Введение
ДНК, полученная обратной транскрипцией из РНК
В генетике комплементарная ДНК (кДНК) – это ДНК, которая была получена обратной транскрипцией (с помощью обратной транскриптазы) из РНК (например, мРНК или микроРНК). кДНК существует как в одноцепочечной, так и в двуцепочечной формах, и в естественных, и в искусственных формах. В искусственных формах она часто является копией (репликой) естественно существующей ДНК из генома конкретного организма; собственная мРНК организма естественным образом транскрибируется из его ДНК, а кДНК получается обратной транскрипцией из мРНК, создавая дубликат исходной ДНК. Инженерная кДНК часто используется для экспрессии определенного белка в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т.е. гетерологичная экспрессия), или для секвенирования или количественной оценки молекул мРНК с использованием методов, основанных на ДНК (qPCR, RNA-seq). кДНК, кодирующая конкретный белок, может быть перенесена в реципиентную клетку для экспрессии в составе рекомбинантной ДНК, часто в бактериальных или дрожжевых экспрессионных системах. кДНК также генерируется для анализа транскриптомных профилей в тканях, отдельных клетках или отдельных ядрах в таких анализах, как микрочипы, qPCR и RNA-seq. В естественных формах кДНК производится ретровирусами (такими как ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирус иммунодефицита обезьяны и т.д.) и затем интегрируется в геном хозяина, где образует провирус. Термин кДНК также используется, как правило, в контексте биоинформатики, для обозначения последовательности транскрипта мРНК, представленной в виде оснований ДНК (дезокси-ГКАТ), а не оснований РНК (ГКАУ). Патентоспособность кДНК была предметом решения Верховного суда США 2013 года в деле Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc. В качестве компромисса Суд постановил, что патентоспособна только кДНК, состоящая исключительно из экзонов, в то время как изолированные последовательности естественно существующей ДНК, содержащие интроны, не подлежат патентованию.
Синтез
РНК служит матрицей для синтеза кДНК. В живых клетках кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в геномную ДНК-мишень. В молекулярной биологии РНК выделяют из исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. Затем кДНК синтезируется посредством обратной транскрипции in vitro.
Очистка РНК
РНК транскрибируется из геномной ДНК в клетках хозяина и извлекается путем первоначального лизиса клеток, а затем очистки РНК с использованием широко распространенных методов, таких как фенол-хлороформ, силикагелевые колонки и методы экстракции РНК на основе бусин. Методы экстракции варьируются в зависимости от исходного материала. Например, для извлечения РНК из растительной ткани требуются дополнительные реагенты, такие как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других веществ, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования. Для удаления ДНК и белков используются ферменты, такие как ДНКаза и протеиназа K, для их деградации. Важно, чтобы целостность РНК поддерживалась путем инактивации РНКаз с помощью хаотропных агентов, таких как изотиоцианат гуанидина, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем общая РНК отделяется от других клеточных компонентов и осаждается спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простой и быстрой экстракции РНК для конкретных задач. Дополнительные методы на основе бусин могут использоваться для выделения специфических подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК) на основе размера или уникальных участков РНК.
Синтез первой нитки
Используя фермент обратной транскриптазы и очищенные шаблоны РНК, синтезируется одна цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV вируса мышиной лейкемии Молони обычно используется благодаря сниженной активности RNase H, что делает ее подходящей для транскрипции более длинных РНК. Обратная транскриптаза AMV вируса миелобластоза птиц также может быть использована для шаблонов РНК со сложными вторичными структурами (т.е. высокой температурой плавления). кДНК обычно получают из мРНК для анализа экспрессии генов, таких как RT-qPCR и RNA-seq. мРНК селективно обратной транскрибируется с использованием олиго(dT)-праймеров, являющихся комплементарными полиадениловому хвосту на 3'-конце всех мРНК. Олиго(dT)-праймер аннелирует к полиадениловому хвосту мРНК, служа местом связывания для обратной транскриптазы и началом обратной транскрипции. Оптимизированная смесь олиго(dT)- и случайных гексамерных праймеров повышает вероятность получения кДНК полной длины, одновременно снижая 5'- или 3'-смещение. Рибосомная РНК также может быть удалена для обогащения как мРНК, так и транскриптов, не содержащих полиадениловый хвост, таких как некоторые некодирующие РНК.
Синтез второй нитки
Результат синтеза первой цепи, гибриды РНК-ДНК, может быть обработан различными методами синтеза второй цепи или использован непосредственно в последующих анализах. Ранний метод, известный как синтез с использованием шпильки, основывался на образовании шпильки на 3'-конце первой цепи кДНК для инициации синтеза второй цепи. Однако инициация происходит случайным образом, а гидролиз шпильки приводит к потере информации. Процедура Гублера и Хоффмана использует RNase H *E. coli* для разрезания мРНК, которая затем замещается DNA-полимеразой I *E. coli* и сшивается DNA-лигазой *E. coli*. Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности RNase H M-MLV для разрезания мРНК с последующим удалением оставшейся РНК путем добавления RNase H после синтеза второй цепи кДНК ДНК-полимеразой. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.
Приложения
Дополнительная ДНК часто используется в клонировании генов, в качестве генных зондов или при создании библиотеки кДНК. Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую для экспрессии нового генетического материала в виде белка в клетке-реципиенте, в реципиент добавляется кДНК (а не весь ген), поскольку ДНК целого гена может включать участки, не кодирующие белок, или прерывающие кодирующую последовательность белка (например, интроны). Частичные последовательности кДНК часто получают в виде экспрессированных тегов последовательности (EST). С широким распространением амплификации последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), обратная транскрипция обычно проводится как начальный этап, за которым следует ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем разработки специфических ДНК-праймеров, гибридизующихся с 5'- и 3'-концами области кДНК, кодирующей белок. После амплификации последовательность можно разрезать на концах нуклеазами и вставить в один из множества небольших циклических последовательностей ДНК, известных как экспрессионные векторы. Такие векторы обеспечивают саморепликацию внутри клеток и потенциальную интеграцию в ДНК хозяина. Они обычно также содержат сильный промотор для инициации транскрипции целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок. кДНК также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или RT-qPCR. Для секвенирования РНК необходимо фрагментировать из-за ограничений по размеру секвенирующих платформ. Кроме того, вторая синтезированная цепь кДНК должна быть лигирована с адаптерами, позволяющими амплифицировать фрагменты кДНК с помощью ПЦР и связывать их с проточными ячейками секвенатора. Методы генного анализа обычно используют микрочипы и RT-qPCR для количественной оценки уровней кДНК с помощью флуорометрических и других методов. 13 июня 2013 года Верховный суд США вынес решение по делу Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, согласно которому, хотя природные гены не подлежат патентованию, кДНК патентоспособна, поскольку она не встречается в природе.
Вирусы и ретротранспозоны
Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). мРНК используется для синтеза вирусных белков, которые захватывают клетку-хозяина. Пример этого первого этапа – превращение вирусной РНК в кДНК – можно наблюдать в цикле инфекции ВИЧ. В этом цикле мембрана клетки-хозяина присоединяется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду, содержащему две копии вирусной геномной РНК, проникнуть в клетку. Затем копия кДНК создается посредством обратной транскрипции вирусной РНК, процесс, который облегчается шапероном CypA и обратной транскриптазой, связанной с вирусным капсидом. кДНК также генерируется ретротранспозонами в геномах эукариот. Ретротранспозоны – это подвижные генетические элементы, которые перемещаются внутри, а иногда и между геномами, используя РНК-промежуточные продукты. Этот механизм схож с механизмом, используемым вирусами, за исключением того, что ретротранспозоны не образуют инфекционные частицы.