Белки без фиксированной трехмерной структуры

Белки без фиксированной структуры (IDP): что это такое? Функции, роль в регуляции ДНК и клеточной сигнализации. Разрушение догмы о строгой 3D-структуре белков.

13 мин чтения

100%

Источник: Intrinsically disordered proteins — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Белок без фиксированной трехмерной структуры

В молекулярной биологии, внутренне-дезорганизованный белок (IDP) – это белок, которому не присуща фиксированная или упорядоченная трехмерная структура, как правило, в отсутствие его макромолекулярных партнеров по взаимодействию, таких как другие белки или РНК. IDP варьируются от полностью неструктурированных до частично структурированных и включают случайные конформации, агрегаты, подобные «расплавленным глобулам», или гибкие линкеры в крупных многодоменных белках. Иногда их рассматривают как отдельный класс белков наряду с глобулярными, фибриллярными и мембранными белками. IDP представляют собой очень большой и функционально важный класс белков, и их открытие опровергло представление о том, что трехмерная структура белков должна быть фиксированной для выполнения их биологических функций. Например, было установлено, что IDP участвуют в слабых мультивалентных взаимодействиях, которые обладают высокой кооперативностью и динамичностью, что определяет их важность в регуляции ДНК и клеточной сигнализации. Многие IDP также могут приобретать фиксированную трехмерную структуру после связывания с другими макромолекулами. В целом, IDP отличаются от структурированных белков во многих аспектах и характеризуются специфическими функциями, структурой, последовательностью, взаимодействиями, эволюцией и регуляцией.

История

В 1930-х – 1950-х годах первые структуры белков были определены методами рентгеноструктурного анализа белков. Эти ранние структуры указывали на то, что фиксированная трехмерная структура может быть необходима для осуществления биологических функций белков. Эти публикации закрепили центральную догму молекулярной биологии, согласно которой аминокислотная последовательность белка определяет его структуру, которая, в свою очередь, определяет его функцию. В 1950 году Каруш писал о «конфигурационной адаптивности», противоречащей этому предположению. Он был убежден, что белки имеют более одной конфигурации на одном энергетическом уровне и могут выбирать одну из них при связывании с другими субстратами. В 1960-х годах парадокс Левинталя показал, что систематический конформационный поиск длинного полипептида вряд ли приведет к получению единственной правильно свернутой белковой структуры за биологически релевантные промежутки времени (т.е. от микросекунд до минут). Любопытно, что для многих (небольших) белков или белковых доменов in vitro можно наблюдать относительно быстрое и эффективное повторное сворачивание. Как утверждается в догме Анфинсена 1973 года, фиксированная трехмерная структура этих белков уникально закодирована в их первичной структуре (аминокислотной последовательности), является кинетически доступной и стабильной в широком диапазоне (почти) физиологических условий и, следовательно, может рассматриваться как нативное состояние таких «упорядоченных» белков. Однако в последующие десятилетия многие крупные белковые области не удавалось однозначно отнести к определенным положениям в рентгеновских данных, что указывало на то, что они занимают несколько положений, усредняющихся на картах электронной плотности. Отсутствие фиксированных, уникальных положений относительно кристаллической решетки свидетельствовало о том, что эти области были «неупорядоченными». Спектроскопия ядерного магнитного резонанса белков также продемонстрировала наличие больших гибких линкеров и терминальных участков во многих решенных структурных ансамблях. В 2001 году Данкер задался вопросом, игнорировалась ли вновь полученная информация в течение 50 лет, а в 2000-х годах стало доступно больше количественных анализов. В 2010-х годах стало ясно, что IDP (белки, лишенные фиксированной конформации) часто встречаются среди белков, связанных с заболеваниями, таких как альфа-синуклеин и тау.

In the 1930s 1950s, the first protein structures were solved by protein crystallography. These early structures suggested that a fixed three dimensional structure might be generally required to mediate biological functions of proteins. These publications solidified the central dogma of molecular biology in that the amino acid sequence of a protein determines its structure which, in turn, determines its function. In 1950, Karush wrote about 'Configurational Adaptability' contradicting this assumption. He was convinced that proteins have more than one configuration at the same energy level and can choose one when binding to other substrates. In the 1960s, Levinthal's paradox suggested that the systematic conformational search of a long polypeptide is unlikely to yield a single folded protein structure on biologically relevant timescales (i. e. microseconds to minutes). Curiously, for many (small) proteins or protein domains, relatively rapid and efficient refolding can be observed in vitro. As stated in Anfinsen's Dogma from 1973, the fixed 3D structure of these proteins is uniquely encoded in its primary structure (the amino acid sequence), is kinetically accessible and stable under a range of (near) physiological conditions, and can therefore be considered as the native state of such "ordered" proteins. During the subsequent decades, however, many large protein regions could not be assigned in x ray datasets, indicating that they occupy multiple positions, which average out in electron density maps. The lack of fixed, unique positions relative to the crystal lattice suggested that these regions were "disordered". Nuclear magnetic resonance spectroscopy of proteins also demonstrated the presence of large flexible linkers and termini in many solved structural ensembles. In 2001, Dunker questioned whether the newly found information was ignored for 50 years with more quantitative analyses becoming available in the 2000s. In the 2010s it became clear that IDPs are common among disease related proteins, such as alpha synuclein and tau.

Изобилие

В настоящее время общепринято считать, что белки существуют в виде ансамбля схожих структур, при этом некоторые области более жестко фиксированы, чем другие. Белки с собственной неструктурированностью (IDPs) занимают крайнюю позицию в этом спектре гибкости и включают белки с выраженной склонностью к локальной структуре или гибкие многодоменные комплексы. Собственная неструктурированность особенно часто встречается у белков, регулирующих хроматин и транскрипцию, и биоинформатические предсказания указывают на то, что она более распространена в геномах и протеомах, чем в известных структурах в базе данных белков. Согласно предсказаниям DISOPRED2, длинные (>30 аминокислотных остатков) неструктурированные сегменты встречаются в 2,0% архейных, 4,2% эубактериальных и 33,0% эукариотических белков. Собственная неструктурированность особенно обогащена белками, участвующими в клеточной сигнализации и транскрипции. Гены, недавно возникшие de novo, как правило, обладают большей степенью неструктурированности. У животных гены с высокой степенью неструктурированности теряются в ходе эволюции с более высокой частотой.

Гибкие связующие устройства

Неупорядоченные области часто встречаются в виде гибких линкеров или петель, соединяющих домены. Последовательности линкеров значительно различаются по длине, но обычно богаты полярными незаряженными аминокислотами. Гибкие линкеры позволяют соединенным доменам свободно изгибаться и вращаться, облегчая взаимодействие с партнерами по связыванию посредством динамики белковых доменов. Они также позволяют партнерам по связыванию индуцировать масштабные конформационные изменения посредством аллостерии на больших расстояниях.

Линейные мотивы

Линейные мотивы — это короткие неупорядоченные сегменты белков, которые опосредуют функциональные взаимодействия с другими белками или другими биомолекулами (РНК, ДНК, сахара и т. д.) и представляют собой преходящие элементы вторичной структуры, готовые к распознаванию мишени. В ряде случаев было показано, что при связывании с мишенью эти преходящие структуры превращаются в полноценные и стабильные элементы вторичной структуры, например, альфа-спирали. Следовательно, PresMos являются предполагаемыми функциональными участками в белках, не имеющих фиксированной конформации (IDP).

Складывание и связывание в сцеплении

Многие неструктурированные белки претерпевают переход в более упорядоченные состояния при связывании со своими мишенями (например, молекулярные признаки распознавания (MoRF)). Сопряженное сворачивание и связывание может быть локальным, затрагивая лишь несколько взаимодействующих аминокислотных остатков, или же вовлекать целый белковый домен. Недавно было показано, что сопряженное сворачивание и связывание позволяет скрывать большую площадь поверхности, что было бы возможно только для полностью структурированных белков значительно большего размера. Более того, определенные неупорядоченные области могут служить "молекулярными переключателями" в регуляции определенных биологических функций, переходя в упорядоченную конформацию при молекулярном распознавании, таком как связывание малых молекул, ДНК/РНК, ионные взаимодействия и т.п. Способность дезорганизованных белков связываться и, следовательно, выполнять функцию, демонстрирует, что стабильность не является обязательным условием. Многие короткие функциональные участки, например, короткие линейные мотивы, часто встречаются в дезорганизованных белках. Дезорганизованные белки и короткие линейные мотивы особенно распространены во многих РНК-вирусах, таких как вирус Хендра, вирус гепатита C (ВГС), ВИЧ-1 и папилломавирусы человека. Это позволяет этим вирусам обходить ограничения, связанные с их небольшим геномом, облегчая связывание и манипулирование большим количеством белков клетки-хозяина.

Расстройство в связанном состоянии (нечеткие комплексы)

Внутренне неупорядоченные белки могут сохранять свою конформационную гибкость даже при специфическом связывании с другими белками. Структурная неупорядоченность в связанном состоянии может быть как статической, так и динамической. В "размытых" комплексах структурное разнообразие необходимо для функционирования, а изменение связанного неупорядоченного региона влияет на активность. Конформационный ансамбль комплекса модулируется посттрансляционными модификациями или белок-белковыми взаимодействиями. Специфичность ДНК-связывающих белков часто зависит от длины "размытых" областей, которая варьируется за счет альтернативного сплайсинга. Некоторые "размытые" комплексы могут демонстрировать высокую аффинность связывания, хотя другие исследования показали различные значения аффинности для той же системы в разных концентрационных режимах.

Структурные аспекты

Внутренне неупорядоченные белки принимают множество различных структур in vivo в зависимости от условий клетки, формируя структурный или конформационный ансамбль. Следовательно, их структура тесно связана с функцией. Однако лишь немногие белки являются полностью неупорядоченными в своем нативном состоянии. Неупорядоченность чаще всего встречается в виде внутренне неупорядоченных доменов (IDR) в пределах белка, имеющего в целом упорядоченную структуру. Термин "внутренне неупорядоченный белок" (IDP) поэтому включает в себя как белки, содержащие IDR, так и полностью неупорядоченные белки. Существование и тип неупорядоченности белка закодированы в его аминокислотной последовательности. Используя топологический подход, можно классифицировать мотивы в соответствии с их топологическим строением и временными масштабами их формирования.

Экспериментальная валидация

Внутренне неупорядоченные белки (ВПБ) могут быть валидированы в различных контекстах. Большинство подходов к экспериментальной валидации ВПБ ограничены использованием выделенных или очищенных белков, в то время как некоторые новые экспериментальные стратегии направлены на изучение конформаций и структурных вариаций ВПБ внутри целых живых клеток и на систематическое сравнение их динамики in vivo и in vitro.

Подходы in vivo

Первое прямое доказательство существования внутренней неупорядоченности in vivo было получено с помощью ЯМР в клетках после электропорации очищенного IDP и восстановления клеток до целостного состояния. Крупномасштабная валидация прогнозов IDR in vivo теперь возможна с использованием "окрашивания" биотином.

Подходы in vitro

Внутренне некомпактные белки, после очистки, могут быть идентифицированы различными экспериментальными методами. Основным методом получения информации о неупорядоченных областях белка является спектроскопия ЯМР. Отсутствие электронной плотности в рентгеноструктурных исследованиях также может быть признаком расстройствa. Свернутые белки имеют высокую плотность (частичный удельный объем 0,72–0,74 мл/г) и соразмерно малый радиус гирации. Следовательно, некомпактные белки могут быть обнаружены методами, чувствительными к молекулярному размеру, плотности или гидродинамическому сопротивлению, такими как гель-фильтрационная хроматография, аналитическая ультрацентрифугация, рентгеновское малоугловое рассеяние (SAXS) и измерения константы диффузии. Для некомпактных белков также характерно отсутствие вторичной структуры, оцениваемое с помощью кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области (170–250 нм) (особенно выраженный минимум при ~200 нм) или инфракрасной спектроскопии. Некомпактные белки также имеют пептидные группы основного скелета, экспонированные к растворителю, что делает их легко расщепляемыми протеазами, подверженными быстрому обмену водорода на дейтерий и демонстрирующими небольшую дисперсию (<1 ppm) в химических сдвигах протонов амидной группы, измеренную с помощью ЯМР. (Свернутые белки обычно показывают дисперсию до 5 ppm для протонов амида.) Недавно были разработаны новые методы, включая быстрый параллельный протеолиз (FASTpp), позволяющие определять долю свернутых/неупорядоченных фрагментов без необходимости очистки. Даже незначительные различия в стабильности мутаций, приводящих к замене аминокислот, связывании с белками-партнерами и индуцированного (само)полимеризацией компактизации (например, спиралей) могут быть обнаружены с помощью FASTpp, как недавно было продемонстрировано на примере взаимодействия белков тропомиозина и тропонина. Полностью неструктурированные области белка могут быть экспериментально подтверждены их повышенной чувствительностью к протеолизу при использовании коротких времен инкубации и низких концентраций протеазы. К основным методам изучения структуры и динамики IDP относятся SAXS для получения информации о форме ансамбля, ЯМР для уточнения атомистического ансамбля, флуоресценция для визуализации молекулярных взаимодействий и конформационных переходов, рентгеновская кристаллография для выделения более подвижных областей в жестких белковых кристаллах, криоэлектронная микроскопия для выявления менее фиксированных частей белков, рассеяние света для мониторинга распределения размеров IDP или их кинетики агрегации, химические сдвиги ЯМР и круговой дихроизм для мониторинга вторичной структуры IDP. Методы изучения IDP на уровне отдельных молекул включают spFRET для изучения конформационной гибкости IDP и кинетики структурных переходов, оптические пинцеты для получения высокоразрешающих данных об ансамблях IDP и их олигомерах или агрегатах, нанопоры для выявления глобального распределения форм IDP, магнитные пинцеты для изучения структурных переходов в течение длительного времени при низких силах, высокоскоростная атомно-силовая микроскопия для непосредственной визуализации пространственно-временной гибкости IDP.

Intrinsically unfolded proteins, once purified, can be identified by various experimental methods. The primary method to obtain information on disordered regions of a protein is NMR spectroscopy. The lack of electron density in X ray crystallographic studies may also be a sign of disorder. Folded proteins have a high density (partial specific volume of 0.72 0.74 mL/g) and commensurately small radius of gyration. Hence, unfolded proteins can be detected by methods that are sensitive to molecular size, density or hydrodynamic drag, such as size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation, small angle X ray scattering (SAXS), and measurements of the diffusion constant. Unfolded proteins are also characterized by their lack of secondary structure, as assessed by far UV (170 250 nm) circular dichroism (esp. a pronounced minimum at ~200 nm) or infrared spectroscopy. Unfolded proteins also have exposed backbone peptide groups exposed to solvent, so that they are readily cleaved by proteases, undergo rapid hydrogen deuterium exchange and exhibit a small dispersion (<1 ppm) in their 1H amide chemical shifts as measured by NMR. (Folded proteins typically show dispersions as large as 5 ppm for the amide protons.) Recently, new methods including Fast parallel proteolysis (FASTpp) have been introduced, which allow to determine the fraction folded/disordered without the need for purification. Even subtle differences in the stability of missense mutations, protein partner binding and (self)polymerisation induced folding of (e. g.) coiled coils can be detected using FASTpp as recently demonstrated using the tropomyosin troponin protein interaction. Fully unstructured protein regions can be experimentally validated by their hypersusceptibility to proteolysis using short digestion times and low protease concentrations. Bulk methods to study IDP structure and dynamics include SAXS for ensemble shape information, NMR for atomistic ensemble refinement, Fluorescence for visualising molecular interactions and conformational transitions, x ray crystallography to highlight more mobile regions in otherwise rigid protein crystals, cryo EM to reveal less fixed parts of proteins, light scattering to monitor size distributions of IDPs or their aggregation kinetics, NMR chemical shift and Circular Dichroism to monitor secondary structure of IDPs. Single molecule methods to study IDPs include spFRET to study conformational flexibility of IDPs and the kinetics of structural transitions, optical tweezers for high resolution insights into the ensembles of IDPs and their oligomers or aggregates, nanopores to reveal global shape distributions of IDPs, magnetic tweezers to study structural transitions for long times at low forces, high speed AFM to visualise the spatio temporal flexibility of IDPs directly.

Аннотация расстройства

Внутренний беспорядок может быть как аннотирован на основе экспериментальных данных, так и предсказан с помощью специализированного программного обеспечения. Алгоритмы предсказания внутреннего беспорядка (ID) могут предсказывать склонность к внутреннему беспорядку с высокой точностью (достигая примерно 80%) на основе состава первичной последовательности, сходства с неназначенными сегментами в данных рентгеноструктурного анализа белков, гибких областей, выявленных в исследованиях ЯМР, и физико-химических свойств аминокислот.

Базы данных заболеваний

Были созданы базы данных для аннотирования аминокислотных последовательностей белков информацией о внутренней неупорядоченности. База данных DisProt содержит коллекцию сегментов белков, вручную курированных и экспериментально подтвержденных как неупорядоченные. MobiDB – это база данных, объединяющая экспериментально подтвержденные аннотации неупорядоченности (например, из DisProt) с данными, полученными на основе отсутствующих аминокислотных остатков в рентгеноструктурных данных и гибких регионов в структурах, полученных методом ЯМР.

Прогнозирование ВПП по последовательности

Разделение неупорядоченных и упорядоченных белков необходимо для предсказания расстройств. Одним из первых шагов в поиске фактора, отличающего IDP от белков с фиксированной структурой, является определение закономерностей в составе аминокислот. Гидрофильные, заряженные аминокислоты A, R, G, Q, S, P, E и K были идентифицированы как аминокислоты, способствующие расстройству, в то время как аминокислоты W, C, F, I, Y, V, L и N являются гидрофобными и незаряженными, способствуя упорядоченности. Оставшиеся аминокислоты H, M, T и D являются неоднозначными и встречаются как в упорядоченных, так и в неструктурированных областях. Как видно из списка, небольшие, заряженные, гидрофильные остатки часто способствуют расстройству, а крупные и гидрофобные – упорядоченности. Эта информация лежит в основе большинства предиктивных методов, основанных на анализе последовательности. Области с незначительной или отсутствующей вторичной структурой, также известные как NORS (NO Regular Secondary Structure) области, и области низкой сложности могут быть легко обнаружены. Однако не все неупорядоченные белки содержат такие последовательности низкой сложности.

Методы прогнозирования

Определение неупорядоченных областей с помощью биохимических методов обходится очень дорого и требует много времени. Из-за изменчивой природы IDP можно выявить лишь отдельные аспекты их структуры, поэтому для полной характеристики требуется большое количество различных методов и экспериментов. Это дополнительно увеличивает стоимость определения IDP. Для преодоления этой проблемы разрабатываются компьютерные методы прогнозирования структуры и функции белков. Получение знаний посредством прогнозирования – одна из основных задач биоинформатики. Также разрабатываются предсказатели функции IDP, но они в основном используют структурную информацию, такую как сайты линейных мотивов. Существуют различные подходы к прогнозированию структуры IDP, например, нейронные сети или матричные вычисления, основанные на различных структурных и/или биофизических свойствах. Многие вычислительные методы используют информацию о последовательности для предсказания, является ли белок неупорядоченным. Примечательными примерами такого программного обеспечения являются IUPRED и Disopred. Разные методы могут использовать различные определения неупорядоченности. Мета-предсказатели представляют собой новую концепцию, объединяющую различные первичные предсказатели для создания более эффективного и точного предсказателя. В связи с различными подходами к прогнозированию неупорядоченных белков, оценка их относительной точности представляется довольно сложной. Например, нейронные сети часто обучаются на разных наборах данных. Прогнозирование неупорядоченности является частью двухгодичного эксперимента CASP, предназначенного для оценки методов по точности определения областей с отсутствующей 3D-структурой (отмеченных в файлах PDB как REMARK465, отсутствующие электронные плотности в рентгеновских структурах).

Расстройства и болезни

Внутриструктурно неструктурированные белки были связаны с рядом заболеваний. Многие ключевые супрессоры опухолей имеют большие внутренне неструктурированные области, например, p53 и BRCA1. Эти области белков отвечают за опосредование многих их взаимодействий. Используя естественные защитные механизмы клетки в качестве модели, можно разрабатывать лекарства, стремящиеся блокировать место связывания вредных субстратов и ингибировать их, тем самым противодействуя болезни.

Компьютерные симуляции

В связи с высокой структурной гетерогенностью, экспериментальные параметры, полученные методами ЯМР/SAXS, будут представлять собой среднее значение по большому числу сильно различающихся и неупорядоченных состояний (ансамблю неупорядоченных состояний). Следовательно, для понимания структурных особенностей, определяемых этими экспериментальными параметрами, необходимо точное представление этих ансамблей посредством компьютерного моделирования. Для этой цели можно использовать молекулярно-динамическое моделирование всех атомов, однако его применение ограничено точностью современных силовых полей при описании неупорядоченных белков. Тем не менее, некоторые силовые поля были разработаны специально для изучения неупорядоченных белков путем оптимизации параметров силового поля на основе доступных данных ЯМР для таких белков (например, CHARMM 22*, CHARMM 32, Amber ff03* и т.д.). Моделирование молекулярной динамики с ограничениями, основанными на экспериментальных данных (ограниченная МД), также использовалось для характеристики неупорядоченных белков. В принципе, при достаточно длительном времени моделирования молекулярной динамики (с использованием точного силового поля) можно исследовать все конформационное пространство. Однако из-за очень высокой структурной гетерогенности требуемые временные масштабы моделирования чрезвычайно велики и ограничены вычислительными ресурсами. Вместе с тем, для исследования более широкого конформационного пространства за меньшее время использовались другие вычислительные методы, такие как ускоренное моделирование МД, моделирование реплик с обменом, метадинамика, мультиканоническое моделирование МД или методы, использующие грубозернистое представление с неявными и явными растворителями. Кроме того, для понимания функциональных сегментов IDP применялись различные протоколы и методы анализа, включая исследования, основанные на количественном анализе содержания GC в генах и соответствующих хромосомных участках.