Транспорт магния: молекулярные механизмы и эволюция белков-переносчиков.

Введение

Транспортеры магния – это белки, которые обеспечивают транспорт магния через клеточную мембрану. Всем формам жизни необходим магний, однако молекулярные механизмы поглощения Mg2+ из окружающей среды и распределения этого жизненно важного элемента внутри организма до сих пор выясняются постепенно. АТФазная функция MgtA сильно зависит от кардиолипина и, как было показано, способна обнаруживать свободный магний в диапазоне мкМ.

У бактерий Mg2+ вероятно в основном поставляется белком CorA, а при его отсутствии – белком MgtE. У дрожжей начальное поглощение осуществляется посредством белков Alr1p и Alr2p, но на данном этапе единственным идентифицированным белком, распределяющим Mg2+ внутри клетки, является Mrs2p. У простейших был идентифицирован только один транспортер Mg2+ (XntAp). У метазоа были обнаружены гомологи белков Mrs2p и MgtE, а также две новые системы транспорта Mg2+ – TRPM6/TRPM7 и PCLN1. Наконец, у растений идентифицировано семейство гомологов Mrs2p вместе с другим новым белком AtMHX.

Эволюция

Эволюция транспорта Mg2+ оказалась довольно сложной. Белки, по-видимому, основанные на MgtE, присутствуют у бактерий и метазоа, но отсутствуют у грибов и растений, в то время как белки, по-видимому, связанные с CorA, обнаружены во всех этих группах. Два активных транспортных белка, присутствующих у бактерий, MgtA и MgtB, не проявляют гомологии в высших организмах. Также существуют системы транспорта Mg2+, которые встречаются только в высших организмах.

Типы

Существует большое количество белков, которые еще предстоит идентифицировать и которые транспортируют Mg2+. Даже в наиболее изученных эукариотах, дрожжах, Боррелли сообщил об Mg2+/H+ антипортере без ассоциированного белка, который, вероятно, локализован в аппарате Гольджи. По крайней мере, один крупный транспортер Mg2+ в дрожжах остается невыясненным – тот, который влияет на транспорт Mg2+ внутрь и наружу вакуоли дрожжей. В более высокоорганизованных многоклеточных организмах, по-видимому, многие белки, транспортирующие Mg2+, еще предстоит открыть. Транспортеры Mg2+, содержащие домен CorA (CorA, Alr-подобные и Mrs2-подобные), имеют схожий, но не идентичный спектр сродства к двухвалентным катионам. На самом деле, это наблюдение можно распространить на все транспортеры Mg2+, идентифицированные на сегодняшний день. Это сходство позволяет предположить, что основные свойства Mg2+ сильно влияют на возможные механизмы распознавания и транспорта. Однако это также указывает на то, что использование других ионов металлов в качестве трассеров для поглощения Mg2+ не обязательно даст результаты, сопоставимые со способностью транспортера транспортировать Mg2+. В идеале Mg2+ следует измерять напрямую. Поскольку 28Mg2+ практически недоступен, значительная часть старых данных потребует переинтерпретации с использованием новых инструментов для измерения транспорта Mg2+, если различные транспортеры будут сравниваться напрямую. Пионерская работа Колисека и Фрошауэра с использованием mag-fura 2 показала, что свободный Mg2+ может быть надежно измерен in vivo в некоторых системах. Вернувшись к анализу CorA с помощью этого нового инструмента, мы получили важную отправную точку для анализа новых систем транспорта Mg2+ по мере их открытия. Однако важно точно определять количество транспортера, присутствующего в мембране, если планируется сравнивать транспортные возможности. Эта бактериальная система также может оказаться полезной для анализа эукариотических белков транспорта Mg2+, но различия в биологических системах прокариот и эукариот должны учитываться в любом эксперименте.

Функция

Сравнение функций исследованных транспортных белков Mg2+ в настоящее время практически невозможно, несмотря на то, что эти белки изучались в различных биологических системах с использованием разных методологий и технологий. Обнаружение системы, в которой можно было бы напрямую сравнить все белки, стало бы значительным прорывом. Если бы удалось продемонстрировать функциональность этих белков в бактериях (S. typhimurium), то сочетание методов с использованием mag-fura 2, количественной оценки белка в оболочечной мембране и определения структуры белков (рентгеноструктурный анализ или крио-ЭМ) могло бы позволить установить основные механизмы, задействованные в распознавании и транспорте иона Mg2+. Однако, возможно, наиболее важным достижением была бы разработка методов, позволяющих измерять функцию белка в системе патч-клэмпа с использованием искусственных мембран.

Ранние исследования

В 1968 году Ласк описал ограничение роста бактерий (Escherichia coli) на средах с низким содержанием Mg2+, предположив, что бактериям необходим Mg2+ и они, вероятно, активно поглощают этот ион из окружающей среды. В следующем году та же группа и группа Silver независимо друг от друга описали поглощение и выведение Mg2+ в метаболически активных клетках E. coli, используя 28Mg2+. К концу 1971 года были опубликованы две статьи, описывающие влияние Co2+, Ni2+ и Mn2+ на транспорт Mg2+ в E. coli, Aerobacter aerogenes и Bacillus megaterium. В последнем значительном достижении перед клонированием генов, кодирующих транспортеры, было обнаружено, что существует вторая система поглощения Mg2+, демонстрирующая сходную аффинность и кинетику транспорта с первой системой, но обладающая иным диапазоном чувствительности к конкурирующим катионам. Эта система также подавлялась высокими внеклеточными концентрациями Mg2+.

Кора

Ген CorA и соответствующий ему белок являются наиболее тщательно изученной системой транспорта Mg2+ в любом организме. Большая часть опубликованной литературы о гене CorA исходит из лаборатории М. Э. Магуайра. Недавно группа Р. Швейена оказала значительное влияние на понимание транспорта Mg2+ посредством CorA. Ген был первоначально назван в честь кобальтоустойчивого фенотипа у E. coli, вызванного инактивацией гена. Было показано, что ген CorA присутствует у 17 граммотрицательных бактерий. С появлением большого количества полных последовательностей геномов прокартиот, было установлено, что CorA практически повсеместно распространен среди эубактерий, а также широко распространен среди архей. Локус CorA у E. coli содержит единственную открытую рамку считывания из 948 нуклеотидов, кодирующую белок из 316 аминокислот. Этот белок хорошо консервативен среди эубактерий и архей. Белки E. coli и S. typhimurium идентичны на 98%, но у более отдалённо родственных видов сходство снижается до 15–20%. Однако недавние данные свидетельствуют о том, что активность белка может регулироваться двухкомпонентной регуляторной системой PhoPQ. Этот сенсор реагирует на низкие внешние концентрации Mg2+ в процессе инфицирования S. typhimurium у человека. В условиях низкого внешнего содержания Mg2+ система PhoPQ подавляет функцию CorA, и ранее было показано, что транскрипция альтернативных транспортеров Mg2+ MgtA и MgtB активируется в этих условиях. На рисунке (не в масштабе) представлена первоначально опубликованная трансмембранная (ТМ) топология доменов белка CorA из S. typhimurium, который, как сообщалось, имеет три трансмембранных участка в C-концевом участке белка (показано синим цветом), как определено Smith et al. Доказательства того, что CorA действует как гомотетрамер, были опубликованы Warren et al. в 2004 году. В декабре 2005 года кристаллическая структура канала CorA была размещена в базе данных структур белков RSCB. Результаты показали, что белок имеет два ТМ-домена и существует как гомопентамер, что противоречит более ранним сообщениям. Перейдите по этой ссылке, чтобы увидеть структуру в 3D. Растворимые внутриклеточные части белка сильно заряжены, содержат 31 положительно заряженный и 53 отрицательно заряженных остатка. Напротив, ТМ-домены содержат только одну заряженную аминокислоту, которая, как было показано, не важна для активности транспортера. Эксперименты по мутагенезу показали, что механизм транспорта Mg2+ зависит от гидроксильных групп, выстилающих внутреннюю часть транспортного канала; также требуется мотив GMN (показан красным цветом). Прежде чем активность CorA могла быть изучена in vivo, все другие системы транспорта Mg2+ у бактериального хозяина должны были быть идентифицированы и инактивированы или удалены (см. ниже). Был сконструирован штамм S. typhimurium, содержащий функциональный ген CorA, но не содержащий MgtA и MgtB (см. также ниже), и проанализирована кинетика поглощения транспортера. Этот штамм показал почти нормальную скорость роста на стандартных средах (50 мкМ Mg2+), но удаление всех трех генов создало бактериальный штамм, требующий 100 мМ внешнего Mg2+ для нормального роста, хотя с более низкими аффинностями (Km) и скоростями (Vmax), чем для Mg2+ (см. таблицу). Значения Km для Co2+ и Ni2+ значительно выше, чем ожидаемые в нормальной клеточной среде, поэтому маловероятно, что транспортная система CorA опосредует поглощение этих ионов в естественных условиях. Гексааммин кобальта(III), Co(III)Hex, является ковалентно связанным (нелабильным) аналогом первой гидратационной оболочки для нескольких двухвалентных катионов, включая Mg2+. Радиус молекулы Co(III)Hex составляет 244 пм, что очень близко к радиусу 250 пм первой гидратационной оболочки Mg2+. Этот аналог является мощным ингибитором транспортной системы CorA, более сильным, чем Mg2+, Co2+ или Ni2+. Дополнительная сила ингибирования Co(III)Hex может быть связана с блокировкой транспортного канала из-за неспособности белка «дегидратировать» субстрат. Также было показано, что Co(III)Hex не транспортируется в клетки. Хотя ни один из генов не требуется для патогенности, белок MgtB повышает долгосрочную выживаемость патогена в клетке. Гены также повышаются in vitro, когда концентрация Mg2+ падает ниже 50 мкМ (Snavely et al., 1991a). Хотя белки имеют значения Km, аналогичные CorA, и скорость транспорта примерно в 10 раз меньше, гены могут быть частью системы извлечения Mg2+. Chamnongpol и Groisman (2002) приводят доказательства того, что роль этих белков может заключаться в компенсации инактивации белка CorA регулоном PhoPQ, и ни один из генов не проявляет сходства с CorA. Белки MgtA и MgtB имеют 75% сходства (50% идентичны), хотя, по-видимому, MgtB был приобретен посредством горизонтального переноса генов как часть Salmonella Pathogenicity Island 3. Экспериментально определена ТМ-топология белка MgtB, показывающая, что белок имеет десять ТМ-спиралей, с терминалями белка в цитоплазме (см. рисунок). MgtA присутствует в широко различающихся бактериях, но встречается не так часто, как CorA, в то время как распространение MgtB, по-видимому, довольно ограничено. Гипотез относительно необычного распространения не предлагалось. Рисунок, адаптированный из Smith et al. (1993b), показывает экспериментально определенную мембранную топологию белка MgtB в S. typhimurium. ТМ-домены показаны светло-синим цветом, а ориентация в мембране и положение N- и C-терминалей указаны. Рисунок не приведен в масштабе. Хотя белки MgtA и MgtB очень похожи, они демонстрируют некоторые незначительные различия в активности. MgtB очень чувствителен к температуре, теряя всю активность (в отношении транспорта Mg2+) при температуре 20 °C. Для определения физиологической функции этих белков потребуются дальнейшие эксперименты.

The CorA gene and its corresponding protein are the most exhaustively studied Mg2+ transport system in any organism. Most of the published literature on the CorA gene comes from the laboratory of M. E. Maguire. Recently the group of R. J. Schweyen made a significant impact on the understanding of Mg2+ transport by CorA. The gene was originally named after the cobalt resistant phenotype in E. coli that was caused by the gene's inactivation. that the CorA gene was present in 17 gram negative bacteria. With the large number of complete genome sequences now available for prokaryotes, CorA has been shown to be virtually ubiquitous among the Eubacteria, as well as being widely distributed among the Archaea. The CorA locus in E. coli contains a single open reading frame of 948 nucleotides, producing a protein of 316 amino acids. This protein is well conserved amongst the Eubacteria and Archaea. Between E. coli and S. typhimurium, the proteins are 98% identical, but in more distantly related species, the similarity falls to between 15 and 20%. However, recent evidence suggests that the activity of the protein may be regulated by the PhoPQ two component regulatory system. This sensor responds to low external Mg2+ concentrations during the infection process of S. typhimurium in humans. In low external Mg2+ conditions, the PhoPQ system was reported to suppress the function of CorA and it has been previously shown that the transcription of the alternative Mg2+ transporters MgtA and MgtB is activated in these conditions. The figure (not to scale) shows the originally published transmembrane (TM) domain topology of the S. typhimurium CorA protein, which was said to have three membrane spanning regions in the C terminal part of the protein (shown in blue), as determined by Smith et al Evidence for CorA acting as a homotetramer was published by Warren et al. in 2004. In December 2005 the crystal structure of the CorA channel was posted to the RSCB protein structure database. The results showed that the protein has two TM domains and exists as a homopentamer, in direct conflict with the earlier reports. Follow this link to see the structure in 3D. The soluble intracellular parts of the protein are highly charged, containing 31 positively charged and 53 negatively charged residues. Conversely, the TM domains contain only one charged amino acid, which has been shown to be unimportant in the activity of the transporter. From mutagenesis experiments, it appears that the chemistry of the Mg2+ transport relies on the hydroxyl groups lining the inside of the transport pore; there is also an absolute requirement for the GMN motif (shown in red). Before the activity of CorA could be studied in vivo, any other Mg2+ transport systems in the bacterial host had to be identified and inactivated or deleted (see below). A strain of S. typhimurium containing a functional CorA gene but lacking MgtA and MgtB was constructed(also see below), and the uptake kinetics of the transporter were analysed. This strain showed nearly normal growth rates on standard media (50 μM Mg2+), but the removal of all three genes created a bacterial strain requiring 100 mM external Mg2+ for normal growth. although with lower affinities (km) and velocities (Vmax) than for Mg2+ (see table). The km values for Co2+ and Ni2+ are significantly above those expected to be encountered by the cells in their normal environment, so it is unlikely that the CorA transport system mediates the uptake of these ions under natural conditions. Cobalt (III) hexaammine, Co(III)Hex, is a covalently bound (non labile) analog for the first shell of hydration for several divalent cations, including Mg2+. The radius of the Co(III)Hex molecule is 244 pm, very similar to the 250 pm radius of the first hydration shell of Mg2+. This analog is a potent inhibitor of the CorA transport system, more so than Mg2+, Co2+ or Ni2+. The additional strength of the Co(III)Hex inhibition might come from the blocking of the transport pore due to the inability of the protein to ‘dehydrate’ the substrate. It was also shown that Co(III)Hex was not transported into the cells, Although neither gene is required for pathogenicity, the MgtB protein does enhance the long term survival of the pathogen in the cell. The genes are also upregulated in vitro when the Mg2+ concentration falls below 50 μM (Snavely et al., 1991a). Although the proteins have km values similar to CorA and transport rates approximately 10 times less, the genes may be part of a Mg2+ scavenging system. Chamnongpol and Groisman (2002) presents evidence that the role of these proteins may be to compensate for the inactivation of the CorA protein by the PhoPQ regulon. and neither gene shows any similarity to CorA. The MgtA and MgtB proteins are 75% similar (50% identical), although it seems that MgtB may have been acquired by horizontal gene transfer as part of Salmonella Pathogenicity Island 3. The TM topology of the MgtB protein has been experimentally determined, showing that the protein has ten TM spanning helices with the termini of the protein in the cytoplasm (see figure
). MgtA is present in widely divergent bacteria, but is not nearly as common as CorA, while MgtB appears to have a quite restricted distribution. No hypotheses for the unusual distribution have been suggested. The figure, adapted from Smith et al. (1993b), shows the experimentally determined membrane topology of the MgtB protein in S. typhimurium. The TM domains are shown in light blue and the orientation in the membrane and the positions of the N and C termini are indicated. The figure is not drawn to scale. While the MgtA and MgtB proteins are very similar, they do show some minor differences in activity. MgtB is very sensitive to temperature, losing all activity (with regard to Mg2+ transport) at a temperature of 20 °C. Further experiments will be required to define the physiological function of these proteins.

МГТЭ

В двух статьях описывается MgtE, четвертый белок поглощения Mg2+ у бактерий, не связанный с MgtA/B или CorA. Рисунок (справа), адаптированный из Smith et al. (1995), указывает ориентацию в мембране и положения N- и C-концов. Эта фигура не выполнена в масштабе. Структура этого транспортера недавно была определена методом рентгеновской кристаллографии. Ген MgtE был впервые идентифицирован Smith et al. (1995) при скрининге на белки, подобные CorA, у бактерий, и комплементирует дефицитный по поглощению Mg2+ штамм S. typhimurium MM281 (corA mgtA mgtB), восстанавливая рост дикого типа на стандартных средах. Это сместило акцент на поглощение металлических катионов, показав, что дрожжи поглощают катионы со следующей серией сродства: Mg2+, Co2+, Zn2+ > Mn2+ > Ni2+ > Ca2+ > Sr2+. Кроме того, было предположено, что транспорт различных катионов осуществляется посредством одной и той же транспортной системы – ситуация, очень похожая на ту, что наблюдается у бактерий. В 1998 году MacDiarmid и Gardner окончательно идентифицировали белки, ответственные за наблюдаемый фенотип катионного транспорта в Saccharomyces cerevisiae, на основании исследований мутагенеза, что сделало TM-топологию этих белков более похожей на топологию CorA (см. рисунок). Также Alr1p содержит консервативный мотив GMN на внешнем конце TM 2 (TM 2') и мутация метионина (M) в этом мотиве в лейцин (L) привела к потере транспортной способности. Локализация Alr1p наблюдалась как интернализация и деградация в вакуоли в ответ на внеклеточные катионы. Mg2+ при очень низких внеклеточных концентрациях (100 мкМ; < 10% содержания Mg2+ в стандартной среде) и Co2+ и Mn2+ при относительно высоких концентрациях (> 20× стандартная среда) индуцировали изменение локализации белка Alr1p, и эффект зависел от функциональной убиквитинации, эндоцитоза и вакуолярной деградации. Salih et al., в подготовке. Кинетика поглощения Mg2+ Alr1p была исследована методами электрофизиологии на целых клетках дрожжей, что позволяет предположить, что несколько систем внутри дрожжей транспортируют Mg2+ в хранилища. Этот внутренний транспорт, вероятно, маскирует процесс поглощения. Экспрессия ALR1 в S. typhimurium без генов поглощения Mg2+ может быть альтернативой, но, как отмечалось ранее, необходимо учитывать эффекты гетерологичной системы экспрессии.

Two papers describe MgtE, a fourth Mg2+ uptake protein in bacteria unrelated to MgtA/B or CorA. The figure (right), adapted from Smith et al. (1995) The orientation in the membrane and the positions of the N and C termini are indicated. This figure is not drawn to scale. This transporter has recently had its structure solved by x ray crystallography. The MgtE gene was first identified by Smith et al. (1995) during a screen for CorA like proteins in bacteria and complements the Mg2+ uptake deficient S. typhimurium strain MM281 (corA mgtA mgtB), restoring wild type growth on standard media. shifted the focus more towards the uptake of the metal cations, showing that yeast take up cations with the following affinity series; Mg2+, Co2+, Zn2+ > Mn2+ > Ni2+ > Ca2+ > Sr2+. Additionally, it was suggested that the transport of the different cations is mediated by the same transport system — a situation very much like that in bacteria. In 1998, MacDiarmid and Gardner finally identified the proteins responsible for the observed cation transport phenotype in Saccharomyces cerevisiae. on the strength of mutagenesis studies, making the TM topology of these proteins more like that of CorA (see figure). Also, Alr1p contains the conserved GMN motif at the outside end of TM 2 (TM 2') and the mutation of the methionine (M) in this motif to a leucine (L) led to the loss of transport capability. The localisation of the Alr1p was observed to be internalised and degraded in the vacuole in response to extracellular cations. Mg2+, at very low extracellular concentrations (100 μM; < 10% of the standard media Mg2+ content), and Co2+ and Mn2+ at relatively high concentrations (> 20× standard media), induced the change in Alr1p protein localisation, and the effect was dependent on functional ubiquitination, endocytosis and vacuolar degradation. Salih et al., in prep. The kinetics of Mg2+ uptake by Alr1p have been investigated by electrophysiology techniques on whole yeast cells. suggesting that multiple systems inside the yeast are transporting Mg2+ into storage compartments. This internal transport will very likely mask the uptake process. The expression of ALR1 in S. typhimurium without Mg2+ uptake genes may be an alternative, but, as stated earlier, the effects of a heterologous expression system would need to be taken into account.

МНР2

Ген MNR2 кодирует белок, тесно связанный с белками Alr, но включает консервативные особенности, определяющие отдельную подгруппу белков CorA в геномах грибов, что указывает на отличную роль в гомеостазе Mg2+. Как и в случае мутанта alr1, рост мутанта mnr2 был чувствителен к условиям дефицита Mg2+, однако у мутанта mnr2 наблюдалось накопление большего количества Mg2+, чем у штамма дикого типа в этих условиях. Эти фенотипы позволяют предположить, что Mnr2 может регулировать хранение Mg2+ внутриклеточного компартмента. В соответствии с этой интерпретацией, белок Mnr2 был локализован на мембране вакуоли – внутреннего компартмента, участвующего в хранении избытка минеральных питательных веществ у дрожжей. Непосредственная роль Mnr2 в транспорте Mg2+ была предложена на основании наблюдения, что повышенная экспрессия Mnr2, которая перенаправляла часть белка Mnr2 на клеточную поверхность, также подавляла потребность в Mg2+ у двойного мутантного штамма alr1 alr2. Мутация mnr2 также изменяла накопление других двухвалентных катионов, что позволяет предположить, что эта мутация может увеличивать экспрессию генов Alr или активность белка. Недавние работы, клонированные и секвенированные Wiesenberger et al. (1992), показали, что Mrs2p не был идентифицирован как предполагаемый транспортер Mg2+ до Bui et al. (1999). Было показано, что транспорт Mg2+ непосредственно опосредован Mrs2p еще до клонирования гена Haynes et al. (2002).) и человеческими транспортными белками растворенных веществ SLC24 (K+ зависимый Na+/Ca2+ обмениватель). XntAp в равной степени похож на белковые семейства SLC8 и SLC24 по аминокислотной последовательности, но предсказанная TM-топология больше напоминает SLC24, хотя сходство в лучшем случае слабое, а родство – очень отдаленное. TM-домены показаны светло-синим цветом, домены α1 и α2 – зеленым. Указана ориентация в мембране и положение N- и C-концов, а рисунок не выполнен в масштабе. Зависимые от Mg2+ токи, переносимые XntAp, кинетически напоминают токи канального белка и имеют порядок селективности ионов Mg2+ > Co2+, Mn2+ > Ca2+ – серию, также очень похожую на CorA.

The MNR2 gene encodes a protein closely related to the Alr proteins, but includes conserved features that define a distinct subgroup of CorA proteins in fungal genomes, suggesting a distinct role in Mg2+ homeostasis. Like an alr1 mutant, growth of an mnr2 mutant was sensitive to Mg2+ deficient conditions, but the mnr2 mutant was observed to accumulate more Mg2+ than a wild type strain under these conditions. These phenotypes suggested that Mnr2 may regulate Mg2+ storage within an intracellular compartment. Consistent with this interpretation, the Mnr2 protein was localized to the membrane of the vacuole, an internal compartment implicated in the storage of excess mineral nutrients by yeast. A direct role of Mnr2 in Mg2+ transport was suggested by the observation that increased Mnr2 expression, which redirected some Mnr2 protein to the cell surface, also suppressed the Mg2+ requirement of an alr1 alr2 double mutant strain. The mnr2 mutation also altered accumulation of other divalent cations, suggesting this mutation may increase Alr gene expression or protein activity. Recent work and was cloned and sequenced by Wiesenberger et al. (1992). Mrs2p was not identified as a putative Mg2+ transporter until Bui et al. (1999). Mg2+ transport has been shown to be directly mediated by Mrs2p, before the gene was cloned by Haynes et al. (2002).) and SLC24 (K+ dependent Na+/Ca2+ exchanger) human solute transport proteins. The XntAp is equally similar to the SLC8 and SLC24 protein families by amino acid sequence, but the predicted TM topology is more like that of SLC24, but the similarity is at best weak and the relationship is very distant. The TM domains are shown in light blue, the α1 and α2 domains are shown in green. The orientation in the membrane and the positions of the N and C termini are indicated and the figure is not drawn to scale. The Mg2+ dependent currents carried by XntAp are kinetically like that of a channel protein and have an ion selectivity order of Mg2+ > Co2+, Mn2+ > Ca2+ — a series again very similar to that of CorA.

MRS2

Биоинформатический поиск в базах данных последовательностей выявил один гомолог гена MRS2 дрожжей у широкого спектра метазоев. Был проведен обзор исследований генов TRP, а второй обзор Монтелла (2003) посвящен исследованиям генов TRPM. Семейство ионных каналов TRPM представлено во всех метазоях. Белки TRPM6 и TRPM7 весьма необычны, поскольку содержат как домен ионного канала, так и домен киназы (рис. 1.7), роль которых является предметом наиболее ожесточенных дискуссий. Однако в присутствии TRPM6 ряд сродства транспортируемых катионов помещает Mg2+ выше Ca2+. Различия в зарегистрированной проводимости были обусловлены паттернами экспрессии этих генов. TRPM7 экспрессируется во всех исследованных типах клеток, в то время как TRPM6 демонстрирует более ограниченный паттерн экспрессии. Неудачный выбор экспериментальной системы Voets et al. (2004) привел к заключению о том, что TRPM6 является функциональным транспортером Mg2+. Однако последующие работы Chubanov et al. (2004) и Montell et al. (2002) показали,

Ген Claudin 16 был клонирован Simon et al. (1999). Паттерн экспрессии гена был определен с помощью RT-PCR и оказался очень четко локализованным в непрерывном участке почечной трубки, простирающемся от толстой нисходящей ветви мозгового вещества до дистальной извитой трубки, что укрепляет связь между геном и поглощением Mg2+.

Растения

Современные знания о молекулярных механизмах транспорта Mg2+ в растениях весьма ограничены, и лишь в трех публикациях сообщается о молекулярных основах транспорта Mg2+ у растений. Эти значения имеют физиологическое значение, поскольку несколько мембран в растениях поддерживают ΔΨ в этом диапазоне. Однако автору было сложно воспроизвести эти результаты из-за видимой "гибели" ооцитов, содержащих белок AtMRS2 11, и поэтому к этим результатам следует относиться с осторожностью. Транспортер AtMRS2 10 был проанализирован с использованием анализа поглощения радиоактивного трассера. То, как регулируется транспорт Mg2+ этим белком, не было установлено. Наблюдалось прохождение тока через белок в обоих направлениях, но для транспорта Mg2+ наружу требовался "цитоплазматический" pH 5,5, что не встречается в растительных клетках в нормальных условиях. Помимо транспорта Mg2+, Shaul et al. (1999) также показали, что этот белок способен транспортировать Zn2+ и Fe2+, но не сообщали о способности белка транспортировать другие двухвалентные катионы (например, Co2+ и Ni2+) или его чувствительности к ингибированию гексааммин-комплексом кобальта(III). Детальная кинетика транспорта Mg2+ для AtMHX не определена. Однако продемонстрированы физиологические эффекты. Когда растения A. thaliana были трансформированы конструкциями сверхэкспрессии гена AtMHX под контролем промотора CaMV 35S, растения накапливали белок и проявляли фенотип некротических поражений на листьях, что, по мнению авторов, вызвано нарушением нормальной функции вакуоли, учитывая их наблюдение о том, что общее содержание Mg2+ (или Zn2+) в трансгенных растениях не изменилось. Изображение адаптировано из работ Shaul et al. (1999) и Quednau et al. (2004), и в сочетании с анализом с использованием HMMTOP, на рисунке представлена компьютерная модель предсказанной топологии мембраны белка AtMHX у Arabidopsis thaliana. На данный момент представленная топология следует рассматриваться как предварительную гипотезу. ТМ-домены показаны светло-голубым цветом, указана ориентация в мембране и положение N- и C-концов, а рисунок не выполнен в масштабе. Домены α1 и α2, показанные зеленым цветом, достаточно гидрофобны и могут быть внедрены в мембрану.

The current knowledge of the molecular mechanisms for Mg2+ transport in plants is very limited, with only three publications reporting a molecular basis for Mg2+ transport in plants. These values are physiologically significant, as several membranes in plants maintain ΔΨ in this range. However, the author had difficulty reproducing these results due to an apparent "death" of oocytes containing the AtMRS2 11 protein, and therefore these results should be viewed with caution. The AtMRS2 10 transporter has been analysed using radioactive tracer uptake analysis. How the transport of Mg2+ by the protein is regulated was not determined. Currents were observed to pass through the protein in both directions, but the Mg2+ out current required a ‘cytoplasmic’ pH of 5.5, a condition not found in plant cells under normal circumstances. In addition to the transport of Mg2+, Shaul et al. (1999) also showed that the protein could transport Zn2+ and Fe2+, but did not report on the capacity of the protein to transport other divalent cations (e. g. Co2+ and Ni2+) or its susceptibility to inhibition by cobalt (III) hexaammine. The detailed kinetics of Mg2+ transport have not been determined for AtMHX. However, physiological effects have been demonstrated. When A. thaliana plants were transformed with overexpression constructs of the AtMHX gene driven by the CaMV 35S promoter, the plants over accumulated the protein and showed a phenotype of necrotic lesions in the leaves, which the authors suggest is caused by a disruption in the normal function of the vacuole, given their observation that the total Mg2+ (or Zn2+) content of the plants was not altered in the transgenic plants. The image has been adapted from Shaul et al. (1999) and Quednau et al. (2004), and combined with an analysis using HMMTOP, this figure shows the computer predicted membrane topology of the AtMHX protein in Arabidopsis thaliana. At this time the topology shown should be considered a tentative hypothesis. The TM domains are shown in light blue, the orientation in the membrane and the positions of the N and C termini are indicated, and the figure is not drawn to scale. The α1 and α2 domains, shown in green, are both quite hydrophobic and may both be inserted into the membrane.