Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Молекулярные маяки, или молекулярные маяковые зонды, — это олигонуклеотидные гибридизационные зонды, способные сигнализировать о присутствии специфических нуклеиновых кислот в гомогенных растворах. Молекулярные маяки представляют собой молекулы в форме шпильки с внутренне гашенным флюорофором, флуоресценция которого восстанавливается при связывании с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты. Это новый нерадиоактивный метод для обнаружения специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Они полезны в случаях, когда изоляция гибридов «зонд-мишень» из избытка гибридизационных зондов невозможна или нежелательна.
Molecular beacons, or molecular beacon probes, are oligonucleotide hybridization probes that can report the presence of specific nucleic acids in homogenous solutions. Molecular beacons are hairpin shaped molecules with an internally quenched fluorophore whose fluorescence is restored when they bind to a target nucleic acid sequence. This is a novel non radioactive method for detecting specific sequences of nucleic acids. They are useful in situations where it is either not possible or desirable to isolate the probe target hybrids from an excess of the hybridization probes.
Молекулярные маякные зонды
Типичный молекулярный маяк имеет длину 25 нуклеотидов. Средние 15 нуклеотидов комплементарны целевой ДНК или РНК и не образуют пар оснований друг с другом, в то время как пять нуклеотидов на каждом конце комплементарны друг другу, а не целевой ДНК. Типичную структуру молекулярного маяка можно разделить на 4 части: 1) петля – область молекулярного маяка длиной 18–30 пар оснований, комплементарная целевой последовательности; 2) стебель, образованный присоединением к обоим концам петли двух коротких (от 5 до 7 нуклеотидных остатков) олигонуклеотидов, комплементарных друг другу; 3) 5'-флюорофор, ковалентно присоединенный к 5'-концу молекулярного маяка, – флуоресцентный краситель; 4) 3'-тушитель (нефлуоресцентный) краситель, ковалентно присоединенный к 3'-концу молекулярного маяка. Когда маяк находится в замкнутой форме, тушитель находится вблизи флюорофора, что приводит к гашению флуоресцентного излучения последнего. Если нуклеиновая кислота, подлежащая обнаружению, комплементарна цепи в петле, происходит гибридизация. Дуплекс, образованный между нуклеиновой кислотой и петлей, более стабилен, чем дуплекс стебля, поскольку в первом дуплексе задействовано больше пар оснований. Это приводит к разделению стебля и, следовательно, флюорофора и тушителя. Как только флюорофор больше не находится рядом с тушителем, облучение гибрида светом вызывает флуоресцентное излучение. Наличие излучения указывает на то, что произошла гибридизация и, следовательно, целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствует в образце.
A typical molecular beacon probe is 25 nucleotides long. The middle 15 nucleotides are complementary to the target DNA or RNA and do not base pair with one another, while the five nucleotides at each terminus are complementary to each other rather than to the target DNA. A typical molecular beacon structure can be divided in 4 parts: 1) loop, an 18–30 base pair region of the molecular beacon that is complementary to the target sequence; 2) stem formed by the attachment to both termini of the loop of two short (5 to 7 nucleotide residues) oligonucleotides that are complementary to each other; 3) 5' fluorophore at the 5' end of the molecular beacon, a fluorescent dye is covalently attached; 4) 3' quencher (non fluorescent) dye that is covalently attached to the 3' end of the molecular beacon. When the beacon is in closed loop shape, the quencher resides in proximity to the fluorophore, which results in quenching the fluorescent emission of the latter. If the nucleic acid to be detected is complementary to the strand in the loop, the event of hybridization occurs. The duplex formed between the nucleic acid and the loop is more stable than that of the stem because the former duplex involves more base pairs. This causes the separation of the stem and hence of the fluorophore and the quencher. Once the fluorophore is no longer next to the quencher, illumination of the hybrid with light results in the fluorescent emission. The presence of the emission reports that the event of hybridization has occurred and hence the target nucleic acid sequence is present in the test sample.
Использование в клеточной инженерии
Было сообщено об использовании фторгенных сигнальных олигонуклеотидных зондов для обнаружения и изоляции клеток, экспрессирующих один или несколько желаемых генов, включая создание мультигенных стабильных клеточных линий, экспрессирующих гетеромультимерический эпителиальный натриевый канал (αβγ ENaC), натриевый вольтаж-зависимый ионный канал 1.7 (NaV1.7 αβ1β2), четыре уникальные комбинации субъединиц ионного канала рецептора γ-аминомасляной кислоты A (GABAA) – α1β3γ2s, α2β3γ2s, α3β3γ2s и α5β3γ2s, регулятор проводимости при муковисцидозе (CFTR), CFTR Δ508 и два G-белок-связанных рецептора (GPCR).
Fluorogenic signaling oligonucleotide probes were reported for use to detect and isolate cells expressing one or more desired genes, including the production of multigene stable cell lines expressing heteromultimeric epithelial sodium channel (αβγ ENaC), sodium voltage gated ion channel 1.7 (NaV1.7 αβ1β2), four unique γ aminobutyric acid A (GABAA) receptor ion channel subunit combinations α1β3γ2s, α2β3γ2s, α3β3γ2s and α5β3γ2s, cystic fibrosis conductance regulator (CFTR), CFTR Δ508 and two G protein coupled receptors (GPCRs).
Синтез
Молекулярные маяки – это синтетические олигонуклеотиды, чье приготовление хорошо задокументировано. Помимо стандартного набора нуклеозидных фосфорамидитов, для синтеза также необходима твердая подложка, модифицированная тушителем, и строительный блок фосфорамидита, предназначенный для присоединения защищенного флуоресцентного красителя. Термин "молекулярные маяки" впервые был использован, а синтез и функциональность продемонстрированы в 1996 году.
Molecular beacons are synthetic oligonucleotides whose preparation is well documented. In addition to the conventional set of nucleoside phosphoramidites, the synthesis also requires a solid support derivatized with a quencher and a phosphoramidite building block designed for the attachment of a protected fluorescent dye. The first use of the term molecular beacons, synthesis and demonstration of function was in 1996.