Вариации числа копий ДНК и их роль в геноме человека.

Введение

Повторяющиеся вариации ДНК между индивидуумами

Вариация числа копий (CNV) – это явление, при котором участки генома повторяются, и число повторов в геноме различается у разных индивидуумов. Вариация числа копий является типом структурной вариации: в частности, это тип события дупликации или делеции, затрагивающего значительное количество пар оснований. Примерно две трети всего генома человека могут состоять из повторов, и 4,8–9,5% генома человека можно классифицировать как вариации числа копий. У млекопитающих вариации числа копий играют важную роль в создании необходимой вариативности в популяции, а также в определении фенотипа заболеваний. Отсюда и вероятное влияние этих повторов на фенотип.

Типы и хромосомные перестановки

Одним из наиболее известных примеров вариации числа копий является тринуклеотидное повторение CAG в гене, кодирующем белок хантингтин, который вызывает неврологическое заболевание – болезнь Хантингтона. В этом конкретном случае, если число повторов CAG превышает 36 в расширении тринуклеотидного повтора, у индивидуума, скорее всего, разовьется болезнь Хантингтона, и она, вероятно, будет передана его потомству. Считается, что такие короткие повторы часто возникают из-за ошибок в работе полимеразы во время репликации, включая проскальзывание полимеразы, переключение матрицы и переключение вилки репликации, которые будут рассмотрены более подробно далее. Небольшой размер этих повторов делает их уязвимыми для ошибок полимеразы, поскольку повторные участки склонны к неправильному распознаванию, и реплицированные области могут быть реплицированы повторно, что приводит к увеличению числа копий повтора. Кроме того, если эти тринуклеотидные повторы находятся в одной рамке считывания в кодирующей области гена, это может привести к образованию длинной цепи из одной и той же аминокислоты, что потенциально может привести к образованию белковых агрегатов в клетке. Хотя конкретный механизм, регулирующий увеличение или уменьшение числа копий гена AMY1, все еще остается предметом дискуссий, некоторые гипотезы предполагают, что не гомологичное соединение концов или микрогомологичное опосредованное соединение концов, вероятно, ответственны за повторение всего гена. Что касается структурной организации вариаций числа копий, исследования выявили и определили области генома – «горячие точки», где вариации числа копий встречаются в четыре раза чаще. Однако недавние полногеномные исследования показали обратное. Ранее вариации числа копий ассоциировались преимущественно с небольшими тандемными повторами или специфическими генетическими заболеваниями, поэтому изначально их изучали только в контексте конкретных локусов. Тем не менее, технологический прогресс привел к появлению все большего числа высокоточных методов для идентификации и изучения вариаций числа копий. Первоначально вариации числа копий изучались с помощью цитогенетических методов, позволяющих визуализировать физическую структуру хромосом. БАК (BAC) также могут обнаруживать вариации числа копий в точках перестройки, что позволяет выявить 119 новых вариаций числа копий. Анализ последовательностей концов отрезков ДНК предоставляет достаточно информации для выравнивания референсной последовательности с интересующей последовательностью, а любые несовпадения легко обнаруживаются и интерпретируются как вариации числа копий в данной области клона. Основываясь на том, что рекомбинация у человека относительно редка и что многие события рекомбинации происходят в определенных регионах генома, известных как горячие точки рекомбинации, можно использовать неравновесие сцепления для выявления вариаций числа копий. В отличие от методов, основанных на микрочипах, методы обнаружения, основанные на секвенировании, легко идентифицируют другие классы структурных вариаций, такие как инверсии и транслокации.

One of the most well known examples of a short copy number variation is the trinucleotide repeat of the CAG base pairs in the huntingtin gene responsible for the neurological disorder Huntington's disease. For this particular case, once the CAG trinucleotide repeats more than 36 times in a trinucleotide repeat expansion, Huntington's disease will likely develop in the individual and it will likely be inherited by his or her offspring. These types of short repeats are often thought to be due to errors in polymerase activity during replication including polymerase slippage, template switching, and fork switching which will be discussed in detail later. The short repeat size of these copy number variations lends itself to errors in the polymerase as these repeated regions are prone to misrecognition by the polymerase and replicated regions may be replicated again, leading to extra copies of the repeat. In addition, if these trinucleotide repeats are in the same reading frame in the coding portion of a gene, it may lead to a long chain of the same amino acid, possibly creating protein aggregates in the cell, Although the specific mechanism that allows the AMY1 gene to increase or decrease its copy number is still a topic of debate, some hypotheses suggest that the non homologous end joining or the microhomology mediated end joining is likely responsible for these whole gene repeats. In terms of the structural architecture of copy number variations, research has suggested and defined hotspot regions in the genome where copy number variations are four times more enriched. recent genome wide studies have concluded otherwise. Copy number variations were generally associated only with small tandem repeats or specific genetic disorders, therefore, copy number variations were initially only examined in terms of specific loci. However, technological developments led to an increasing number of highly accurate ways of identifying and studying copy number variations. Copy number variations were originally studied by cytogenetic techniques, which are techniques that allow one to observe the physical structure of the chromosome. BACs can also detect copy number variations in rearrangement hotspots allowing for the detection of 119 novel copy number variations. Sequencing end reads would provide adequate information to align the reference sequence to the sequence of interest, and any misalignments are easily noticeable thus concluded to be copy number variations within that region of the clone. Relying on the fact that human recombination is relatively rare and that many recombination events occur in specific regions of the genome known as recombination hotspots, linkage disequilibrium can be used to identify copy number variations. In contrast to array based techniques, sequencing based detection methods readily identify other classes of structural variation such as inversions and translocations.

Молекулярный механизм

Существует два основных типа молекулярных механизмов формирования вариаций числа копий: основанные на гомологии и не основанные на гомологии. Во время мейотической рекомбинации гомологичные хромосомы соединяются в пары и образуют двухсторонние разрывы двойной спирали, приводящие к образованию структур Холлидея. Однако при аберрантном механизме, в процессе формирования структур Холлидея, разрывы двойной спирали смещаются, и кроссинговер происходит в неаллельных позициях на одной и той же хромосоме. При разрешении структуры Холлидея происходит неравный кроссинговер, позволяющий передавать генетический материал между двумя гомологичными хромосомами, в результате чего участок ДНК на обеих хромосомах дуплицируется. Когда в геноме неожиданно возникает разрыв двойной спирали, клетка активирует пути, опосредующие восстановление этого разрыва. Если по какой-либо причине, например, из-за активации рибосомной РНК, нарушается активность когезина, может произойти локальное увеличение ошибок при восстановлении разрывов двойной спирали. Эти механизмы также участвуют в восстановлении разрывов двойной спирали, но не требуют гомологии или ограниченной микро-гомологии. Предполагается, что сестринские хроматиды сливаются, образуя одну дицентрическую хромосому, которая затем разделяется между двумя ядрами. Во время нормальной репликации ДНК полимераза на отстающей цепи должна непрерывно отсоединяться и снова присоединяться к репликативной вилке.

Альфа-амилазный ген

Амилаза – это фермент, содержащийся в слюне, который отвечает за расщепление крахмала до моносахаридов, и один из типов амилазы кодируется геном альфа-амилазы (AMY1). У европейских американцев установлено, что концентрация слюнной амилазы тесно связана с числом копий гена AMY1. Однако в настоящее время нет данных, подтверждающих эту теорию, и поэтому эта гипотеза остаётся лишь предположением. Недавнее происхождение гена AMY1 с множественным числом копий предполагает, что в зависимости от условий окружающей среды число копий гена AMY1 может очень быстро увеличиваться и уменьшаться по сравнению с генами, взаимодействие которых с окружающей средой не столь прямое. Вариации числа копий демонстрируют значительную изменчивость (от 9 до 100% нейронов мозга в разных исследованиях). Большинство изменений составляют от 2 до 10 Мб в размере, при этом количество делеций значительно превышает количество амплификаций. Варианты числа копий в гене RCL1 ассоциированы с различными нейропсихиатрическими фенотипами у детей.

Генетические семейства и естественный отбор

Недавно велись дискуссии о связи вариаций числа копий с семействами генов. Семейства генов определяются как набор родственных генов, выполняющих сходные функции, но имеющих незначительные временные или пространственные различия, и эти гены, вероятно, произошли от одного общего предка. Гены глобина в семействе глобинов хорошо консервативны и отличаются лишь небольшой частью гена, что указывает на их происхождение от общего предка, возможно, в результате дупликации исходного гена глобина. Предполагалось, что эффект дозировки гена, сопутствующий вариациям числа копий, может приводить к негативным последствиям, если нарушаются жизненно важные клеточные функции, поэтому белки, участвующие в клеточных путях, подвергаются сильному очищающему отбору. Объяснялось, что белки на периферии пути взаимодействуют с меньшим числом других белков, и поэтому изменение дозы белка, вызванное изменением числа копий, может оказывать меньшее влияние на общий результат клеточного пути. За последние несколько лет исследователи, кажется, сместили фокус с обнаружения, локализации и секвенирования вариаций числа копий на углубленный анализ роли этих вариаций в геноме человека и в природе в целом. Для дальнейшего подтверждения взаимосвязи между вариациями числа копий и семействами генов, а также роли естественного отбора в формировании этих взаимосвязей и изменений, необходимы дополнительные доказательства. Кроме того, исследователи стремятся выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе вариаций числа копий, поскольку это может раскрыть важную информацию о структурных вариациях в целом. В более широком контексте, область изучения структурных вариаций в геноме человека представляется быстро развивающейся областью исследований. Полученные данные могут не только предоставить дополнительные доказательства эволюции и естественного отбора, но и быть использованы для разработки методов лечения широкого спектра генетических заболеваний.