эксперименте.

Номер прохода

Часто важно фиксировать приблизительное число делений клеток в культуре, подсчитывая количество пассажей или субкультур. В случае клеток растительных тканей сомаклональные вариации могут возникать при длительном культивировании. Аналогично, в клеточных линиях млекопитающих с течением времени наблюдается тенденция к увеличению числа хромосомных аберраций. Для микроорганизмов характерна адаптация к условиям культивирования, которые редко полностью соответствуют их естественной среде обитания, что может изменять их биологические свойства.

Протоколы пропуска

Протокол пересева клеток сильно зависит от свойств используемых клеток.

Клетка для суспензии

Многие типы клеток, в частности, многие микроорганизмы, растут в растворе, а не прикрепляясь к поверхности. Эти типы клеток можно пересевать, просто взяв небольшой объем исходной культуры и разбавив его в свежей питательной среде. Плотность клеток в таких культурах обычно измеряется в клетках на миллилитр для крупных эукариотических клеток или оптической плотностью при длине волны 600 нм для более мелких клеток, таких как бактерии. Для оптимального роста клетки часто имеют предпочтительный диапазон плотности, и при пересеве обычно стараются поддерживать клетки в этом диапазоне.

Клетки, прикрепленные к ней

Клетки, прикрепляющиеся к поверхности, например, многие клеточные линии млекопитающих, растут, прикрепляясь к поверхности, такой как дно колбы для клеточной культуры или чашки Петри. Эти типы клеток необходимо отделить от поверхности, прежде чем их можно будет пересеять. Для клеток, прикрепляющихся к поверхности, плотность клеток обычно измеряется в терминах конфлюентности – процента площади роста, покрытой клетками. Для оптимального роста клетки часто имеют определенный диапазон конфлюентности; например, клеточная линия млекопитающих, такая как HeLa, обычно предпочитает конфлюентность между 10% и 100%, и при пересеве обычно стараются поддерживать клетки в этом диапазоне. Для пересева клетки можно отделить одним из нескольких способов, включая обработку трипсином для разрушения белков, ответственных за прикрепление к поверхности, хелатирование ионов кальция с помощью EDTA, что нарушает некоторые механизмы белковой адгезии, или механические методы, такие как повторное промывание или использование клеточного скребка. Затем отделившиеся клетки ресуспендируют в свежей питательной среде и дают им осесть на поверхность роста.