Двумерная ЯМР-спектроскопия: методы и принципы

Двумерная ЯМР-спектроскопия: методы для получения данных о структуре молекул. COSY, NOESY, EXSY – анализ сложных соединений, определение связей.

8 мин чтения

100%

Источник: Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Набор методов, обеспечивающих получение двухмерных данных.

Двумерная ядерно-магнитная резонансная спектроскопия (2D ЯМР) – это комплекс методов ядерно-магнитной резонансной спектроскопии (ЯМР), предоставляющих данные, представленные в виде графика в пространстве, определяемом двумя частотными осями, а не одной. К типам 2D ЯМР относятся корреляционная спектроскопия (COSY), J-спектроскопия, спектроскопия обмена (EXSY) и спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY). Двумерные ЯМР-спектры предоставляют больше информации о молекуле, чем одномерные ЯМР-спектры, и особенно полезны для определения структуры молекулы, в частности, для молекул, которые слишком сложны для анализа с использованием одномерной ЯМР. Первый двухмерный эксперимент, COSY, был предложен Жаном Джиннером, профессором Свободного университета Брюсселя, в 1971 году. Позднее этот эксперимент был реализован Уолтером П. Ауэ, Энрико Бартольди и Ричардом Р. Эрнстом, которые опубликовали свои результаты в 1976 году.

Основные понятия

Каждый эксперимент состоит из последовательности радиочастотных (РЧ) импульсов с периодами задержки между ними. Временные характеристики, частоты и интенсивности этих импульсов различают различные эксперименты ЯМР друг от друга. Почти все двумерные эксперименты имеют четыре стадии: стадию подготовки, на которой создается когерентность намагниченности посредством набора РЧ-импульсов; стадию эволюции, определяемый промежуток времени, в течение которого импульсы не подаются и ядерным спинам разрешается свободно прецессировать (вращаться); стадию смешивания, на которой когерентность манипулируется другой серией импульсов в состояние, которое даст наблюдаемый сигнал; и стадию детектирования, в которой свободный сигнал индукционного распада из образца наблюдается как функция времени, аналогично одномерному FT-ЯМР. Два измерения двумерного ЯМР-эксперимента – это две частотные оси, представляющие химический сдвиг. Каждая частотная ось связана с одной из двух временных переменных: длиной стадии эволюции (время эволюции) и временем, прошедшим в течение стадии детектирования (время детектирования). Каждая из них преобразуется из временного ряда в частотный ряд посредством двумерного преобразования Фурье. Одно двумерное измерение генерируется как серия одномерных экспериментов, с различным конкретным временем эволюции в последовательных экспериментах, при этом вся продолжительность стадии детектирования регистрируется в каждом эксперименте. Двумерный спектр, полученный в результате эксперимента COSY, показывает частоты для одного изотопа, чаще всего водорода (¹H), вдоль обеих осей. (Разработаны также методы для генерации спектров гетероядерной корреляции, в которых две оси соответствуют различным изотопам, таким как ¹³C и ¹H.) Диагональные пики соответствуют пикам в 1D-ЯМР-эксперименте, в то время как перекрестные пики указывают на связи между парами ядер (подобно тому, как мультиплетное расщепление указывает на связи в 1D-ЯМР). В целом, COSY 45 обеспечивает более чистый спектр, в то время как COSY 90 более чувствителен. Другой связанный метод COSY – двойной квантово-фильтрованный (DQF) COSY. DQF COSY использует метод селекции когерентности, такой как фазовая модуляция или импульсные градиенты поля, которые приводят к тому, что только сигналы от двойных квантовых когеренций дают наблюдаемый сигнал. Это приводит к уменьшению интенсивности диагональных пиков и изменению их формы с широкой формы "дисперсии" на более четкую форму "поглощения". Он также устраняет диагональные пики от несвязанных ядер. Все они имеют преимущество в том, что обеспечивают более чистый спектр, в котором диагональные пики не маскируют перекрестные пики, которые слабее в обычном спектре COSY.

Each experiment consists of a sequence of radio frequency (RF) pulses with delay periods in between them. The timing, frequencies, and intensities of these pulses distinguish different NMR experiments from one another. Almost all two dimensional experiments have four stages: the preparation period, where a magnetization coherence is created through a set of RF pulses; the evolution period, a determined length of time during which no pulses are delivered and the nuclear spins are allowed to freely precess (rotate); the mixing period, where the coherence is manipulated by another series of pulses into a state which will give an observable signal; and the detection period, in which the free induction decay signal from the sample is observed as a function of time, in a manner identical to one dimensional FT NMR. The two dimensions of a two dimensional NMR experiment are two frequency axes representing a chemical shift. Each frequency axis is associated with one of the two time variables, which are the length of the evolution period (the evolution time) and the time elapsed during the detection period (the detection time). They are each converted from a time series to a frequency series through a two dimensional Fourier transform. A single two dimensional experiment is generated as a series of one dimensional experiments, with a different specific evolution time in successive experiments, with the entire duration of the detection period recorded in each experiment. The two dimensional spectrum that results from the COSY experiment shows the frequencies for a single isotope, most commonly hydrogen (1H) along both axes. (Techniques have also been devised for generating heteronuclear correlation spectra, in which the two axes correspond to different isotopes, such as 13C and 1H.) Diagonal peaks correspond to the peaks in a 1D NMR experiment, while the cross peaks indicate couplings between pairs of nuclei (much as multiplet splitting indicates couplings in 1D NMR). Overall, the COSY 45 offers a cleaner spectrum while the COSY 90 is more sensitive. Another related COSY technique is double quantum filtered (DQF) COSY. DQF COSY uses a coherence selection method such as phase cycling or pulsed field gradients, which cause only signals from double quantum coherences to give an observable signal. This has the effect of decreasing the intensity of the diagonal peaks and changing their lineshape from a broad "dispersion" lineshape to a sharper "absorption" lineshape. It also eliminates diagonal peaks from uncoupled nuclei. These all have the advantage that they give a cleaner spectrum in which the diagonal peaks are prevented from obscuring the cross peaks, which are weaker in a regular COSY spectrum.

Спектроскопия общей корреляции (TOCSY)

Эксперимент TOCSY аналогичен эксперименту COSY, поскольку в нем наблюдаются перекрестные пики связанных протонов. Однако перекрестные пики наблюдаются не только для ядер, которые непосредственно соединены, но и между ядрами, связанными цепочкой взаимодействий. Это делает его полезным для идентификации более крупных взаимосвязанных сетей спиновых сцеплений. Эта возможность достигается путем введения повторяющейся серии импульсов, вызывающих изотропное смешивание в течение периода смешивания. Более длительное время изотропного смешивания приводит к распространению поляризации на все большее число связей. В случае олигосахаридов каждый сахарный остаток представляет собой изолированную спиновую систему, поэтому можно дифференцировать все протоны конкретного сахарного остатка. Существует также одномерная (1D) версия TOCSY, и, облучая один протон, можно выявить остальную часть спиновой системы. Недавние усовершенствования этой методики включают 1D CSSF (фильтр с селективным химическим сдвигом) TOCSY эксперимент, который позволяет получать спектры более высокого качества и надежно извлекать константы спин-спинового взаимодействия для определения стереохимии. TOCSY иногда называют "гомоядерной спектроскопией Хартмана-Хаана" (HOHAHA).

Невероятный эксперимент с двойным квантовым переносом из природного изобилия (НЕПРЕДОСТОЙНЫЙ)

INADEQUATE – это метод, часто используемый для определения взаимодействий между соседними атомами углерода 13C. Поскольку естественная распространенность 13C составляет всего около 1%, лишь примерно 0,01% исследуемых молекул будут содержать два близко расположенных атома 13C, необходимых для получения сигнала в этом эксперименте. Однако используются методы селекции корреляций (аналогично DQF COSY) для подавления сигналов от отдельных атомов 13C, что позволяет легко различить сигналы от пар 13C. Каждая пара взаимодействующих ядер дает пару пиков на спектре INADEQUATE, оба из которых имеют одинаковую вертикальную координату, равную сумме химических сдвигов ядер; горизонтальная координата каждого пика соответствует химическому сдвигу каждого из ядер по отдельности.

Методы корреляции через гетеронуклеарные связи

Гетеронуклеарная корреляционная спектроскопия дает сигнал, основанный на связи между ядрами двух разных типов. Чаще всего эти ядра – протоны и другое ядро (называемое "гетероядром"). По историческим причинам эксперименты, регистрирующие спектр протонов, а не гетероядра в период детектирования, называют "инверсными". Это объясняется тем, что низкая естественная распространенность большинства гетероядер приведет к тому, что спектр протонов будет перегружен сигналами от молекул, не содержащих активных гетероядер, что сделает его непригодным для наблюдения желаемых связанных сигналов. С появлением методов подавления этих нежелательных сигналов, инверсные корреляционные эксперименты, такие как HSQC, HMQC и HMBC, сегодня гораздо более распространены. "Обычная" гетеронуклеарная корреляционная спектроскопия, в которой регистрируется спектр гетероядра, известна как HETCOR.

Гетеронуклеарная одноквантовая корреляционная спектроскопия (HSQC)

HSQC обнаруживает корреляции между ядрами двух различных типов, разделенных одной связью. Этот метод дает один пик на пару связанных ядер, две координаты которых соответствуют химическим сдвигам двух связанных атомов. HSQC работает путем переноса магнетизации из ядра I (обычно протона) в ядро S (обычно гетероатома) с использованием импульсной последовательности INEPT; этот первый шаг выполняется, поскольку протон обладает большей равновесной магнетизацией, что создает более сильный сигнал. Затем магнетизация эволюционирует и переносится обратно в ядро I для наблюдения. Дополнительный спиновый эхо-этап может быть опционально использован для развязки сигнала, упрощая спектр за счет сведения мультиплетов к одному пику. Нежелательные несвязанные сигналы устраняются путем повторного проведения эксперимента с обратной фазой одного конкретного импульса; это меняет знаки желаемых, но не нежелательных пиков, поэтому вычитание двух спектров дает только желаемые пики. В HMBC эта сложность преодолевается путем исключения одной из этих задержек из последовательности HMQC. Это увеличивает диапазон констант связи, которые могут быть обнаружены, а также снижает потери сигнала из-за релаксации. Цена этого заключается в невозможности развязки спектра и внесении фазовых искажений в сигнал. Существует модификация метода HMBC, которая подавляет сигналы одной связи, оставляя только сигналы множественных связей. Одно из применений NOESY – изучение крупных биомолекул, таких как в ЯМР белков, где соотношения часто можно установить с помощью последовательного обхода. Эксперимент NOESY также может быть выполнен в одномерном режиме путем предварительного выбора отдельных резонансов. Спектры считываются с предварительно выбранными ядрами, дающими сильный отрицательный сигнал, в то время как соседние ядра идентифицируются более слабыми положительными сигналами. Это показывает только, какие пики имеют измеримые NOE к интересующему резонансу, но занимает гораздо меньше времени, чем полномасштабный двумерный эксперимент. Кроме того, если предварительно выбранное ядро меняет окружение в течение временного масштаба эксперимента, может наблюдаться несколько отрицательных сигналов. Это предоставляет информацию об обмене, аналогичную методу ЯМР EXSY (спектроскопия обмена). Эксперименты NOESY являются важным инструментом для определения стереохимии молекулы в растворе, в то время как рентгеноструктурный анализ монокристаллов (XRD) используется для определения стереохимии молекулы в твердой форме.

HSQC detects correlations between nuclei of two different types which are separated by one bond. This method gives one peak per pair of coupled nuclei, whose two coordinates are the chemical shifts of the two coupled atoms. HSQC works by transferring magnetization from the I nucleus (usually the proton) to the S nucleus (usually the heteroatom) using the INEPT pulse sequence; this first step is done because the proton has a greater equilibrium magnetization and thus this step creates a stronger signal. The magnetization then evolves and then is transferred back to the I nucleus for observation. An extra spin echo step can then optionally be used to decouple the signal, simplifying the spectrum by collapsing multiplets to a single peak. The undesired uncoupled signals are removed by running the experiment twice with the phase of one specific pulse reversed; this reverses the signs of the desired but not the undesired peaks, so subtracting the two spectra will give only the desired peaks. In HMBC, this difficulty is overcome by omitting one of these delays from an HMQC sequence. This increases the range of coupling constants that can be detected, and also reduces signal loss from relaxation. The cost is that this eliminates the possibility of decoupling the spectrum, and introduces phase distortions into the signal. There is a modification of the HMBC method which suppresses one bond signals, leaving only the multiple bond signals. One application of NOESY is in the study of large biomolecules, such as in protein NMR, in which relationships can often be assigned using sequential walking. The NOESY experiment can also be performed in a one dimensional fashion by pre selecting individual resonances. The spectra are read with the pre selected nuclei giving a large, negative signal while neighboring nuclei are identified by weaker, positive signals. This only reveals which peaks have measurable NOEs to the resonance of interest but takes much less time than the full 2D experiment. In addition, if a pre selected nucleus changes environment within the time scale of the experiment, multiple negative signals may be observed. This offers exchange information similar to the EXSY (exchange spectroscopy) NMR method. NOESY experiments are important tool to identify stereochemistry of a molecule in solvent whereas single crystal XRD used to identify stereochemistry of a molecule in solid form.

Гетеронуклеарная спектроскопия с эффектом Оверхаузера (HOESY)

В HOESY, подобно NOESY, используется для перекрестной релаксации между ядерными спинами. Однако HOESY может предоставлять информацию о других ядрах, активных в ЯМР, с учетом их пространственного расположения. Примерами могут служить любые ядра X{Y} или X→Y, такие как 1H→13C, 19F→13C, 31P→13C или 77Se→13C. В этих экспериментах обычно регистрируются NOE от протонов на ядре X, X{1H}, но включение протонов не является обязательным.

Спектроскопия с ядерным эффектом Оверхаузера (ROESY)

ROESY аналогичен NOESY, за исключением различия в начальном состоянии. Вместо наблюдения перекрестной релаксации из начального состояния с z-магнетизацией, равновесная магнетизация поворачивается на ось x, а затем фиксируется внешним магнитным полем, предотвращающим прецессию. Этот метод полезен для определенных молекул, время вращательной корреляции которых попадает в диапазон, где ядерный эффект Оверхаузера слишком слаб для обнаружения, обычно для молекул с молекулярной массой около 1000 дальтонов, поскольку ROESY имеет иную зависимость между временем корреляции и константой скорости перекрестной релаксации. В NOESY константа скорости перекрестной релаксации изменяет знак с положительного на отрицательный при увеличении времени корреляции, создавая диапазон, где она близка к нулю, в то время как в ROESY константа скорости перекрестной релаксации всегда положительна.

Методы с разрешением спектра

В отличие от коррелированных спектров, разрешенные спектры расширяют пики в 1D ЯМР эксперименте до двух измерений, не добавляя при этом никаких дополнительных пиков. Эти методы обычно называют J-разрешенной спектроскопией, но иногда также известны как спектроскопия, разрешенная по химическому сдвигу, или δ-разрешенная спектроскопия. Они полезны для анализа молекул, 1D ЯМР спектры которых содержат перекрывающиеся мультиплеты, поскольку J-разрешенный спектр вертикально смещает мультиплет от каждого ядра на различную величину. Каждый пик в 2D спектре будет иметь ту же горизонтальную координату, что и в недекомпозированном 1D спектре, но его вертикальная координата будет соответствовать химическому сдвигу единственного пика, который ядро имеет в декомпозированном 1D спектре. Для гетероядерного варианта используется простейшая последовательность импульсов, называемая экспериментом Мюллера–Кумара–Эрнста (MKE), который включает единственный импульс 90° для гетероядра в период подготовки, отсутствие периода смешивания и применение сигнала развязки к протону в период детектирования. Существует несколько вариантов этой последовательности импульсов, которые обладают большей чувствительностью и точностью и относятся к категориям методов с управляемой развязкой и методов инверсии спина. Гомоядерная J-разрешенная спектроскопия использует последовательность импульсов спинового эха.

Высокомерные методы

Также можно проводить 3D и 4D эксперименты, иногда путем последовательного выполнения последовательностей импульсов из двух или трех 2D экспериментов. Однако многие из широко используемых 3D экспериментов являются экспериментами с тройным резонансом, например, эксперименты HNCA и HNCOCA, которые часто применяются в ЯМР белков.