Технология сайт-специфической рекомбинации Cre Lox

Введение

Технология сайт-специфической рекомбиназы. Рекомбинация Cre Lox – это технология сайт-специфической рекомбиназы, используемая для проведения делеций, вставок, транслокаций и инверсий в определенных участках ДНК клеток. Она позволяет направленно модифицировать ДНК в конкретном типе клеток или инициировать модификацию под воздействием определенного внешнего стимула. Реализуется как в эукариотических, так и в прокариотических системах. Система рекомбинации Cre Lox оказалась особенно полезной для нейробиологов в изучении мозга, где сложные типы клеток и нейронные цепи взаимодействуют, формируя когнитивные функции и поведение. NIH Blueprint for Neuroscience Research создала несколько сотен линий мышей-носителей Cre, которые в настоящее время используются нейробиологическим сообществом во всем мире. Важным применением системы Cre Lox является удаление селективных маркеров при замене генов. Распространенные стратегии замены генов вводят селективные маркеры в геном для облегчения отбора генетических мутаций, которые могут вызывать задержку роста. Однако экспрессия маркеров может оказывать полярное влияние на экспрессию генов, расположенных выше- и ниже по течению. Удаление селективных маркеров из генома с помощью рекомбинации Cre Lox – это элегантный и эффективный способ обойти эту проблему, поэтому она широко используется в растениях, клеточных линиях мышей, дрожжах и т.д. Система состоит из единственного фермента – Cre-рекомбиназы, который рекомбинирует пару коротких целевых последовательностей, называемых последовательностями Lox. Эта система может быть реализована без введения дополнительных поддерживающих белков или последовательностей. Фермент Cre и исходный сайт Lox, называемый последовательностью LoxP, происходят из бактериофага P1. Правильное размещение последовательностей Lox позволяет активировать, подавлять или заменять гены другими генами. На уровне ДНК можно проводить различные манипуляции. Активность фермента Cre можно контролировать, чтобы он экспрессировался в определенном типе клеток или активировался внешним стимулом, таким как химический сигнал или тепловой шок. Эти направленные изменения ДНК полезны при отслеживании клеточных линий и в случаях, когда мутанты летальны при глобальной экспрессии. Система Cre Lox по принципу действия и применению очень похожа на систему рекомбинации FLP FRT.

Site specific recombinase technology
Cre Lox recombination is a site specific recombinase technology, used to carry out deletions, insertions, translocations and inversions at specific sites in the DNA of cells. It allows the DNA modification to be targeted to a specific cell type or be triggered by a specific external stimulus. It is implemented both in eukaryotic and prokaryotic systems. The Cre lox recombination system has been particularly useful to help neuroscientists to study the brain in which complex cell types and neural circuits come together to generate cognition and behaviors. NIH Blueprint for Neuroscience Research has created several hundreds of Cre driver mouse lines which are currently used by the worldwide neuroscience community. An important application of the Cre lox system is excision of selectable markers in gene replacement. Commonly used gene replacement strategies introduce selectable markers into the genome to facilitate selection of genetic mutations that may cause growth retardation. However, marker expression can have polar effects on the expression of upstream and downstream genes. Removal of selectable markers from the genome by Cre lox recombination is an elegant and efficient way to circumvent this problem and is therefore widely used in plants, mouse cell lines, yeast, etc. The system consists of a single enzyme, Cre recombinase, that recombines a pair of short target sequences called the Lox sequences. This system can be implemented without inserting any extra supporting proteins or sequences. The Cre enzyme and the original Lox site called the LoxP sequence are derived from bacteriophage P1. Placing Lox sequences appropriately allows genes to be activated, repressed, or exchanged for other genes. At a DNA level many types of manipulations can be carried out. The activity of the Cre enzyme can be controlled so that it is expressed in a particular cell type or triggered by an external stimulus like a chemical signal or a heat shock. These targeted DNA changes are useful in cell lineage tracing and when mutants are lethal if expressed globally. The Cre Lox system is very similar in action and in usage to the FLP FRT recombination system.

История

Рекомбинация Cre Lox – это особый тип сайт-специфической рекомбинации, разработанный доктором Брайаном Сауэром и запатентованный компанией DuPont, который функционирует как в митотических, так и в немитотических клетках и изначально использовался для активации экспрессии генов в клеточных линиях млекопитающих. Впоследствии исследователи из лаборатории доктора Джейми Марта продемонстрировали, что рекомбинация Cre Lox может быть использована для эффективного удаления хромосомных последовательностей ДНК, фланкированных loxP, в специфических развивающихся T-клетках трансгенных животных. Авторы предположили, что этот подход можно использовать для определения эндогенной функции гена в конкретных типах клеток, необратимой маркировки прогениторных клеток в исследованиях детерминации клеточной судьбы, индуцирования специфических хромосомных перестроек для моделирования биологических процессов и заболеваний, а также для определения роли ранних генетических повреждений в поддержании заболевания (и фенотипа). Вскоре после этого исследователи из лаборатории профессора Клауса Раевского сообщили о создании плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, несущих ген ДНК-полимеразы с таргетированной loxP-фланкированной (флоксированной) последовательностью. Объединив эти достижения в рамках совместной работы, лаборатории докторов Марта и Раевского в 1994 году сообщили, что рекомбинация Cre Lox может быть использована для условного таргетинга генов. Они обнаружили, что примерно 50% гена бета-ДНК-полимеразы было удалено в T-клетках, основываясь на данных Southern blot. Оставалось неясным, была ли удалена только одна аллель в каждой T-клетке или 50% T-клеток имели 100%-ное удаление в обеих аллелях. В 1995 году лаборатория Марта сообщила о более эффективном условном мутагенезе генов Cre Lox в развивающихся T-клетках. Неполное удаление рекомбиназой Cre – явление нередкое в клетках, содержащих две копии флоксированных последовательностей, и позволяет формировать и изучать химерные ткани. Показано, что все типы клеток, исследованные на мышах, подвергаются трансгенной рекомбинации Cre. Независимо от этого, Джо З. Цзиен стал пионером в использовании системы Cre LoxP для манипулирования генами, специфичного для типа клеток и региона, в мозге взрослого организма, где могут существовать сотни различных типов нейронов, и почти все нейроны мозга взрослого организма являются постмитотическими. Цзиен и его коллеги продемонстрировали, что рекомбинация, опосредованная Cre, может происходить в постмитотических пирамидальных нейронах переднего мозга взрослой мыши. Эти разработки привели к широкому использованию условного мутагенеза в биомедицинских исследованиях, охватывающих множество дисциплин, где он стал мощной платформой для определения функции генов в конкретных типах клеток и на определенных этапах развития. В частности, убедительная демонстрация его полезности в точном определении сложной взаимосвязи между конкретными клетками/цепями и поведением в исследованиях мозга побудила NIH инициировать проект NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre в начале 2000-х годов. На сегодняшний день проекты NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre создали несколько сотен линий мышей-драйверов Cre, которые в настоящее время используются мировым нейробиологическим сообществом.

Cre Lox recombination is a special type of site specific recombination developed by Dr. Brian Sauer and patented by DuPont that operated in both mitotic and non mitotic cells, and was initially used in activating gene expression in mammalian cell lines. Subsequently, researchers in the laboratory of Dr. Jamey Marth demonstrated that Cre Lox recombination could be used to delete loxP flanked chromosomal DNA sequences at high efficiency in specific developing T cells of transgenic animals, with the authors proposing that this approach could be used to define endogenous gene function in specific cell types, indelibly mark progenitors in cell fate determination studies, induce specific chromosomal rearrangements for biological and disease modeling, and determine the roles of early genetic lesions in disease (and phenotype) maintenance. Shortly thereafter, researchers in the laboratory of Prof. Klaus Rajewsky reported the production of pluripotent embryonic stem cells bearing a targeted loxP flanked (floxed) DNA polymerase gene. Combining these advances in collaboration, the laboratories of Drs. Marth and Rajewsky reported in 1994 that Cre lox recombination could be used for conditional gene targeting. They observed ≈50% of the DNA polymerase beta gene was deleted in T cells based on DNA blotting. It was unclear whether only one allele in each T cell or 50% of T cells had 100% deletion in both alleles. Researchers have since reported more efficient Cre Lox conditional gene mutagenesis in the developing T cells by the Marth laboratory in 1995. Incomplete deletion by Cre recombinase is not uncommon in cells when two copies of floxed sequences exist, and allows the formation and study of chimeric tissues. All cell types tested in mice have been shown to undergo transgenic Cre recombination. Independently, Joe Z. Tsien has pioneered the use of Cre loxP system for cell type and region specific gene manipulation in the adult brain where hundreds of distinct neuron types may exist and nearly all neurons in the adult brain are known to be post mitotic. Tsien and his colleagues demonstrated Cre mediated recombination can occur in the post mitotic pyramidal neurons in the adult mouse forebrain. These developments have led to a widespread use of conditional mutagenesis in biomedical research, spanning many disciplines in which it becomes a powerful platform for determining gene function in specific cell types and at specific developmental times. In particular, the clear demonstration of its usefulness in precisely defining the complex relationship between specific cells/circuits and behaviors for brain research, has promoted the NIH to initiate the NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre driver mouse projects in early 2000. To date, NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre projects have created several hundreds of Cre driver mouse lines which are currently used by the worldwide neuroscience community.

Обзор

Рекомбинация Cre Lox включает в себя нацеливание на определенную последовательность ДНК и ее сшивание с помощью фермента, называемого рекомбиназой Cre. Рекомбинация Cre Lox обычно используется для преодоления эмбриональной летальности, вызванной системной инактивацией многих генов. По состоянию на февраль 2019 года рекомбинация Cre–Lox является мощным инструментом и используется в моделировании трансгенных животных для установления связи между генотипами и фенотипами. Система Cre lox используется как генетический инструмент для контроля рекомбинационных событий в геномной ДНК в определенных участках. Эта система позволила исследователям манипулировать различными генетически модифицированными организмами для контроля экспрессии генов, удаления нежелательных последовательностей ДНК и изменения архитектуры хромосом. Белок Cre – это сайт-специфичная ДНК-рекомбиназа, которая может катализировать рекомбинацию ДНК между определенными участками в молекуле ДНК. Эти участки, известные как последовательности loxP, содержат специфические сайты связывания для Cre, окружающие направленную основную последовательность, где может происходить рекомбинация. Когда клетки, имеющие сайты loxP в своем геноме, экспрессируют Cre, между сайтами loxP может произойти рекомбинация. Белки кре-рекомбиназы связываются с первой и последней 13-нуклеотидными областями сайта lox, образуя димер. Затем этот димер связывается с димером на другом сайте lox, образуя тетрамер. Сайты lox имеют направленность, и два сайта, соединенные тетрамером, ориентированы параллельно. Двухцепочечная ДНК разрезается белком Cre в обоих сайтах loxP. Затем цепи воссоединяются с ДНК-лигазой в быстром и эффективном процессе. Результат рекомбинации зависит от ориентации сайтов loxP. Для двух сайтов lox на одной хромосомной плече инвертированные сайты loxP приведут к инверсии промежуточной ДНК, в то время как прямой повтор сайтов loxP приведет к событию делеции. Если сайты loxP находятся на разных хромосомах, то рекомбинация, индуцированная Cre, может катализировать события транслокации. Две плазмиды можно соединить, используя варианты сайтов lox 71 и 66.

Кре- рекомбиназа

Рекомбиназа Cre может синтезироваться соответствующим геном под управлением клеточно-специфических промоторов, включая промоторы, контролируемые доксициклином. Дополнительный уровень контроля можно достичь, используя рекомбиназу Cre, сконструированную для обратимой активации в присутствии аналога эстрогена – 4-гидрокситамоксифена. Это дает преимущество в виде кратковременной активности рекомбиназы Cre, что предотвращает неспецифические действия. Рекомбиназа Cre способна распознавать скрытые сайты в геноме хозяина и индуцировать нежелательную рекомбинацию, повреждая ДНК хозяина. Этот инструмент подходит для удаления генов устойчивости к антибиотикам, но главное – он позволяет проводить условные нокауты, которые могут быть индуцированы в определенное время в выбранном типе клеток. Модели, полученные таким образом, более точно имитируют физиологическую ситуацию. Белок Cre (кодируемый локусом, первоначально названным "Causes recombination" – "причина рекомбинации", а в некоторых источниках – "Cyclization recombinase" – "циклизационная рекомбиназа") состоит из 4 субъединиц и двух доменов: более крупного карбоксильного (C-концевого) и меньшего амино (N-концевого) доменов. Общая длина белка составляет 343 аминокислоты. C-домен по структуре сходен с доменом ферментов семейства Интеграз, выделенных из ламбда-фага, и является каталитическим центром фермента.

Соединения Холлидей и гомологичная рекомбинация

Во время генетической рекомбинации между двумя нитями ДНК образуется структура Холлидея, а двунитевой разрыв в молекуле ДНК оставляет свободный 3'-OH конец. Эта реакция облегчается эндонуклеазной активностью фермента. 5'-фосфатные концы обычно служат субстратами для этой реакции, в результате чего остаются удлиненные 3'-концы. Эта 3'-OH группа крайне нестабильна, и нить, на которой она находится, должна найти комплементарный участок. Поскольку гомологическая рекомбинация происходит после репликации ДНК, доступны две нити ДНК, и, следовательно, 3'-OH группа должна спариться со своим комплементом, что и происходит, с целой нитью на другом дуплексе. Таким образом, происходит одна точка кроссинговера, которая называется промежуточным соединением Холлидея. 3'-OH конец удлиняется (то есть к нему добавляются основания) с помощью ДНК-полимеразы. Спаривание противоположных нитей и составляет событие кроссинговера или рекомбинации, общее для всех живых организмов, поскольку генетический материал одной нити одного дуплекса спаривается с одной нитью другого дуплекса и удлиняется ДНК-полимеразой. Дальнейшее расщепление промежуточных соединений Холлидея приводит к образованию гибридной ДНК. Это дальнейшее расщепление или «разрешение» осуществляется специальной группой ферментов, называемых резолвазами. RuvC – лишь одна из этих резолваз, выделенных у бактерий и дрожжей. Долгое время считалось, что при формировании промежуточного соединения Холлидея точка ветвления (где нити пересекаются) будет располагаться в месте первого разрыва. Миграция точки ветвления ко второму месту разрыва каким-то образом запускала бы вторую половину процесса. Эта модель давала удобное объяснение строгому требованию гомологии между рекомбинирующими участками, поскольку миграция ветви останавливалась бы при несовпадении и не позволяла бы произойти обмену второй нитью. Однако в последние годы эта точка зрения была оспорена, и большинство современных моделей рекомбинации Int, Xer и Flp включают лишь ограниченную миграцию ветви (1–3 пары оснований в промежуточном соединении Холлидея), в сочетании с событием изомеризации, которое отвечает за изменение специфичности расщепления нити.

During genetic recombination, a Holliday junction is formed between the two strands of DNA and a double stranded break in a DNA molecule leaves a 3’OH end exposed. This reaction is aided with the endonuclease activity of an enzyme. 5’ Phosphate ends are usually the substrates for this reaction, thus extended 3’ regions remain. This 3’ OH group is highly unstable, and the strand on which it is present must find its complement. Since homologous recombination occurs after DNA replication, two strands of DNA are available, and thus, the 3’ OH group must pair with its complement, and it does so, with an intact strand on the other duplex. Now, one point of crossover has occurred, which is what is called a Holliday Intermediate. The 3’OH end is elongated (that is, bases are added) with the help of DNA Polymerase. The pairing of opposite strands is what constitutes the crossing over or Recombination event, which is common to all living organisms, since the genetic material on one strand of one duplex has paired with one strand of another duplex, and has been elongated by DNA polymerase. Further cleavage of Holliday Intermediates results in formation of Hybrid DNA. This further cleavage or ‘resolvation’ is done by a special group of enzymes called Resolvases. RuvC is just one of these Resolvases that have been isolated in bacteria and yeast. For many years, it was thought that when the Holliday junction intermediate was formed, the branch point of the junction (where the strands cross over) would be located at the first cleavage site. Migration of the branch point to the second cleavage site would then somehow trigger the second half of the pathway. This model provided convenient explanation for the strict requirement for homology between recombining sites, since branch migration would stall at a mismatch and would not allow the second strand exchange to occur. In more recent years, however, this view has been challenged, and most of the current models for Int, Xer, and Flp recombination involve only limited branch migration (1–3 base pairs of the Holliday intermediate), coupled to an isomerisation event that is responsible for switching the strand cleavage specificity.

Рекомбинация в зависимости от конкретного места

Специфическая рекомбинация (SSR) происходит на определенных участках ДНК под действием специальных ферментов, называемых рекомбиназами. Cre, или циклическая рекомбиназа, является одним из таких ферментов. Таким образом, специфическая рекомбинация представляет собой фермент-опосредованный разрыв и лигирование двух определенных дезоксинуклеотидных последовательностей. Ряд консервативных систем специфической рекомбинации описан как у прокариотических, так и у эукариотических организмов. Как правило, эти системы используют один или несколько белков и действуют на уникальные асимметричные последовательности ДНК. Продукты рекомбинационного события зависят от относительной ориентации этих асимметричных последовательностей. Помимо рекомбиназы, в регуляции реакции участвуют многие другие белки. В ходе специфической рекомбинации ДНК, которая вызывает генетические перестройки в процессах, таких как вирусная интеграция и эксцизия, а также сегрегация хромосом, эти рекомбиназные ферменты распознают специфические последовательности ДНК и катализируют взаимный обмен цепей ДНК между этими участками.

Механизм действия

Инициация сайт-специфической рекомбинации начинается со связывания белков рекомбинации с их соответствующими ДНК-мишенями. Отдельная рекомбиназа распознает и связывается с каждым из двух сайтов рекомбинации на двух разных молекулах ДНК или в пределах одной и той же цепи ДНК. В определенном месте на ДНК гидроксильная группа тирозина в рекомбиназе атакует фосфатную группу в основной цепи ДНК, используя прямой механизм трансэстерификации. Эта реакция связывает белок рекомбиназы с ДНК посредством фосфотирозиновой связи. Это сохраняет энергию фосфодиэфирной связи, позволяя реакции быть обратимой без участия высокоэнергетического кофактора. Расщепление на другой цепи также вызывает образование фосфотирозиновой связи между ДНК и ферментом. При связывании фосфатной группы с тирозиновыми остатками в обоих дуплексах ДНК в основной цепи ДНК остается свободная 3'-ОН группа. Фактически, комплекс ДНК-фермента является промежуточной стадией, за которой следует лигация 3'-ОН группы одной цепи ДНК с 5'-фосфатной группой другой цепи ДНК, которая ковалентно связана с тирозиновым остатком; то есть ковалентная связь между 5'-концом и тирозиновым остатком разрывается. Эта реакция синтезирует соединение Холлидей, обсуждавшееся ранее. Таким образом, противоположные цепи ДНК соединяются. Последующее расщепление и воссоединение приводят к обмену сегментами ДНК. Взаимодействие белков друг с другом направляет и обеспечивает обмен цепями. Энергия не теряется, поскольку связь ДНК с белком компенсирует потерю фосфодиэфирной связи, которая произошла во время расщепления. Сайт-специфическая рекомбинация также является важным процессом, который вирусы, такие как бактериофаги, используют для интеграции своего генетического материала в инфицированного хозяина. Вирус, называемый профагом в таком состоянии, осуществляет это посредством интеграции и вырезания. Точки, в которых происходят реакции интеграции и вырезания, называются участками прикрепления (att). Участок attP на фаге обменивается сегментами с участком attB на бактериальной ДНК. Таким образом, они сайт-специфичны, происходят только в соответствующих участках att. Класс ферментов интеграз катализирует эту конкретную реакцию.

Initiation of site specific recombination begins with the binding of recombination proteins to their respective DNA targets. A separate recombinase recognizes and binds to each of two recombination sites on two different DNA molecules or within the same DNA strand. At the given specific site on the DNA, the hydroxyl group of the tyrosine in the recombinase attacks a phosphate group in the DNA backbone using a direct transesterification mechanism. This reaction links the recombinase protein to the DNA via a phospho tyrosine linkage. This conserves the energy of the phosphodiester bond, allowing the reaction to be reversed without the involvement of a high energy cofactor. Cleavage on the other strand also causes a phospho tyrosine bond between DNA and the enzyme. At both of the DNA duplexes, the bonding of the phosphate group to tyrosine residues leave a 3’ OH group free in the DNA backbone. In fact, the enzyme DNA complex is an intermediate stage, which is followed by the ligation of the 3’ OH group of one DNA strand to the 5’ phosphate group of the other DNA strand, which is covalently bonded to the tyrosine residue; that is, the covalent linkage between 5’ end and tyrosine residue is broken. This reaction synthesizes the Holliday junction discussed earlier. In this fashion, opposite DNA strands are joined. Subsequent cleavage and rejoining cause DNA strands to exchange their segments. Protein protein interactions drive and direct strand exchange. Energy is not compromised, since the protein DNA linkage makes up for the loss of the phosphodiester bond, which occurred during cleavage. Site specific recombination is also an important process that viruses, such as bacteriophages, adopt to integrate their genetic material into the infected host. The virus, called a prophage in such a state, accomplishes this via integration and excision. The points where the integration and excision reactions occur are called the attachment (att) sites. An attP site on the phage exchanges segments with an attB site on the bacterial DNA. Thus, these are site specific, occurring only at the respective att sites. The integrase class of enzymes catalyse this particular reaction.

Эффективность действий

Было показано, что на эффективность вырезания локс-пары Cre влияют два фактора. Во-первых, идентичность нуклеотидной последовательности в спейсерной области локс-сайта. Разработанные варианты локс, отличающиеся в спейсерной области, как правило, демонстрируют различную, но обычно более низкую эффективность рекомбинации по сравнению с диким типом loxP, предположительно, из-за влияния на формирование и разрешение рекомбинационного интермедиата. Другой фактор – длина ДНК между локс-парой. Увеличение длины ДНК приводит к снижению эффективности рекомбинации Cre/lox, возможно, за счет регуляции динамики реакции. Генетическое положение флоксовой последовательности также влияет на эффективность рекомбинации, вероятно, влияя на доступность ДНК для рекомбиназы Cre. Это достигается путем слияния мутированного домена связывания лиганда эстрогенового рецептора с рекомбиназой Cre, в результате чего Cre становится специфически активированным тамоксифеном. В отсутствие тамоксифена CreER приводит к перемещению мутированной рекомбиназы в цитоплазму. Белок остается в этом месте в неактивированном состоянии до введения тамоксифена. После введения тамоксифен метаболизируется в 4-гидрокситамоксифен, который затем связывается с ER и приводит к транслокации CreER в ядро, где он способен расщеплять локс-сайты. Важно отметить, что иногда флуоресцентные репортеры могут активироваться в отсутствие тамоксифена из-за утечки небольшого количества молекул рекомбиназы Cre в ядро, что в сочетании со сверхчувствительными репортерами приводит к нежелательной маркировке клеток. CreER(T2) был разработан для минимизации рекомбинации, не зависящей от тамоксифена, и максимизации чувствительности к тамоксифену.

Условный отслеживание клеточной линии

Клетки изменяют свой фенотип в ответ на многочисленные факторы окружающей среды и могут терять экспрессию генов, обычно используемых для идентификации их типа, что затрудняет изучение вклада определенных клеточных популяций в развитие заболеваний. Поэтому исследователи часто используют трансгенных мышей, экспрессирующих рекомбиназу CreERt2, индуцированную введением тамоксифена, под контролем промотора гена, специфичного для интересующего типа клеток, в сочетании с репортером флуоресцентного белка, зависимым от Cre. Рекомбиназа Cre связана с мутантной формой рецептора эстрогена, который связывает синтетический эстроген 4-гидрокситамоксифен вместо его естественного лиганда 17β-эстрадиола. CreER(T2) локализуется в цитоплазме и может транслоцироваться в ядро только после введения тамоксифена, обеспечивая точный временной контроль рекомбинации. Флуоресцентная репортерная кассета содержит промотор для обеспечения высокой экспрессии флуоресцентного репортерного трансгена (например, промотор CAG) и кассету-стоп, фланкированную лохP-сайтами, что гарантирует Cre-зависимую экспрессию трансгена и репортерной последовательности. При рекомбинации, индуцированной Cre, кассета-стоп вырезается, позволяя генам-репортерам экспрессироваться специфически в клетках, в которых экспрессия Cre управляется промотором клеточного маркера. Поскольку удаление кассеты-стоп является необратимым, репортерные гены экспрессируются во всех потомках, происходящих от исходных клеток, в которых Cre была активирована. Такой условный анализ клеточного происхождения оказался чрезвычайно полезным для эффективной и специфической идентификации клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) и клеток, происходящих из VSMC, и использовался для оценки влияния на VSMC и их производные in vivo.

Естественная функция системы Cre-lox

Фаг P1 – это умеренный фаг, который вызывает либо лизогенный, либо литический цикл при инфицировании бактерии. В литическом состоянии, после внедрения вирусного генома в клетку-хозяина, происходит синтез вирусных белков, сборка вирионов и лизис клетки-хозяина с высвобождением фагов, что продолжает цикл. В лизогенном цикле геном фага реплицируется вместе с геномом бактерии и передается дочерним клеткам при каждом последующем делении. Переход в литический цикл может быть вызван последующими событиями, такими как УФ-излучение или недостаток питательных веществ. Фаги, такие как ламбда-фаг, используют сайт-специфические рекомбиназы для интеграции своей ДНК в геном хозяина во время лизогении. ДНК фага P1, напротив, существует в клетке-хозяине в форме плазмиды. Система Cre-lox выполняет несколько функций в фаге: она циркуляризует ДНК фага в плазмиду, разделяет сцепленные плазмидные кольца, обеспечивая их равномерное распределение между дочерними бактериями, и может способствовать поддержанию количества копий посредством альтернативного механизма репликации. ДНК фага P1, высвобождаемая из вириона в клетку-хозяина, представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК. Фермент Cre нацелен на сайты loxP на концах этой молекулы и циклизует геном. Этот процесс может происходить и без системы Cre-lox, с участием других бактериальных и вирусных белков. Плазмида P1 относительно велика (≈90 кбп) и поэтому существует в небольшом количестве копий, обычно по одной на клетку. Если две дочерние плазмиды сцепляются, одна из дочерних клеток хозяина может потерять плазмиду. Система рекомбинации Cre-lox предотвращает такие ситуации, разъединяя кольца ДНК посредством двух рекомбинационных событий (сцепленные кольца > единое слитое кольцо > два несцепленных кольца). Также предполагается, что репликация с катящимся кругом, сопровождаемая рекомбинацией, позволяет плазмиде увеличить количество копий при ограничении определенных регуляторов (repA). Исследователи использовали различные варианты loxP, в частности lox2272 и loxN, в сочетании с различными режимами действия Cre (транзиентным или конститутивным) для создания системы "Brainbow", позволяющей мультицветную маркировку мозга мышей с использованием четырех флуоресцентных белков. В другом исследовании, с использованием пары вариантов lox, регулирование длины ДНК в одной паре привело к стохастической активации генов с регулируемым уровнем разреженности.

The P1 phage is a temperate phage that causes either a lysogenic or lytic cycle when it infects a bacterium. In its lytic state, once its viral genome is injected into the host cell, viral proteins are produced, virions are assembled, and the host cell is lysed to release the phages, continuing the cycle. In the lysogenic cycle the phage genome replicates with the rest of the bacterial genome and is transmitted to daughter cells at each subsequent cell division. It can transition to the lytic cycle by a later event such as UV radiation or starvation. Phages like the lambda phage use their site specific recombinases to integrate their DNA into the host genome during lysogeny. P1 phage DNA on the other hand, exists as a plasmid in the host. The Cre lox system serves several functions in the phage: it circularizes the phage DNA into a plasmid, separates interlinked plasmid rings so they are passed to both daughter bacteria equally and may help maintain copy numbers through an alternative means of replication. The P1 phage DNA when released into the host from the virion is in the form of a linear double stranded DNA molecule. The Cre enzyme targets loxP sites at the ends of this molecule and cyclises the genome. This can also take place in the absence of the Cre lox system with the help of other bacterial and viral proteins. The P1 plasmid is relatively large (≈90Kbp) and hence exists in a low copy number usually one per cell. If the two daughter plasmids get interlinked one of the daughter cells of the host will lose the plasmid. The Cre lox recombination system prevents these situations by unlinking the rings of DNA by carrying out two recombination events (linked rings > single fused ring > two unlinked rings). It is also proposed that rolling circle replication followed by recombination will allow the plasmid to increase its copy number when certain regulators (repA) are limiting. Multiple variants of loxP, in particular lox2272 and loxN, have been used by researchers with the combination of different Cre actions (transient or constitutive) to create a "Brainbow" system that allows multi colouring of mice's brain with four fluorescent proteins. Another report using two lox variants pair but through regulating the length of DNA in one pair results in stochastic gene activation with regulated level of sparseness.