Введение

Плазмида – это небольшая внехромосомная молекула ДНК в клетке, физически отделённая от хромосомной ДНК и способная к независимому реплицированию. Чаще всего они встречаются в виде небольших кольцевых молекул двухцепочечной ДНК у бактерий, однако плазмиды иногда обнаруживаются у архей и эукариотических организмов. В природе плазмиды часто несут гены, способствующие выживанию организма и обеспечивающие селективное преимущество, например, устойчивость к антибиотикам. В то время как хромосомы велики и содержат всю необходимую генетическую информацию для жизни в нормальных условиях, плазмиды обычно очень малы и содержат лишь дополнительные гены, которые могут быть полезны в определенных ситуациях или условиях. Искусственные плазмиды широко используются в качестве векторов в молекулярном клонировании, обеспечивая репликацию рекомбинантных последовательностей ДНК в организмах-хозяевах. В лаборатории плазмиды могут быть введены в клетку посредством трансформации. Синтетические плазмиды доступны для приобретения в интернете. Плазмиды рассматриваются как репликоны – единицы ДНК, способные к автономному реплицированию в подходящем хозяине. Однако, как и вирусы, плазмиды обычно не классифицируются как живые организмы. Плазмиды передаются от одной бактерии к другой (даже к бактериям другого вида) преимущественно посредством конъюгации. Этот перенос генетического материала от хозяина к хозяину является одним из механизмов горизонтального переноса генов, и плазмиды рассматриваются как часть мобилома. В отличие от вирусов, которые заключают свой генетический материал в защитную белковую оболочку, называемую капсидом, плазмиды представляют собой "голую" ДНК и не кодируют гены, необходимые для упаковки генетического материала для передачи новому хозяину; однако некоторые классы плазмид кодируют конъюгативный "половой" пилюс, необходимый для их собственного переноса. Размер плазмид варьируется от 1 до более 400 кбп, а количество идентичных плазмид в одной клетке может колебаться от одного до тысяч в определенных обстоятельствах.

История

Термин «плазмида» был введен в 1952 году американским молекулярным биологом Джошуа Ледербергом для обозначения «любого экстрахромосомного наследственного детерминанта». Первоначально термин использовался для обозначения любого бактериального генетического материала, существующего вне хромосомно хотя бы на протяжении части его цикла репликации, но поскольку это определение включало бактериальные вирусы, понятие плазмиды со временем было уточнено, чтобы охватить генетические элементы, которые размножаются автономно. И для отличия от вирусов определение было сужено до генетических элементов, которые существуют исключительно или преимущественно вне хромосомы и способны к автономной репликации. Плазмиды почти всегда несут хотя бы один ген. Многие гены, переносимые плазмидами, полезны для клеток-хозяев, например, обеспечивая выживание клетки-хозяина в среде, которая в противном случае была бы смертельной или ограничивала бы рост. Некоторые из этих генов кодируют признаки устойчивости к антибиотикам или к тяжелым металлам, в то время как другие могут продуцировать факторы вирулентности, позволяющие бактерии колонизировать хозяина и преодолевать его защиту, или выполнять специфические метаболические функции, позволяющие бактерии использовать определенные питательные вещества, включая способность разлагать устойчивые или токсичные органические соединения. Плазмиды также могут обеспечивать бактерии способностью к фиксации азота. Однако некоторые плазмиды не оказывают заметного влияния на фенотип клетки-хозяина, или их польза для клетки-хозяина не может быть определена, и такие плазмиды называются криптическими. Естественно встречающиеся плазмиды значительно различаются по своим физическим свойствам. Их размер может варьироваться от очень маленьких мини-плазмид, менее 1 килопары (kbp), до очень больших мегаплазмид, содержащих несколько мегапар (Mbp). В верхнем диапазоне мегаплазмиды мало чем отличаются от минихромосом. Плазмиды обычно имеют кольцевую форму, но известны также примеры линейных плазмид. Эти линейные плазмиды требуют специализированных механизмов для репликации своих концов. В отдельной клетке может присутствовать различное количество плазмид – от одной до нескольких сотен. Нормальное количество копий плазмиды, обнаруживаемое в одной клетке, называется числом копий плазмиды и определяется регуляцией инициации репликации и размером молекулы. Более крупные плазмиды, как правило, имеют меньшее число копий. Линейные плазмиды неизвестны среди фитопатогенов, за исключением Rhodococcus fascians.

Классификации и типы

Плазмиды могут быть классифицированы несколькими способами. Плазмиды можно классифицировать на конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Конъюгативные плазмиды содержат набор генов переноса, которые способствуют конъюгации между различными клетками. Неконъюгативные плазмиды не способны инициировать конъюгацию, поэтому они могут передаваться только при помощи конъюгативных плазмид. Существует также промежуточный класс плазмид – мобилизуемые, которые несут лишь часть генов, необходимых для переноса. Они могут паразитировать на конъюгативной плазмиде, передаваясь с высокой частотой только в ее присутствии. Плазмиды также можно классифицировать по группам несовместимости. Микроорганизмы могут содержать различные типы плазмид, но разные плазмиды могут существовать в одной бактериальной клетке только если они совместимы. Если две плазмиды несовместимы, одна из них быстро теряется из клетки. Таким образом, различные плазмиды могут быть отнесены к разным группам несовместимости в зависимости от их способности к совместному существованию. Несовместимые плазмиды (принадлежащие к одной и той же группе несовместимости) обычно используют одни и те же механизмы репликации или партиционирования и, следовательно, не могут сохраняться вместе в одной клетке. Другой способ классификации плазмид – по функциям. Существует пять основных классов: F-плазмиды плодородия, содержащие tra-гены. Они способны к конъюгации и приводят к экспрессии половых пилей. Резистентные (R) плазмиды, содержащие гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам или антибактериальным агентам. Исторически известные как R-факторы, до установления природы плазмид. Col-плазмиды, содержащие гены, кодирующие бактериоцины – белки, способные убивать другие бактерии. Деградативные плазмиды, обеспечивающие расщепление необычных веществ, например, толуола и салициловой кислоты. Вирулентные плазмиды, превращающие бактерию в патоген, например, Ti-плазмида у Agrobacterium tumefaciens.

Плазмиды могут принадлежать более чем к одной из этих функциональных групп.

РНК-плазмиды

Хотя большинство плазмид представляют собой молекулы двухцепочечной ДНК, некоторые состоят из одноцепочечной ДНК или преимущественно двухцепочечной РНК. РНК-плазмиды – это неинфекционные внехромосомные линейные репликоны РНК, как с оболочкой (инкапсидированные), так и без оболочки (неинкапсидированные), обнаруженные у грибов и различных растений, от водорослей до наземных растений. Однако во многих случаях бывает сложно или невозможно чётко отличить РНК-плазмиды от РНК-вирусов и других инфекционных РНК.

Хромиды

Хромиды — это элементы, существующие на границе между хромосомой и плазмидой, обнаруженные примерно у 10% бактериальных видов, геномы которых были секвенированы к 2009 году. Эти элементы несут важные гены и имеют частоту использования кодонов, сходную с хромосомой, однако используют механизм репликации плазмидного типа, например, систему RepABC с низкой копийностью. В связи с этим в прошлом их классифицировали как минихромосомы или мегаплазмиды. У бактерий рода Vibrio репликация хромосомы и хромида синхронизируется за счет постоянного соотношения размеров геномов.

Векторы

Искусственно сконструированные плазмиды могут использоваться в качестве векторов в генетической инженерии. Эти плазмиды служат важными инструментами в генетических и биотехнологических лабораториях, где они обычно используются для клонирования и амплификации (создания множества копий) или экспрессии определенных генов. Широкий спектр плазмид доступен в продаже для этих целей. Ген, подлежащий репликации, обычно встраивается в плазмиду, которая, как правило, содержит ряд элементов, необходимых для ее использования. К ним относятся ген, обеспечивающий устойчивость к определенным антибиотикам (ампициллин наиболее часто используется для бактериальных штаммов), начало репликации, позволяющее бактериальным клеткам реплицировать ДНК плазмиды, и подходящая область для клонирования (именуемая множественным сайтом клонирования). Нестабильность структуры ДНК может быть определена как серия спонтанных событий, приводящих к непредвиденной перестройке, потере или приобретению генетического материала. Такие события часто инициируются транспозицией подвижных элементов или присутствием нестабильных элементов, таких как неканонические (не-B) структуры. Вспомогательные области, относящиеся к бактериальному "каркасу", могут быть вовлечены в широкий спектр явлений структурной нестабильности. Хорошо известные катализаторы генетической нестабильности включают прямые, инвертированные и тандемные повторы, которые часто встречаются в большом количестве коммерчески доступных векторов для клонирования и экспрессии. Последовательности вставки также могут серьезно влиять на функцию плазмиды и ее продуктивность, вызывая делеции и перестройки, активацию, подавление или инактивацию экспрессии соседних генов. Следовательно, сокращение или полное устранение избыточных некодирующих последовательностей "каркаса" значительно снизит предрасположенность к таким событиям и, как следствие, общую рекомбиногенную способность плазмиды.

Клонирование

Плазмиды являются наиболее часто используемыми бактериальными векторами клонирования. Эти векторы клонирования содержат участок, позволяющий вставлять фрагменты ДНК, например, мультиклонирующий сайт или полилинкер, который содержит несколько часто используемых сайтов рестрикции, к которым могут быть лигированы фрагменты ДНК. После вставки гена интереса плазмиды вводят в бактерии посредством процесса, называемого трансформацией. Эти плазмиды содержат селективный маркер, обычно ген устойчивости к антибиотикам, который обеспечивает бактериям способность выживать и размножаться в селективной среде, содержащей соответствующие антибиотики. Клетки после трансформации подвергаются воздействию селективной среды, и выживают только клетки, содержащие плазмиду. Таким образом, антибиотики действуют как фильтр, отбирающий только бактерии, содержащие плазмидную ДНК. Вектор также может содержать другие маркерные гены или гены-репортеры для облегчения отбора плазмид с клонированными вставками. Бактерии, содержащие плазмиду, затем можно выращивать в больших количествах, собирать, и плазмиду интереса можно выделить с использованием различных методов подготовки плазмид. Плазмидный вектор клонирования обычно используется для клонирования фрагментов ДНК размером до 15 кб. Для клонирования более длинных фрагментов ДНК используются лямбда-фаги с делетированными генами лизогении, космиды, бактериальные искусственные хромосомы или искусственные хромосомы дрожжей.

Производство белка

Еще одно важное применение плазмид — получение больших количеств белков. В этом случае исследователи выращивают бактерии, содержащие плазмиду с геном, представляющим интерес. Подобно тому, как бактерия производит белки для обеспечения устойчивости к антибиотикам, ее можно индуцировать к производству больших количеств белков, кодируемых вставленным геном. Это недорогой и простой способ массового производства белка, кодируемого этим геном, например, инсулина.

Генная терапия

Плазмиды также могут использоваться для передачи генов в качестве потенциального метода лечения в генной терапии, позволяя клеткам экспрессировать недостающий белок. Некоторые формы генной терапии требуют вставки терапевтических генов в заранее определенные участки хромосом в геноме человека. Плазмидные векторы – один из множества подходов, которые можно использовать для этой цели. Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) позволяют создавать специфический разрыв обеих нитей ДНК и индуцировать гомологичную рекомбинацию. Плазмиды, кодирующие ZFN, могут способствовать доставке терапевтического гена в конкретное место, избегая повреждения клеток, мутаций, вызывающих рак, или иммунного ответа.

Модели заболеваний

Плазмиды исторически использовались для генетической модификации эмбриональных стволовых клеток крыс с целью создания моделей генетических заболеваний крыс. Низкая эффективность методов, основанных на плазмидах, препятствовала их применению для создания более точных моделей человеческих клеток. Однако, прогресс в технологиях рекомбинации с использованием аденоассоциированных вирусов и цинковых пальцевых нуклеаз позволил разработать новое поколение изогенных моделей заболеваний человека.

Эпизомы

Термин «эпизома» был введен Франсуа Джейкобом и Эли Воллманом в 1958 году для обозначения внехромосомного генетического материала, который может реплицироваться автономно или интегрироваться в хромосому. Однако с момента введения термина его использование изменилось, поскольку «плазмида» стало предпочтительным термином для автономно реплицирующейся внехромосомной ДНК. На симпозиуме в Лондоне в 1968 году некоторые участники предложили отказаться от термина «эпизома», хотя другие продолжали использовать его с изменением значения. Сегодня некоторые авторы используют термин «эпизома» в контексте прокариот для обозначения плазмиды, способной интегрироваться в хромосому. Интегративные плазмиды могут реплицироваться и стабильно поддерживаться в клетке на протяжении нескольких поколений, но на определенном этапе они будут существовать как независимые молекулы плазмид. В контексте эукариот термин «эпизома» используется для обозначения неинтегрированной внехромосомной кольцевой ДНК, которая может реплицироваться в ядре. Наиболее распространенными примерами являются вирусы, такие как герпесвирусы, аденовирусы и полиомавирусы, но некоторые из них представляют собой плазмиды. Другие примеры включают аберрантные фрагменты хромосом, такие как двойные минутные хромосомы, которые могут возникать во время искусственного усиления генов или в патологических процессах (например, при трансформации раковых клеток). Эпизомы в эукариотах ведут себя аналогично плазмидам в прокариотах, поскольку ДНК стабильно поддерживается и реплицируется вместе с клеткой-хозяином. Также могут возникать цитоплазматические вирусные эпизомы (например, при инфекциях поксвирусами). Некоторые эпизомы, такие как герпесвирусы, реплицируются по механизму перекатывающегося круга, аналогично бактериофагам (бактериальным фаговым вирусам). Другие реплицируются посредством двунаправленного механизма репликации (плазмиды типа тета). В любом случае, эпизомы остаются физически отделенными от хромосом клетки-хозяина. Несколько онкогенных вирусов, включая вирус Эпштейна-Барр и герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши, поддерживаются в виде латентных, хромосомно-отличимых эпизомов в раковых клетках, где вирусы экспрессируют онкогены, способствующие пролиферации раковых клеток. При раке эти эпизомы пассивно реплицируются вместе с хромосомами хозяина при делении клетки. Когда эти вирусные эпизомы инициируют литическую репликацию для генерации множества вирусных частиц, они обычно активируют врожденные иммунные защитные механизмы клетки-хозяина, приводящие к ее гибели.

Содержание плазмиды

Некоторые плазмиды или микробные хозяева содержат систему зависимости или постсегрегационную систему уничтожения (PSK), например, систему hok/sok (убийство хозяина/подавитель убийства) плазмиды R1 в Escherichia coli. Этот вариант производит как долговечный яд, так и кратковременный антидот. В литературе описано несколько типов систем зависимости плазмид (токсин/антитоксин, основанные на метаболизме, системы ORT) и их применение в биотехнологических (ферментационных) или биомедицинских (вакцинотерапевтических) целях. Дочерние клетки, сохранившие копию плазмиды, выживают, а дочерняя клетка, не унаследовавшая плазмиду, погибает или испытывает замедление роста из-за остаточного яда от родительской клетки. В конечном итоге, общая продуктивность может быть увеличена. В отличие от этого, плазмиды, используемые в биотехнологии, такие как pUC18, pBR322 и производные векторы, редко содержат системы токсин-антитоксиновой зависимости и, следовательно, требуют поддержания селекции антибиотиками для предотвращения потери плазмид.

Растительные митохондриальные плазмиды

Митохондрии многих высших растений содержат самореплицирующиеся, внехромосомные линейные или кольцевые молекулы ДНК, которые рассматриваются как плазмиды. Их размер может варьироваться от 0,7 кб до 20 кб. Плазмиды обычно классифицируют на две категории: кольцевые и линейные. Кольцевые плазмиды были выделены и обнаружены у многих различных растений, при этом плазмиды *Vicia faba* и *Chenopodium album* наиболее изучены, и известен их механизм репликации. Кольцевые плазмиды могут реплицироваться, используя θ-модель репликации (как у *Vicia faba*) и посредством репликации с катящимся кругом (как у *C. album*). Линейные плазмиды были идентифицированы у некоторых видов растений, таких как *Beta vulgaris*, *Brassica napus*, *Zea mays* и др., но встречаются реже, чем их кольцевые аналоги. Функция и происхождение этих плазмид остаются в основном неизвестными. Предполагается, что кольцевые плазмиды имеют общего предка, поскольку некоторые гены в митохондриальных плазмидах имеют соответствия в ядерной ДНК, что указывает на межкомпартментальный обмен. В то же время, линейные плазмиды демонстрируют структурное сходство, такое как инвертроны, с вирусной ДНК и грибковыми плазмидами; как и грибковые плазмиды, они также имеют низкое содержание GC. Эти наблюдения привели к гипотезам о том, что линейные плазмиды имеют вирусное происхождение или попали в митохондрии растений посредством горизонтального переноса генов от патогенных грибов.

Экстракция плазмидной ДНК

Плазмиды часто используются для выделения определенной последовательности, поскольку их легко отделить от остального генома. Для использования в качестве векторов и для молекулярного клонирования плазмиды часто необходимо изолировать. Существует несколько методов выделения плазмидной ДНК из бактерий, от мини-препа до макси-препа или выделения больших количеств.

Коллекции плазмид

За прошедшие годы было создано множество плазмид, и исследователи предоставляли их для хранения в плазмидные базы данных, такие как некоммерческие организации Addgene и BCCM/LMBP. Из этих баз данных можно найти и запросить плазмиды для научных исследований. Исследователи также часто загружают последовательности плазмид в базу данных NCBI, откуда можно получить последовательности конкретных плазмид.