Циклическая амплификация неправильно свернутых белков: диагностика и изучение прионных болезней.
Protein misfolding cyclic amplification
PMCA: усиление мисфолдинговых прионов для диагностики болезней, таких как CWD и BSE. Ультразвуковая амплификация для быстрого выявления прионных инфекций.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Противосплетающаяся циклическая амплификация белка (PMCA) – это метод амплификации (концептуально схожий с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), но не использующий нуклеотиды) для увеличения количества неправильно свернутых прионов, впервые разработанный Сото и его коллегами. Он используется в качестве теста для диагностики спонгиформных энцефалопатий, таких как хроническая изнуряющая болезнь (ХИБ) или губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (БСЭ).
Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an amplification technique (conceptually like polymerase chain reaction (PCR) but not involving nucleotides) to multiply misfolded prions originally developed by Soto and colleagues. It is a test for spongiform encephalopathies like chronic wasting disease (CWD) or bovine spongiform encephalopathy (BSE).
Техника
Вначале небольшое количество аномального приона инкубируется с избытком нормального белка, что приводит к частичному преобразованию. Затем растущую цепь неправильно свернутого белка подвергают воздействию ультразвука, разрушая её на более короткие цепи и тем самым быстро увеличивая количество аномального белка, способного вызывать дальнейшие преобразования. Повторяя этот цикл, большую массу нормального белка быстро превращают в тестируемый прион.
The technique initially incubates a small amount of abnormal prion with an excess of normal protein, so that some conversion takes place. The growing chain of misfolded protein is then blasted with ultrasound, breaking it down into smaller chains and so rapidly increasing the amount of abnormal protein available to cause conversions. By repeating the cycle, the mass of normal protein is rapidly changed into the prion being tested for.
Разработка
PMCA был изначально разработан для воспроизведения репликации прионов *in vitro* с эффективностью, сопоставимой с процессом *in vivo*, но с более высокой скоростью. Новообразованный белок демонстрирует те же биохимические, биологические и структурные свойства, что и PrPSc, выделенный из мозга, и, что примечательно, он заразен для диких животных, вызывая заболевание с характеристиками, аналогичными болезни, вызванной прионами, изолированными из мозга.
PMCA was originally developed to, in vitro, mimic prion replication with a similar efficiency to the in vivo process, but with accelerated kinetics. The newly generated protein exhibits the same biochemical, biological, and structural properties as brain derived PrPSc and strikingly it is infectious to wild type animals, producing a disease with similar characteristics as the illness produced by brain isolated prions.
Автоматизация
Технология была автоматизирована, что привело к значительному повышению эффективности амплификации. Теперь один цикл обеспечивает 2500-кратное увеличение чувствительности обнаружения по сравнению с вестерн-блоттингом.
The technology has been automated, leading to a dramatic increase in the efficiency of amplification. Now, a single cycle results in a 2500 fold increase in sensitivity of detection over western blotting,
Чувствительность
Было показано, что PMCA способен обнаруживать даже одну молекулу олигомерного инфекционного PrPSc, а также на предсимптомных стадиях и в моче.
It has been shown that PMCA is capable of detecting as little as a single molecule of oligomeric infectious PrPSc. and pre symptomatic phases as well as in urine.
Применение
Технология PMCA использовалась несколькими группами для изучения молекулярного механизма репликации прионов, природы инфекционного агента, феномена прионных штаммов и видового барьера, влияния клеточных компонентов, для обнаружения PrPSc в тканях и биологических жидкостях, а также для скрининга ингибиторов репликации прионов. Недавние исследования групп Супаттапон и Ма позволили добиться репликации прионов in vitro с помощью PMCA, используя очищенную PrPC и рекомбинантную PrPC, с добавлением только синтетических полианионов и липидов. Эти исследования показали, что инфекционные прионы могут быть получены в отсутствие каких-либо других клеточных компонентов, что является одним из наиболее веских доказательств в поддержку прионной гипотезы. Исследования, проведенные в 2020 году, показали, что циклическое усиление неправильного сворачивания белка (PMCA) может быть использовано для дифференциальной диагностики двух прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний – болезни Паркинсона и атрофии множественных систем, став первым методом, позволяющим установить объективный диагноз атрофии множественных систем, а не только дифференциальный.
The PMCA technology has been used by several groups to understand the molecular mechanism of prion replication, the nature of the infectious agent, the phenomenon of prion strains and species barrier, the effect of cellular components, to detect PrPSc in tissues and biological fluids and to screen for inhibitors against prion replication. Recent studies by the groups of Supattapone and Ma were able to produce prion replication in vitro by PMCA using purified PrPC and recombinant PrPC with the sole addition of synthetic polyanions and lipids. These studies have shown that infectious prions can be produced in the absence of any other cellular component and constitute some of the strongest evidence in favor of the prion hypothesis. Research in 2020 concluded that protein misfolding cyclic amplification could be used to distinguish between two progressive neurodegenerative diseases, Parkinson's disease and multiple system atrophy, being the first process to give an objective diagnosis of Multiple System Atrophy instead of just a differential diagnosis.