Введение
Изучение скорости биохимических реакций, катализируемых ферментом. Энзимная кинетика – это изучение скорости химических реакций, катализируемых ферментом. В энзимной кинетике измеряется скорость реакции и исследуются эффекты изменения условий реакции. Изучение кинетики фермента таким образом может выявить каталитический механизм этого фермента, его роль в метаболизме, способы контроля его активности и то, как препарат или модификатор (ингибитор или активатор) может повлиять на скорость. Фермент (E) – это молекула белка, которая служит биологическим катализатором для облегчения и ускорения химической реакции в организме. Он осуществляет это посредством связывания с другой молекулой, своим субстратом (S), на который фермент действует, образуя желаемый продукт. Субстрат связывается с активным центром фермента, образуя фермент-субстратный комплекс ES, и трансформируется в фермент-продуктовый комплекс EP, а затем в продукт P, через переходное состояние ES*. Эта последовательность этапов известна как механизм:
Enzyme kinetics is the study of the rates of enzyme catalysed chemical reactions. In enzyme kinetics, the reaction rate is measured and the effects of varying the conditions of the reaction are investigated. Studying an enzyme's kinetics in this way can reveal the catalytic mechanism of this enzyme, its role in metabolism, how its activity is controlled, and how a drug or a modifier (inhibitor or activator) might affect the rate. An enzyme (E) is a protein molecule that serves as a biological catalyst to facilitate and accelerate a chemical reaction in the body. It does this through binding of another molecule, its substrate (S), which the enzyme acts upon to form the desired product. The substrate binds to the active site of the enzyme to produce an enzyme substrate complex ES, and is transformed into an enzyme product complex EP and from there to product P, via a transition state ES*. The series of steps is known as the mechanism:
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
This example assumes the simplest case of a reaction with one substrate and one product. Such cases exist: for example, a mutase such as phosphoglucomutase catalyses the transfer of a phospho group from one position to another, and isomerase is a more general term for an enzyme that catalyses any one substrate one product reaction, such as triosephosphate isomerase. However, such enzymes are not very common, and are heavily outnumbered by enzymes that catalyse two substrate two product reactions: these include, for example, the NAD dependent dehydrogenases such as alcohol dehydrogenase, which catalyses the oxidation of ethanol by NAD+. Reactions with three or four substrates or products are less common, but they exist. There is no necessity for the number of products to be equal to the number of substrates; for example, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase has three substrates and two products. When enzymes bind multiple substrates, such as dihydrofolate reductase (shown right), enzyme kinetics can also show the sequence in which these substrates bind and the sequence in which products are released. An example of enzymes that bind a single substrate and release multiple products are proteases, which cleave one protein substrate into two polypeptide products. Others join two substrates together, such as DNA polymerase linking a nucleotide to DNA. Although these mechanisms are often a complex series of steps, there is typically one rate determining step that determines the overall kinetics. This rate determining step may be a chemical reaction or a conformational change of the enzyme or substrates, such as those involved in the release of product(s) from the enzyme. Knowledge of the enzyme's structure is helpful in interpreting kinetic data. For example, the structure can suggest how substrates and products bind during catalysis; what changes occur during the reaction; and even the role of particular amino acid residues in the mechanism. Some enzymes change shape significantly during the mechanism; in such cases, it is helpful to determine the enzyme structure with and without bound substrate analogues that do not undergo the enzymatic reaction. Not all biological catalysts are protein enzymes: RNA based catalysts such as ribozymes and ribosomes are essential to many cellular functions, such as RNA splicing and translation. The main difference between ribozymes and enzymes is that RNA catalysts are composed of nucleotides, whereas enzymes are composed of amino acids. Ribozymes also perform a more limited set of reactions, although their reaction mechanisms and kinetics can be analysed and classified by the same methods.
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
Enzyme kinetics is the study of the rates of enzyme catalysed chemical reactions. In enzyme kinetics, the reaction rate is measured and the effects of varying the conditions of the reaction are investigated. Studying an enzyme's kinetics in this way can reveal the catalytic mechanism of this enzyme, its role in metabolism, how its activity is controlled, and how a drug or a modifier (inhibitor or activator) might affect the rate. An enzyme (E) is a protein molecule that serves as a biological catalyst to facilitate and accelerate a chemical reaction in the body. It does this through binding of another molecule, its substrate (S), which the enzyme acts upon to form the desired product. The substrate binds to the active site of the enzyme to produce an enzyme substrate complex ES, and is transformed into an enzyme product complex EP and from there to product P, via a transition state ES*. The series of steps is known as the mechanism:
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
This example assumes the simplest case of a reaction with one substrate and one product. Such cases exist: for example, a mutase such as phosphoglucomutase catalyses the transfer of a phospho group from one position to another, and isomerase is a more general term for an enzyme that catalyses any one substrate one product reaction, such as triosephosphate isomerase. However, such enzymes are not very common, and are heavily outnumbered by enzymes that catalyse two substrate two product reactions: these include, for example, the NAD dependent dehydrogenases such as alcohol dehydrogenase, which catalyses the oxidation of ethanol by NAD+. Reactions with three or four substrates or products are less common, but they exist. There is no necessity for the number of products to be equal to the number of substrates; for example, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase has three substrates and two products. When enzymes bind multiple substrates, such as dihydrofolate reductase (shown right), enzyme kinetics can also show the sequence in which these substrates bind and the sequence in which products are released. An example of enzymes that bind a single substrate and release multiple products are proteases, which cleave one protein substrate into two polypeptide products. Others join two substrates together, such as DNA polymerase linking a nucleotide to DNA. Although these mechanisms are often a complex series of steps, there is typically one rate determining step that determines the overall kinetics. This rate determining step may be a chemical reaction or a conformational change of the enzyme or substrates, such as those involved in the release of product(s) from the enzyme. Knowledge of the enzyme's structure is helpful in interpreting kinetic data. For example, the structure can suggest how substrates and products bind during catalysis; what changes occur during the reaction; and even the role of particular amino acid residues in the mechanism. Some enzymes change shape significantly during the mechanism; in such cases, it is helpful to determine the enzyme structure with and without bound substrate analogues that do not undergo the enzymatic reaction. Not all biological catalysts are protein enzymes: RNA based catalysts such as ribozymes and ribosomes are essential to many cellular functions, such as RNA splicing and translation. The main difference between ribozymes and enzymes is that RNA catalysts are composed of nucleotides, whereas enzymes are composed of amino acids. Ribozymes also perform a more limited set of reactions, although their reaction mechanisms and kinetics can be analysed and classified by the same methods.
Этот пример предполагает простейший случай реакции с одним субстратом и одним продуктом. Такие случаи существуют: например, мутаза, такая как фосфоглюкомутаза, катализирует перенос фосфогруппы с одного положения на другое, а изомераза – более общий термин для фермента, который катализирует любую реакцию одного субстрата в один продукт, например, триозофосфат изомераза. Однако такие ферменты не очень распространены и значительно уступают по количеству ферментам, катализирующим реакции двух субстратов в два продукта: к ним относятся, например, NAD-зависимые дегидрогеназы, такие как алкогольная дегидрогеназа, которая катализирует окисление этанола с помощью NAD+. Реакции с тремя или четырьмя субстратами или продуктами встречаются реже, но они существуют. Нет необходимости, чтобы количество продуктов было равно количеству субстратов; например, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа имеет три субстрата и два продукта. Когда ферменты связывают несколько субстратов, таких как дигидрофолатредуктаза (изображена справа), энзимная кинетика также может показать последовательность, в которой эти субстраты связываются, и последовательность, в которой продукты высвобождаются. Примером ферментов, которые связывают один субстрат и высвобождают несколько продуктов, являются протеазы, которые расщепляют один белковый субстрат на два полипептидных продукта. Другие соединяют два субстрата вместе, например, ДНК-полимераза, присоединяя нуклеотид к ДНК. Хотя эти механизмы часто представляют собой сложную последовательность этапов, обычно существует один лимитирующий этап, определяющий общую кинетику. Этот лимитирующий этап может быть химической реакцией или конформационным изменением фермента или субстратов, например, связанным с высвобождением продукта(ов) из фермента. Знание структуры фермента полезно для интерпретации кинетических данных. Например, структура может подсказать, как субстраты и продукты связываются во время катализа, какие изменения происходят во время реакции и даже роль определенных аминокислотных остатков в механизме. Некоторые ферменты значительно меняют форму в ходе механизма; в таких случаях полезно определить структуру фермента как с связанными, так и без связанных аналогов субстрата, которые не подвергаются ферментативной реакции. Не все биологические катализаторы являются белковыми ферментами: катализаторы на основе РНК, такие как рибозимы и рибосомы, необходимы для многих клеточных функций, таких как сплайсинг и трансляция РНК. Основное различие между рибозимами и ферментами заключается в том, что РНК-катализаторы состоят из нуклеотидов, в то время как ферменты состоят из аминокислот. Рибозимы также выполняют более ограниченный набор реакций, хотя их механизмы реакции и кинетика могут быть проанализированы и классифицированы теми же методами.
Enzyme kinetics is the study of the rates of enzyme catalysed chemical reactions. In enzyme kinetics, the reaction rate is measured and the effects of varying the conditions of the reaction are investigated. Studying an enzyme's kinetics in this way can reveal the catalytic mechanism of this enzyme, its role in metabolism, how its activity is controlled, and how a drug or a modifier (inhibitor or activator) might affect the rate. An enzyme (E) is a protein molecule that serves as a biological catalyst to facilitate and accelerate a chemical reaction in the body. It does this through binding of another molecule, its substrate (S), which the enzyme acts upon to form the desired product. The substrate binds to the active site of the enzyme to produce an enzyme substrate complex ES, and is transformed into an enzyme product complex EP and from there to product P, via a transition state ES*. The series of steps is known as the mechanism:
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
This example assumes the simplest case of a reaction with one substrate and one product. Such cases exist: for example, a mutase such as phosphoglucomutase catalyses the transfer of a phospho group from one position to another, and isomerase is a more general term for an enzyme that catalyses any one substrate one product reaction, such as triosephosphate isomerase. However, such enzymes are not very common, and are heavily outnumbered by enzymes that catalyse two substrate two product reactions: these include, for example, the NAD dependent dehydrogenases such as alcohol dehydrogenase, which catalyses the oxidation of ethanol by NAD+. Reactions with three or four substrates or products are less common, but they exist. There is no necessity for the number of products to be equal to the number of substrates; for example, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase has three substrates and two products. When enzymes bind multiple substrates, such as dihydrofolate reductase (shown right), enzyme kinetics can also show the sequence in which these substrates bind and the sequence in which products are released. An example of enzymes that bind a single substrate and release multiple products are proteases, which cleave one protein substrate into two polypeptide products. Others join two substrates together, such as DNA polymerase linking a nucleotide to DNA. Although these mechanisms are often a complex series of steps, there is typically one rate determining step that determines the overall kinetics. This rate determining step may be a chemical reaction or a conformational change of the enzyme or substrates, such as those involved in the release of product(s) from the enzyme. Knowledge of the enzyme's structure is helpful in interpreting kinetic data. For example, the structure can suggest how substrates and products bind during catalysis; what changes occur during the reaction; and even the role of particular amino acid residues in the mechanism. Some enzymes change shape significantly during the mechanism; in such cases, it is helpful to determine the enzyme structure with and without bound substrate analogues that do not undergo the enzymatic reaction. Not all biological catalysts are protein enzymes: RNA based catalysts such as ribozymes and ribosomes are essential to many cellular functions, such as RNA splicing and translation. The main difference between ribozymes and enzymes is that RNA catalysts are composed of nucleotides, whereas enzymes are composed of amino acids. Ribozymes also perform a more limited set of reactions, although their reaction mechanisms and kinetics can be analysed and classified by the same methods.
Общие принципы
Реакция, катализируемая ферментом, использует точно такие же реагенты и производит точно такие же продукты, как и некатализированная реакция. Как и другие катализаторы, ферменты не изменяют положение равновесия между субстратами и продуктами. Однако, в отличие от некатализированных химических реакций, реакции, катализируемые ферментами, демонстрируют кинетику насыщения. Для заданной концентрации фермента и относительно низких концентраций субстрата скорость реакции увеличивается линейно с концентрацией субстрата; молекулы фермента в значительной степени свободны для катализа реакции, и увеличение концентрации субстрата означает увеличение скорости, с которой молекулы фермента и субстрата сталкиваются друг с другом. Однако при относительно высоких концентрациях субстрата скорость реакции асимптотически приближается к теоретическому максимуму; активные центры фермента почти полностью заняты субстратами, что приводит к насыщению, а скорость реакции определяется внутренней скоростью оборота фермента. Концентрация субстрата, находящаяся посередине между этими двумя предельными случаями, обозначается KM. Таким образом, KM – это концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. Аналогичным подходом является использование масс-спектрометрии для мониторинга включения или высвобождения стабильных изотопов при превращении субстрата в продукт. Иногда анализ дает сбой, и необходимы способы восстановления неудачного анализа. Наиболее чувствительные ферментные анализы используют лазеры, сфокусированные через микроскоп, для наблюдения за изменениями в отдельных молекулах фермента по мере катализа их реакций. Эти измерения используют изменения флуоресценции кофакторов в ходе реакционного механизма фермента или флуоресцентных красителей, добавленных к определенным участкам белка, для регистрации движений, происходящих во время катализа. Эти исследования предоставляют новый взгляд на кинетику и динамику отдельных ферментов, в отличие от традиционной кинетики ферментов, которая наблюдает за средним поведением популяций, состоящих из миллионов молекул ферментов. Пример кривой прогресса для ферментного анализа показан выше. Фермент производит продукт с начальной скоростью, которая приблизительно линейна в течение короткого периода после начала реакции. По мере протекания реакции и потребления субстрата скорость непрерывно замедляется (до тех пор, пока концентрация субстрата не достигнет уровня насыщения). Для измерения начальной (и максимальной) скорости ферментные анализы обычно проводят, когда реакция прошла лишь на несколько процентов к полному завершению. Продолжительность периода начальной скорости зависит от условий анализа и может варьироваться от миллисекунд до часов. Однако оборудование для быстрого смешивания жидкостей позволяет проводить быстрые кинетические измерения при начальных скоростях менее одной секунды. Эти очень быстрые анализы необходимы для измерения пре-стационарной кинетики, которая обсуждается ниже. Большинство исследований кинетики ферментов сосредоточены на этой начальной, приблизительно линейной части ферментных реакций. Однако также возможно измерить полную кривую реакции и подогнать эти данные к нелинейному уравнению скорости. Этот способ измерения ферментных реакций называется анализом кривой прогресса. Этот подход полезен как альтернатива быстрой кинетике, когда начальная скорость слишком высока для точного измерения. Руководство по стандартам представления энзимологических данных содержит минимальную информацию, необходимую для всестороннего представления кинетических и равновесных данных, полученных в результате исследований активности ферментов, включая соответствующие экспериментальные условия. Руководство разработано для представления данных о функциональных ферментах со строгостью и надежностью.
Реакции с одним субстратом
Ферменты с механизмом действия на один субстрат включают изомеразы, такие как триозофосфатизомераза или бисфосфоглицератмутаза, внутримолекулярные лиазы, такие как аденилатциклаза и рибозим «молоток», являющийся РНК-лиазой. Однако некоторые ферменты, работающие только с одним субстратом, не подпадают под эту категорию механизмов. Каталаза – пример такого фермента, поскольку он реагирует с первой молекулой субстрата – перекиси водорода, окисляется, а затем восстанавливается второй молекулой субстрата. Несмотря на то, что участвует только один субстрат, наличие модифицированного ферментного интермедиата означает, что механизм действия каталазы фактически является механизмом «пинг-понга», тип механизма, который обсуждается в разделе «Реакции с несколькими субстратами» ниже.
Линейные графики уравнения Михаэлиса Ментена
График зависимости v от [S], представленный выше, не является линейным; хотя при низких концентрациях [S] он изначально линеен, при высоких [S] он изгибается и выходит на насыщение. До появления современных компьютерных программ для нелинейной аппроксимации кривых, эта нелинейность затрудняла точную оценку KM и Vmax. Поэтому несколько исследователей разработали линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен, такие как график Линевейвера-Берка, диаграмма Эйди-Хофсти и график Ханеса-Вулфа. Все эти линейные представления могут быть полезны для визуализации данных, но ни одно из них не следует использовать для определения кинетических параметров, поскольку сейчас широко доступны компьютерные программы, позволяющие проводить более точное определение методами нелинейной регрессии. График Линевейвера-Берка, или график двойных обратных величин, является распространенным способом иллюстрации кинетических данных. Он строится путем взятия обратной величины обеих частей уравнения Михаэлиса-Ментен. Как показано на рисунке справа, это линейная форма уравнения Михаэлиса-Ментен, представляющая собой прямую линию с уравнением y = mx + c, где y-перехват эквивалентен 1/Vmax, а x-перехват графика соответствует −1/KM. Естественно, экспериментальные значения не могут быть получены при отрицательных 1/[S]; нижнее предельное значение 1/[S] = 0 (y-перехват) соответствует бесконечной концентрации субстрата, при которой 1/v = 1/Vmax, как показано на рисунке справа; следовательно, x-перехват является экстраполяцией экспериментальных данных, полученных при положительных концентрациях. В целом, график Линевейвера-Берка искажает значимость измерений, выполненных при низких концентрациях субстрата, и, следовательно, может приводить к неточным оценкам Vmax и KM. Более точным методом линейного представления является график Эйди-Хофсти. В этом случае v откладывается по оси y, а v/[S] – по оси x. В третьем распространенном линейном представлении, графике Ханеса-Вулфа, [S]/v откладывается по оси y, а [S] – по оси x. В целом, нормализация данных может помочь уменьшить объем экспериментальной работы и повысить надежность результатов, и подходит как для графического, так и для численного анализа.
Практическое значение кинетических констант
Изучение кинетики ферментов важно по двум основным причинам. Во-первых, оно помогает понять, как работают ферменты, а во-вторых – предсказать их поведение в живых организмах. Кинетические константы, определенные выше, KM и Vmax, критически важны для понимания того, как ферменты взаимодействуют, контролируя метаболизм. Сделать такие предсказания непросто, даже для простых систем. Например, оксалоацетат образуется малатодегидрогеназой в митохондриях. Затем оксалоацетат может быть использован цитратсинтазой, фосфоенолпируваткарбоксикиназой или аспартатаминотрансферазой, поступая соответственно в цикл лимонной кислоты, глюконеогенез или биосинтез аспарагиновой кислоты. Чтобы предсказать, какая часть оксалоацетата направляется по каждому пути, необходимо знать концентрацию оксалоацетата, а также концентрацию и кинетику каждого из этих ферментов. Стремление к предсказанию поведения метаболических путей достигает наибольшей сложности при синтезе огромных объемов данных о кинетике и экспрессии генов в математические модели целых организмов. Альтернативным, полезным упрощением задачи моделирования метаболизма является игнорирование кинетики ферментов и использование только информации о стехиометрии сети реакций, метода, известного как анализ баланса потоков.
Реакции с несколькими субстратами
Многосубстратные реакции подчиняются сложным уравнениям скорости, описывающим связывание субстратов и последовательность этого связывания. Анализ этих реакций значительно упрощается, если концентрация субстрата А поддерживается постоянной, а концентрация субстрата В изменяется. В таких условиях фермент ведет себя подобно ферменту с одним субстратом, и график зависимости скорости реакции (v) от концентрации субстрата ([S]) дает кажущиеся значения KM и Vmax для субстрата B. Если провести серию таких измерений при различных фиксированных концентрациях А, полученные данные можно использовать для определения механизма реакции. Для фермента, который использует два субстрата – А и В – и превращает их в два продукта – P и Q, существует два типа механизмов: механизм с образованием тройного комплекса и механизм «пинг-понг».
Тернарно-комплексные механизмы
В этих ферментах оба субстрата связываются с ферментом одновременно, образуя тройственный комплекс EAB. Порядок связывания может быть случайным (в случайном механизме) или субстраты должны связываться в определенной последовательности (в упорядоченном механизме). При построении на графике Lineweaver–Burk набора кривых v от [S] (фиксированное значение A, изменяющееся значение B) для фермента с механизмом тройственного комплекса, полученные линии пересекутся. К ферментам с механизмом тройственного комплекса относятся глутатион-S-трансфераза, дигидрофолатредуктаза и ДНК-полимераза. Следующие ссылки содержат короткие анимации механизмов тройственного комплекса ферментов дигидрофолатредуктазы и ДНК-полимеразы.
Механизмы пинг-понга
Как показано справа, ферменты с механизмом пинг-понга могут находиться в двух состояниях: E и химически модифицированной форме фермента E*; этот модифицированный фермент известен как промежуточное соединение. В таких механизмах субстрат А связывается, изменяет фермент в E*, например, путем переноса химической группы в активный центр, и затем высвобождается. Только после высвобождения первого субстрата субстрат B может связаться и прореагировать с модифицированным ферментом, восстанавливая исходную, немодифицированную форму E. При построении на графике Lineweaver-Burk набора кривых v от [S] (при фиксированном A и изменяющемся B) для фермента с механизмом пинг-понга получается набор параллельных линий. Это называется вторичным графиком. Ферменты с механизмом пинг-понга включают некоторые оксидоредуктазы, такие как тиоредоксин пероксидаза, трансферазы, такие как ацилневроаминат цитидилилтрансфераза, и серинпротеазы, такие как трипсин и химотрипсин. Серинпротеазы – это очень распространенное и разнообразное семейство ферментов, включающее пищеварительные ферменты (трипсин, химотрипсин и эластазу), несколько ферментов каскада свертывания крови и многие другие. В этих серинпротеазах промежуточное соединение E* представляет собой ацилированный фермент, образующийся в результате атаки остатка серина активного центра на пептидную связь в белковом субстрате. Краткая анимация, демонстрирующая механизм химотрипсина, доступна по этой ссылке.
Не-Михаэлис-Ментен кинетика
Многие различные ферментные системы демонстрируют поведение, отличное от кинетики Микаэлиса-Ментен. К числу таких примеров относятся кинетика самокаталитических ферментов, кооперативных и аллостерических ферментов, ферментов, работающих на границе раздела фаз и внутри клеток, процессивных ферментов и так далее. Некоторые ферменты демонстрируют сигмоидную зависимость скорости реакции (v) от концентрации субстрата ([S]), что часто свидетельствует о кооперативном связывании субстрата с активным центром. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата влияет на связывание последующих молекул. Такое поведение наиболее характерно для мультимерных ферментов, содержащих несколько взаимодействующих активных центров. Механизм кооперации в этом случае аналогичен механизму гемоглобина, когда связывание субстрата с одним активным центром изменяет сродство других активных центров к молекулам субстрата. Положительная кооперативность наблюдается, когда связывание первой молекулы субстрата повышает сродство других активных центров к субстрату. Отрицательная кооперативность возникает, когда связывание первой молекулы субстрата снижает сродство фермента к другим молекулам субстрата. К аллостерическим ферментам относятся тирозильная ТРНК-синтетаза млекопитающих, демонстрирующая отрицательную кооперативность, а также аспартат-транскарбамоилаза и фосфофруктокиназа бактерий, демонстрирующие положительную кооперативность. Кооперативность встречается довольно часто и может способствовать регуляции реакции ферментов на изменения концентрации их субстратов. Положительная кооперативность делает ферменты более чувствительными к изменениям концентрации субстрата ([S]), и их активность может значительно изменяться в узком диапазоне концентраций. Напротив, отрицательная кооперативность делает ферменты нечувствительными к небольшим изменениям концентрации субстрата ([S]). Уравнение Хилла часто используется для количественной оценки степени кооперативности в кинетике, не подчиняющейся закону Микаэлиса-Ментен. Выведенный коэффициент Хилла (n) показывает, в какой степени связывание субстрата с одним активным центром влияет на связывание субстрата с другими активными центрами. Коэффициент Хилла меньше 1 указывает на отрицательную кооперативность, а коэффициент больше 1 – на положительную кооперативность.
Кинетическая характеристика перед стационарным состоянием
В первый момент после смешивания фермента с субстратом продукт еще не образовался и промежуточные соединения отсутствуют. Изучение первых нескольких миллисекунд реакции называется престационарной кинетикой. Таким образом, престационарная кинетика изучает образование и расходование промежуточных комплексов фермент-субстрат (таких как ES или E*) до достижения их стационарных концентраций. Этот подход был впервые применен к реакции гидролиза, катализируемой химотрипсином. Обнаружение промежуточного соединения часто является важным доказательством при исследовании механизма действия фермента. Например, в механизмах "пинг-понг", показанных выше, быстрые кинетические измерения позволяют отслеживать высвобождение продукта P и измерять образование модифицированного фермента E*. В случае химотрипсина этот промежуточный продукт образуется в результате атаки нуклеофильного серина в активном центре на субстрат и формирования ацил-ферментного промежуточного соединения. На рисунке справа видно, что фермент быстро образует E* в первые несколько секунд реакции. Затем скорость замедляется по мере достижения стационарного состояния. Эта быстрая начальная фаза реакции соответствует одному циклу ферментативной реакции. Следовательно, количество продукта, высвобождаемого в этой начальной фазе, которое отображается как точка пересечения с осью y на графике, также указывает на количество функционального фермента, присутствующего в пробе.
Химический механизм
Важной целью измерения кинетики ферментов является определение химического механизма ферментативной реакции, то есть последовательности химических стадий, превращающих субстрат в продукт. Кинетические подходы, описанные выше, покажут, с какой скоростью образуются и превращаются промежуточные соединения, но они не могут точно идентифицировать эти соединения. Кинетические измерения, проведенные в различных условиях раствора или с использованием слегка модифицированных ферментов или субстратов, часто проливают свет на этот химический механизм, поскольку позволяют выявить лимитирующую стадию или промежуточные соединения в реакции. Например, разрыв ковалентной связи с атомом водорода часто является лимитирующей стадией. Какой из возможных переносов водорода является лимитирующим, можно установить, измерив кинетические эффекты замещения каждого водорода дейтерием, его стабильным изотопом. Скорость изменится при замене критического водорода из-за первичного кинетического изотопного эффекта, возникающего потому, что связи с дейтерием труднее разорвать, чем связи с водородом. Аналогичные эффекты можно измерить и с другими изотопными замещениями, такими как 13C/12C и 18O/16O, но они менее выражены. Изотопы также можно использовать для определения судьбы различных фрагментов молекул субстрата в конечных продуктах. Например, иногда бывает сложно установить происхождение атома кислорода в конечном продукте, поскольку он мог поступить из воды или из части субстрата. Это можно определить, систематически заменяя стабильный изотоп кислорода 18O в различных молекулах, участвующих в реакции, и определяя наличие изотопа в продукте. Химический механизм также можно уточнить, изучая кинетику и изотопные эффекты при различных значениях pH, изменяя ионы металлов или другие связанные кофакторы, проводя сайт-направленный мутагенез консервативных аминокислотных остатков или изучая поведение фермента в присутствии аналогов субстрата(ов).
Ингибирование и активация ферментов
Ингибиторы ферментов – это молекулы, которые снижают или полностью подавляют активность ферментов, а активизаторы ферментов – молекулы, которые повышают каталитическую активность ферментов. Эти взаимодействия могут быть обратимыми (то есть удаление ингибитора восстанавливает активность фермента) или необратимыми (то есть ингибитор необратимо инактивирует фермент).
Необратимые ингибиторы
Ингибиторы ферментов также могут необратимо инактивировать ферменты, как правило, посредством ковалентного модифицирования остатков активного центра. Эти реакции, которые могут называться субстратами-самоубийцами, подчиняются экспоненциальным функциям убывания и обычно насыщаемы. До достижения насыщения они демонстрируют кинетику первого порядка по отношению к ингибитору. Необратимое ингибирование можно классифицировать на два различных типа. Аффинная маркировка – это тип необратимого ингибирования, при котором высокореактивная функциональная группа модифицирует каталитически важный остаток в интересующем белке, вызывая ингибирование. Ингибирование на основе механизма, с другой стороны, включает связывание ингибитора, за которым следуют изменения, опосредованные ферментом, преобразующие ингибитор в реактивную группу, необратимо модифицирующую фермент.
Философский дискурс о обратимости и необратимости торможения
Обсудив обратимое и необратимое ингибирование в двух вышеуказанных разделах, необходимо подчеркнуть, что понятие обратимости (или необратимости) является чисто теоретической конструкцией, полностью зависящей от временного масштаба эксперимента. То есть, обратимый процесс, включающий ассоциацию и диссоциацию молекулы ингибитора в течение минут, может показаться необратимым, если результат оценивается в секундах, и наоборот. Существует спектр поведения ингибиторов, простирающийся от обратимости к необратимости при заданном, не произвольном времени проведения эксперимента. Есть ингибиторы, демонстрирующие медленное начало действия, и большинство из них, как правило, также характеризуются прочным связыванием с интересующей белковой мишенью.
Механизмы катализа
Предпочтительной моделью взаимодействия фермента и субстрата является модель индуцированной подгонки. Эта модель предполагает, что начальное взаимодействие между ферментом и субстратом относительно слабое, но эти слабые взаимодействия быстро индуцируют конформационные изменения в ферменте, которые усиливают связывание. Эти конформационные изменения также приближают каталитические остатки в активном центре к химическим связям в субстрате, которые будут изменены в ходе реакции. Изменения конформации можно измерить с помощью циркулярного дихроизма или интерферометрии двойной поляризации. После связывания один или несколько механизмов катализа снижают энергию переходного состояния реакции, предоставляя альтернативный химический путь для ее протекания. Механизмы катализа включают катализ за счет напряжения связей, за счет близости и ориентации, с участием доноров или акцепторов протонов в активном центре, ковалентный катализ и квантовое туннелирование. Энзимная кинетика не может доказать, какие именно механизмы катализа использует фермент. Однако некоторые кинетические данные могут указывать на возможности, которые следует исследовать другими методами. Например, механизм "пинг-понг" с фазой резкого увеличения скорости в престационарном состоянии может свидетельствовать о важной роли ковалентного катализа в механизме действия этого фермента. В качестве альтернативы, наблюдение сильного влияния pH на Vmax, но не на KM, может указывать на то, что для протекания катализа остаток в активном центре должен находиться в определенном состоянии ионизации.
История
В 1902 году Виктор Анри предложил количественную теорию кинетики ферментов, но в то время экспериментальное значение концентрации ионов водорода ещё не было осознано. После того как Питер Лориц Сёренсен определил логарифмическую шкалу pH и ввёл понятие буферизации в 1909 году, немецкий химик Леонор Михаэлис и доктор Мод Леонора Ментен (в то время постдокторант в лаборатории Михаэлиса) повторили эксперименты Анри и подтвердили его уравнение, которое теперь обычно называют кинетикой Михаэлиса — Ментен (иногда также кинетикой Анри — Михаэлиса — Ментен). Их работу развили Г. Э. Бриггс и Дж. Б. С. Холдейн, которые вывели кинетические уравнения, которые и сегодня широко рассматриваются как отправная точка в моделировании ферментативной активности. Главным вкладом подхода Анри — Михаэлиса — Ментен стало рассмотрение ферментативных реакций в два этапа. На первом этапе субстрат обратимо связывается с ферментом, образуя комплекс фермент-субстрат. Это иногда называют комплексом Михаэлиса. Затем фермент катализирует химическую стадию реакции и высвобождает продукт. Кинетика многих ферментов адекватно описывается простой моделью Михаэлиса — Ментен, но все ферменты обладают внутренними движениями, которые не учитываются в модели и могут вносить значительный вклад в общую кинетику реакции. Это можно смоделировать, вводя несколько путей Михаэлиса — Ментен, связанных флуктуирующими скоростями, что является математическим расширением базового механизма Михаэлиса — Ментен.
Программное обеспечение
ENZO (Кинетика ферментов) – это графический инструмент для построения кинетических моделей ферментативно-катализируемых реакций. ENZO автоматически генерирует соответствующие дифференциальные уравнения на основе заданной схемы ферментативной реакции. Эти дифференциальные уравнения обрабатываются численным решателем и алгоритмом регрессии, который подгоняет коэффициенты дифференциальных уравнений к экспериментально полученным временным кривым. ENZO позволяет быстро оценивать различные схемы реакций и может использоваться для рутинных исследований в области кинетики ферментов.
Сноски
α. Ссылка: Интерактивный учебник по кинетике Майкла-Ментена (требуется Java)
β. Ссылка: механизм дигидрофолатредуктазы (Gif)
γ. Ссылка: механизм ДНК-полимеразы (Gif)
δ. Ссылка: механизм химотрипсина (требуется Flash)