Метод CLIP и его варианты для идентификации сайтов связывания РНК-белков

Введение

Метод, используемый в молекулярной биологии. Кросс-линкинг и иммунопреципитация (CLIP, или CLIP-seq) – это метод, применяемый в молекулярной биологии, сочетающий УФ-кросс-линкинг с иммунопреципитацией для идентификации сайтов связывания РНК с белками в масштабе всего транскриптома, что расширяет наше понимание посттранскрипционных регуляторных сетей. CLIP может быть использован как с антителами к эндогенным белкам, так и с распространенными пептидными метками (включая FLAG, V5, HA и другие), либо с аффинной очисткой, что позволяет проводить профилирование модельных организмов или РБП, для которых не существует подходящих антител.

Рабочий процесс

CLIP начинается с образования перекрестных связей между комплексами РНК и белков in vivo с использованием ультрафиолетового света (УФ). Под воздействием УФ-излучения между белками и нуклеиновыми кислотами, находящимися на близком расстоянии (порядка ангстрем), формируются ковалентные связи. Затем кросс-связанные клетки лизируют, РНК фрагментируют, а интересующий белок выделяют с помощью иммунопреципитации. Для обеспечения возможности инициации обратной транскрипции к 3'-концам лигируются РНК-адаптеры, а фрагменты РНК маркируются для анализа комплексов РНК-белок после их отделения от свободной РНК с использованием электрофореза в геле и переноса на мембрану. Далее проводится деградация протеиназой K для удаления белка из перекрестно-связанной РНК, что оставляет несколько аминокислот в месте перекрестной связи. Это часто приводит к усечению кДНК в месте перекрестной связи с нуклеотидом, что используется в вариантах, таких как iCLIP, для повышения разрешения метода. Затем кДНК синтезируется с помощью РТ-ПЦР, после чего следует высокопроизводительное секвенирование, сопоставление полученных ридов с транскриптомом и другие вычислительные анализы для изучения сайтов взаимодействия.

eCLIP

eCLIP (улучшенное перекрестное связывание и иммунопреципитация с последующим высокопроизводительным секвенированием) также используется для картирования сайтов связывания РБП на РНК в масштабе всего транскриптома. eCLIP был разработан для улучшения метода iCLIP за счет повышения эффективности преобразования очищенных фрагментов РНК в библиотеку кДНК. При публикации сообщалось, что eCLIP увеличивает эту эффективность более чем в 1000 раз, что не только снижает потери при секвенировании дубликатов молекул ПЦР, но и значительно уменьшает количество неудачных экспериментов в ходе процедуры CLIP. Кроме того, амплификация в eCLIP теперь сопоставима с амплификацией при секвенировании РНК, что позволяет проводить строгую количественную нормализацию по отношению к парным контрольным образцам (для удаления фонового сигнала от рибосомальных и других высокоабundantных РНК), а также количественно сравнивать пики и образцы, что дает возможность обнаруживать аллель-специфическое связывание или дифференциальное связывание РНК в различных условиях. Как и в других методах CLIP, eCLIP основан на ковалентно связанных взаимодействиях РБП с РНК, образующихся при УФ-перекрестном сшивании живых клеток. Затем клетки лизируют, а РНК фрагментируют с помощью ограниченного воздействия РНКазы. Специфический РБП (и связанная с ним РНК) затем иммунопреципитируют с помощью антитела, специфически распознающего целевой РБП. После лигации 3'-адаптера РНК иммунопреципитированный материал (а также парный контрольный образец) подвергают электрофорезу в денатурирующих белковых гелях и переносят на нитроцеллюлозные мембраны. С мембраны вырезают участок от размера белка до 75 кДа и обрабатывают протеиназой K для высвобождения РНК. После очистки РНК обратную транскрипцию проводят в одноцепочечную ДНК (ssDNA), к которой затем лигируют второй адаптер. Лигируя второй адаптер к кДНК, eCLIP может идентифицировать укороченные кДНК, как и iCLIP, и тем самым изучать сайты взаимодействия белка с РНК с высоким разрешением. Затем используют амплификацию ПЦР для получения достаточного количества материала для высокопроизводительного секвенирования. eCLIP также можно использовать для идентификации мишеней микроРНК и профилирования модификаций РНК, таких как m6A. Наборы данных eCLIP были созданы для более чем 150 РБП с использованием валидированных коммерчески доступных антител.

eCLIP (enhanced CrossLinking and ImmunoPrecipitation followed by high throughput sequencing) is also used to map RBP binding sites on RNAs transcriptome wide. eCLIP was designed to improve upon iCLIP by increasing the efficiency in converting purified RNA fragments into cDNA library. At its publication, eCLIP was reported to increase such efficiency by >1000 fold, which not only decreases wasted sequencing of PCR duplicate molecules, but also dramatically decreases experimental failures during the CLIP procedure. Additionally, the amplification in eCLIP is now comparable to RNA seq, enabling rigorous quantitative normalization against paired input controls (to remove background at ribosomal and other highly abundant RNAs) as well as quantitative comparison across peaks and samples, enabling the ability to detect allele specific binding or differential RNA binding between conditions. As in other CLIP methods, eCLIP relies on RBP RNA interactions covalently linked using UV crosslinking of live cells. Cells are then lysed, and RNA is fragmented using limited RNase treatment. A specific RBP (and its bound RNA) is then immunoprecipitated using an antibody that specifically recognizes the targeted RBP. After ligation of a 3’ RNA adapter, immunoprecipitated material (as well as a paired input sample) are run on denaturing protein gels and transferred to nitrocellulose membranes. A region from the protein size to 75 kDa above is cut from the membrane and treated with Proteinase K to release RNA. After cleanup, RNA is then reverse transcribed to ssDNA, when a second adapter is ligated. By ligating the second adapter to cDNAs, eCLIP can identify truncated cDNAs, similar to iCLIP, and thereby study RNA protein interaction sites with high resolution. PCR amplification is then used to obtain sufficient material for high throughput sequencing. eCLIP can also be used to identify miRNA targets and profile RNA modifications such as m6A. eCLIP datasets have been produced for over 150 RBPs with validated commercially available antibodies.

Другие методы CLIP

sCLIP (простой CLIP) – это методика, требующая меньшего количества исходной РНК и не включающая радиоактивную маркировку иммунопреципитированной РНК. Метод основан на линейном усилении иммунопреципитированной РНК, что повышает сложность библиотеки секвенирования, несмотря на значительное уменьшение количества исходного материала и исключение нескольких этапов очистки. Кроме того, он позволяет визуализировать иммунопреципитированную РНК без использования радиоактивных изотопов, применяя высокочувствительную биотин-основанную маркировку. В сочетании с биоинформатической платформой, этот метод предназначен для получения глубоких знаний о взаимодействиях РНК-белок в биомедицинских исследованиях, где количество исходного материала часто ограничено (например, в случае ценных клинических образцов). Также разработаны дополнительные варианты iCLIP, сохраняющие разрешение на уровне отдельных нуклеотидов, но отличающиеся одним или несколькими этапами от оригинального метода iCLIP. К ним относятся iCLIP2, irCLIP, iiCLIP и iCLIP1.5, и это лишь некоторые из них. В качестве модификации CLIP, метилированные участки РНК идентифицировались с использованием мутантного фермента или антител, специфичных к модификации, посредством методов, известных как miCLIP или m6A CLIP. Оптимизация определенных этапов затруднена и часто характеризуется низкой эффективностью. Например, избыточное расщепление РНКазой может снизить количество идентифицированных участков связывания, что требует оптимизации. Эффективность сшивания также варьируется в зависимости от белка, и сообщалось о нуклеотидных смещениях при сшивании, например, путем сравнения сайтов сшивания и обогащенных мотивов при изучении комплексов РНК-белок in vivo в живых клетках и in vitro, хотя разрабатываются методы для минимизации таких смещений при поиске обогащенных мотивов. Компьютерно предсказанные мишени микроРНК, полученные с помощью TargetScan, сопоставимы с результатами CLIP в идентификации мишеней микроРНК, что ставит под вопрос их полезность по сравнению с существующими прогнозами. Поскольку методы CLIP основаны на иммунопреципитации, сшитая РНК в некоторых случаях может влиять на взаимодействие антитела с эпитопом. Наконец, наблюдались значительные различия. Следовательно, для всестороннего изучения взаимодействий РНК-белок в клетке требуется дальнейший вычислительный анализ необработанных данных CLIP.

sCLIP (simple CLIP) is a technique that requires lower amounts of input RNA and omits radio labeling of the immunoprecipitated RNA. The method is based on linear amplification of the immunoprecipitated RNA and thereby improves the complexity of the sequencing library despite significantly reducing the amount of input material and omitting several purification steps. Additionally, it permits a radiolabel free visualization of immunoprecipitated RNA by using a highly sensitive biotin based labeling technique. Along with a bioinformatical platform this method is designed to provide deep insights into RNA–protein interactomes in biomedical science, where the amount of starting material is often limited (i. e. in case of precious clinical samples). Additional iCLIP variants have also been developed that retain the individual nucleotide resolution but differ in one or more steps from the original iCLIP method. These include iCLIP2, irCLIP, iiCLIP, and iCLIP1.5, a few to name. As a modification of CLIP, methylated RNA sites were identified with the use of mutant enzyme or modification specific antibody with the methods termed miCLIP or m6A CLIP. Certain steps are difficult to optimize and frequently have low efficiencies. For example, overdigestion with RNase can decrease the number of identified binding sites and thus needs to be optimised. Crosslinking efficiency also varies between proteins, and nucleotide bias of crosslinking has been reported, for example by comparing cross linking sites and motifs enriched when protein RNA complexes are studied in vivo in living cells and in vitro, though methods are being developed to minimise such bias for enriched motif discovery. Computationally predicted miRNA targets derived from TargetScan are comparable to CLIP in identifying miRNA targets, raising questions as to its utility relative to existing predictions. Because CLIP methods rely on immunoprecipitation, crosslinked RNA could in some cases affect antibody epitope interactions. Finally, significant differences have been observed. Therefore, raw CLIP results require further computational analyses to thoroughly investigate RNA protein binding site interactions within the cell.