Введение

Энзим

Глутатионредуктаза (GR), также известная как глутатиондисульфидредуктаза (GSR), – это фермент, кодируемый геном GSR у человека. Глутатионредуктаза (EC 1.8.1.7) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (GSSG) до сульфгидрильной формы глутатиона (GSH), который является критически важной молекулой для защиты от окислительного стресса и поддержания восстановительной среды клетки. Глутатионредуктаза функционирует как димерная дисульфидная оксидоредуктаза и использует протезную группу FAD и NADPH для восстановления одного молярного эквивалента GSSG до двух молярных эквивалентов GSH:

Глутатионредуктаза сохраняется во всех царствах живых организмов. У бактерий, дрожжей и животных обнаружен один ген глутатионредуктазы; однако в геномах растений кодируются два гена GR. У дрозофилы и трипаносом глутатионредуктазы отсутствуют. В этих организмах восстановление глутатиона осуществляется либо тиоредоксиновой, либо трипанотионовой системой, соответственно.

Функция

Глутатион играет ключевую роль в поддержании нормальной функции и предотвращении окислительного стресса в клетках человека. Он может выступать в качестве поглотителя гидроксильных радикалов, синглетного кислорода и различных электрофилов. Восстановленный глутатион восстанавливает окисленную форму фермента глутатионпероксидазы, который, в свою очередь, восстанавливает перекись водорода (H2O2) – крайне реактивное соединение внутри клетки. [На следующей иллюстрации окислительно-восстановительных реакций крайняя правая стрелка направлена неправильно; она должна указывать вверх, а не вниз.] Кроме того, глутатион играет ключевую роль в метаболизме и выведении ксенобиотиков, действует как кофактор в некоторых детоксифицирующих ферментах, участвует в транспорте и восстанавливает антиоксиданты, такие как витамины Е и С, до их активных форм. Соотношение GSSG/GSH в клетке является ключевым фактором для поддержания окислительного баланса, то есть, критически важно, чтобы клетка поддерживала высокий уровень восстановленного глутатиона и низкий уровень окисленного глутатиона дисульфида. Этот узкий баланс поддерживается глутатионредуктазой, которая катализирует восстановление GSSG до GSH.

Структура

Глутатионредуктаза из эритроцитов человека — это гомодимер, состоящий из мономеров массой 52 кДа, каждый из которых содержит 3 домена. GR обладает топологией в виде единого листа, состоящего из двух слоев, где антипараллельный бета-лист в значительной степени экспонирован к растворителю с одной стороны и покрыт случайными конформациями с другой. Это включает в себя домен связывания NADPH, домен(ы) связывания FAD и домен димеризации. Каждый мономер содержит 478 аминокислотных остатков и одну молекулу FAD. GR — термостабильный белок, сохраняющий свою активность до 65 °C.

Уменьшающая половина

Действие GR происходит посредством двух различных полуреакций: редуктивной, за которой следует окислительная. В первой полуреакции NADPH восстанавливает FAD, присутствующий в GSR, образуя преходящий анион FADH−. Этот анион затем быстро разрывает дисульфидную связь Cys58–Cys63, формируя недолговечную ковалентную связь и стабильный комплекс переноса заряда между флавином и Cys63. Окисленный NADP+ высвобождается и впоследствии заменяется новой молекулой NADPH. Это завершает так называемую редуктивную половину механизма.

Окислительная половина

В окислительной половине механизма Cys63 нуклеофильно атакует ближайшую сульфидную группу в молекуле GSSG (процесс катализируется His467), что приводит к образованию смешанной дисульфидной связи (GS-Cys58) и аниона GS−. Затем His467 из GSR протонирует анион GS−, высвобождая первую молекулу GSH. Далее Cys63 нуклеофильно атакует сульфидную группу Cys58, высвобождая анион GS−, который, в свою очередь, присоединяет протон растворителя и отщепляется от фермента, тем самым образуя вторую молекулу GSH. Таким образом, на каждую молекулу GSSG и NADPH образуются две молекулы восстановленного GSH, которые могут вновь выступать в качестве антиоксидантов, нейтрализуя активные формы кислорода в клетке.

Ингибирование

В лабораторных условиях глутатионредуктаза ингибируется низкими концентрациями арсенита натрия и метилированных метаболитов арсената, однако в живом организме значительное ингибирование глутатионредуктазы арсенатом натрия наблюдалось только при дозе 10 мг/кг/сутки. Глутатионредуктаза также ингибируется некоторыми флавоноидами – классом пигментов, производимых растениями.

Связь с фавизмом

При фавизме у пациентов отсутствует глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа – фермент пентозофосфатного пути, который восстанавливает NADP+ до NADPH, катализируя при этом превращение глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконо-δ-лактон. У людей с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы доступно меньше NADPH для восстановления окисленного глутатиона посредством глутатионредуктазы. Следовательно, их базовое соотношение окисленного и восстановленного глутатиона значительно выше, чем у пациентов, нормально экспрессирующих глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, что делает их неспособными эффективно справляться с высокими уровнями активных форм кислорода, вызывающими лизис клеток.

Мониторинг активности глутатионредуктазы

Активность глутатионредуктазы используется как индикатор окислительного стресса. Активность можно отслеживать по потреблению NADPH, измеряемому по абсорбции при 340 нм, или образовавшийся GSH можно визуализировать с помощью реактива Эллмана. Альтернативно, активность можно измерить, используя roGFP (редокс-чувствительный зеленый флуоресцентный белок).

В растениях

Как и в клетках человека, глутатионредуктаза помогает защитить растительные клетки от реактивных форм кислорода. В растениях восстановленный глутатион участвует в цикле глутатиона-аскорбата, в котором он восстанавливает дегидроаскорбат – реакционноспособный побочный продукт восстановления перекиси водорода. В частности, глутатионредуктаза играет важную роль в реакции растений на абиотический стресс. Показано, что активность фермента модулируется в ответ на воздействие тяжелых металлов, металлоидов, засоления, засухи, ультрафиолетового излучения и теплового стресса. Джанмеда также идентифицировал NADPH как основной донор электронов для этого фермента. Позднее другие группы подтвердили наличие FAD и тиольной группы, а в 1965 году был предложен первый механизм его действия. Первоначальная структура глутатионредуктазы (с низким разрешением) была определена в 1977 году. Вскоре после этого Шульце и др. опубликовали структуру с разрешением 3Å в 1978 году. С тех пор глутатионредуктаза была всесторонне изучена и в настоящее время является одним из наиболее хорошо изученных ферментов.