Введение

Энзим, обнаруженный у человека

Энзим цитрат-синтаза E. C. 2.3.3.1 (ранее 4.1.3.7)] существует почти во всех живых клетках и является лимитирующим ферментом на первой стадии цикла лимонной кислоты (или цикла Кребса). Цитрат-синтаза локализуется в эукариотических клетках в митохондриальной матрице, но кодируется ядерной ДНК, а не митохондриальной. Она синтезируется с помощью цитоплазматических рибосом, а затем транспортируется в митохондриальный матрикс. Цитрат-синтаза обычно используется в качестве количественного ферментного маркера для определения наличия неповрежденных митохондрий. Максимальная активность цитрат-синтазы указывает на содержание митохондрий в скелетных мышцах. Максимальная активность может быть увеличена тренировками на выносливость или высокоинтенсивными интервальными тренировками.

Цитрат-синтаза катализирует реакцию конденсации двух углеродного ацетильного остатка из ацетил-кофермента А и молекулы четырех углеродного оксалоацетата с образованием шести углеродного цитрата. На прилегающих изображениях показана третичная структура цитрат-синтазы в открытой и закрытой форме. Энзим переходит из открытой в закрытую форму при добавлении одного из своих субстратов (например, оксалоацетата).

Механизм

Цитрат-синтаза имеет три ключевые аминокислоты в своем активном центре (известном как каталитическая триада), которые катализируют превращение ацетил-КоА [H3CC(=O)−SCoA] и оксалоацетата [−O2CCH2C(=O)CO2−] в цитрат [−O2CCH2C(OH)(CO2−)CH2CO2−] и H−SCoA в реакции альдольной конденсации. Продукт – цитрат – считается прохиральным. Это превращение начинается с отщепления протона от альфа-углерода ацетил-КоА отрицательно заряженным кислородным атомом карбоксилатной боковой цепи Asp 375, что приводит к образованию енолят-аниона, который, в свою очередь, нейтрализуется протонированием His 274 с образованием энольного интермедиата [H2C=C(OH)−SCoA]. Затем, неподеленная электронная пара азота ε-аминогруппы His 274, сформированная на предыдущем этапе, отщепляет протон от гидроксильной группы энола, реформируя енолят-анион, который инициирует нуклеофильную атаку на карбонильный углерод оксалоацетата [−O2CCH2C(=O)CO2−], что, в свою очередь, приводит к депротонированию азота ε-аминогруппы His 320. Это нуклеофильное присоединение приводит к образованию цитроил-КоА [−O2CCH2CH(CO2−)CH2C(=O)−SCoA]. В этот момент молекула воды депротонируется азотом ε-аминогруппы His 320 и начинается гидролиз. Одна из неподеленных электронных пар кислорода нуклеофильно атакует карбонильный углерод цитроил-КоА, образуя тетраэдрический интермедиат и приводя к отщеплению −SCoA при восстановлении карбонильной группы. −SCoA протонируется с образованием HSCoA. Наконец, гидроксильная группа, присоединенная к карбонилу на предыдущем этапе, депротонируется, и образуется цитрат [−O2CCH2C(OH)(CO2−)CH2CO2−].

Ингибирование

Энзим ингибируется высокими соотношениями АТФ:АДФ и НАДН:НАД, так как высокие концентрации АТФ и НАДН свидетельствуют о высоком уровне энергии в клетке. Он также ингибируется сукцинил-КоА и пропионил-КоА, которые структурно схожи с ацетил-КоА и выступают в качестве конкурентного ингибитора ацетил-КоА и неконкурентного ингибитора оксалоацетата. Цитрат ингибирует реакцию и является примером ингибирования продуктом. Ингибирование цитратсинтазы аналогами ацетил-КоА также хорошо изучено и использовалось для доказательства существования единственного активного центра. Эти эксперименты показали, что этот единственный центр попеременно переходит в две формы, участвующие соответственно в лигазной и гидролазной активности.