Онкостатин M: структура, функции и рецепторы человека.

Введение

Белки млекопитающих, обнаруженные у человека Homo sapiens.

Oncostatin M, также известный как OSM, – это белок, кодируемый геном OSM у людей. Из этих цитокинов он наиболее близок к ингибирующему фактору лейкемии (LIF) как по структуре, так и по функции. OSM передает сигналы через клеточные поверхностные рецепторы, содержащие белок gp130. Рецептор типа I состоит из gp130 и LIFR, рецептор типа II – из gp130 и OSMR. OSM – стабильный белок, сохраняющий активность в диапазоне pH от 2 до 11 и устойчивый к нагреванию в течение одного часа при 56 °C. Частичная последовательность аминокислот позволила выделить человеческую ОСМ-кДНК и впоследствии геномные клоны. Полный клон кДНК hOSM кодирует прекурсор из 252 аминокислот, первые 25 из которых функционируют как секреторный сигнальный пептид, удаление которого приводит к образованию растворимой pro OSM, состоящей из 227 аминокислот. Расщепление C-концевых 31 аминокислотных остатков в месте расщепления, подобном трипсиновому, дает полностью активную форму, состоящую из 196 остатков. В hOSM присутствуют два потенциальных сайта N-гликозилирования, оба из которых сохраняются в зрелой форме. OSM, состоящий из 196 аминокислотных остатков, является преобладающей формой, выделенной из различных клеточных линий, и соответствует гликопротеину массой 28 кДа, хотя более крупная pro OSM, состоящая из 227 остатков, может быть выделена из клеток, прошедших сверхэкспрессию. Pro OSM, хотя и менее эффективен в тестах на ингибирование роста, демонстрирует сходную аффинность связывания с клетками в радиолигандных анализах. Механизм нацеливания OSM на эти внутриклеточные компартменты до сих пор остается неясным.

Структура

Анализ первичной последовательности ОСМ относит его к группе цитокинов gp130. ОСМ наиболее похож на LIF, имея 22% идентичности последовательности и 30% сходства. Интересно, что гены ОСМ и LIF расположены тандемно на 22-й хромосоме человека. Гены LIF и ОСМ имеют очень схожее строение, включая сходные промоторные элементы и структуру экзонов-интронов. Эти данные позволяют предположить, что ОСМ и LIF возникли относительно недавно в эволюционном плане в результате дупликации генов. Из пяти остатков цистеина в последовательности человеческого ОСМ четыре участвуют в дисульфидных связях, одна из которых, между спиралями А и В, необходима для активности ОСМ. Свободный остаток цистеина, по-видимому, не опосредует димеризацию ОСМ. Трехмерная структура человеческого ОСМ была определена с атомарным разрешением, что подтверждает предсказанную топологию длинной цепи с четырьмя спиралями. Впоследствии было показано, что присутствие только gp130 достаточно для воспроизведения формы рецептора с низкой аффинностью, а ко-трансфекция клеток COS 7 с LIFR и gp130 привела к образованию рецептора с высокой аффинностью. Однако дальнейшие эксперименты показали, что не все действия ОСМ могут быть воспроизведены LIF, то есть некоторые клетки, не реагирующие на LIF, реагируют на ОСМ. Эти данные намекали на существование дополнительной цепи рецептора, специфичной для лиганда, что привело к клонированию OSMR. Эти два рецепторных комплекса, а именно gp130/LIFR и gp130/OSMR, были названы рецепторами онкостатина М типов I и II. Способность ОСМ передавать сигнал через два рецепторных комплекса удобно объясняет общие и уникальные эффекты ОСМ по отношению к LIF. Таким образом, общая биологическая активность LIF и ОСМ опосредуется рецептором типа I, а специфическая активность ОСМ – рецептором типа II. Мышиный гомолог ОСМ был обнаружен только в 1996 году, а мышиный гомолог OSMR был клонирован только в 1998 году. До недавнего времени считалось, что mOSM передает сигнал только через мышиный рецептор типа II, а именно через комплексы mOSMR/mgp130, из-за низкой аффинности к аналогу рецептора типа I. Однако теперь известно, что, по крайней мере, в костной ткани, mOSM способен передавать сигнал как через mOSMR/mgp130, так и через mLIFR/mgp130. JAK1, JAK2 и tyk2 не взаимозаменяемы в системе gp130, что было продемонстрировано с использованием дефицитных клеточных линий JAK1, Jak2 или Tyk2, полученных от мутантных мышей. Клетки мышей с дефицитом JAK1 демонстрируют снижение активации STAT и генерацию биологических ответов в ответ на IL-6 и LIF. Напротив, фибробласты, полученные от мышей с нулевым уровнем JAK2, могут реагировать на IL-6, с обнаруживаемой тирозиновой фосфорилированием gp130, JAK1 и TYK2. Таким образом, JAK1 представляется критически важным JAK, необходимым для сигналинга gp130. Активация одних и тех же JAK всеми тремя рецепторными комбинациями (gp130/gp130, gp130/LIFR, gp130/OSMR) ставит вопрос о том, как IL-6, LIF и ОСМ могут активировать различные внутриклеточные сигнальные пути. Выбор конкретных субстратов, то есть изоформ STAT, зависит не от того, какой JAK активируется, а определяется специфическими мотивами, особенно мотивами на основе тирозина, в каждом внутриклеточном домене рецептора. Выравнивание внутриклеточных доменов gp130, LIFR и hOSMR приводит к некоторым интересным наблюдениям. Идентичность последовательности обычно довольно низкая в группе, в среднем 4,6%. Однако, как и у многих рецепторов гематопоэтина I класса, присутствуют два коротких проксимальных к мембране мотива, называемые box 1 и box 2. Кроме того, эти рецепторы также содержат область, богатую серином, и третий, менее консервативный мотив, называемый box 3. Box 1 присутствует во всех рецепторах цитокинов, передающих сигнал. Он характеризуется высоким содержанием остатков пролина и необходим для ассоциации и активации JAK. Box 2 также важен для ассоциации с JAK. Gp130 содержит последовательности box1 и box2 в проксимальной к мембране части цитоплазматической области, находящиеся в пределах минимальных 61 аминокислоты, необходимых для активации рецептора. Мутации в области box1 снижают способность gp130 связываться с JAK и отменяют индуцированную лигандом активацию Jak1 и Jak2. Box 2 также способствует активации и связыванию JAK. Исследования с различными усеченными мутантами gp130 показывают снижение связывания Jak2 и отмену некоторых биологических эффектов при удалении box2. Однако JAK способны ассоциироваться с gp130, лишенным box2, при их сверхэкспрессии. Ко-иммунопреципитация Jak1, Jak2 и Tyk2 с рецепторами, содержащими цитоплазматические части LIFR или OSMR. В случае gp130 box 3 не является необходимым для активности, однако наличие неповрежденной последовательности box 3 необходимо для определенных аспектов сигналинга gp130, то есть стимуляции транскрипции через STAT 3 ответный элемент. В дополнение к низкой консервации последовательности среди внутриклеточных доменов рецепторов gp130, также плохо консервируется количество и положение консервативных остатков тирозина. Например, LIFR и OSMR разделяют три гомологичных тирозина. Напротив, ни один из остатков тирозина, присутствующих во внутриклеточном домене gp130, не имеет эквивалентов с LIFR или OSMR, даже несмотря на то, что внутриклеточные области LIFR и gp130 имеют большую идентичность последовательности, чем LIFR и OSMR. Среди белков, рекрутируемых к рецепторам цитокинов типа I, белки STAT остаются наиболее изученными. Было показано, что гомодимеризация gp130 фосфорилирует и активирует как STAT1, так и STAT3. Gp130 предпочтительно активирует STAT3, что он может делать через четыре консенсусных последовательности активации STAT3 YXXQ: (YRHQ), (YFKQ), Y905 (YLPQ), Y915 (YMPQ). Меньшая склонность к активации STAT1 может быть отражением меньшего количества последовательностей активации STAT1, YZPQ (где X – любой остаток, а Z – любой незаряженный остаток), а именно Y905 и Y915. Цитокины, которые передают сигнал через гомодимерные комплексы LIFR или OSMR (то есть лишенные gp130), в настоящее время неизвестны в природе. Однако различные исследователи пытались искусственно гомодимеризовать внутриклеточные домены LIFR и OSMR, с противоречивыми результатами, путем создания химерных рецепторов, которые сливают внеклеточный домен одного цитокинового рецептора с внутриклеточным доменом LIFR или OSMR. Сигналинг через гомодимеризацию внутриклеточного домена LIFR был продемонстрирован в гепатомах и нейробластомах, а также в клетках COS 1 с использованием химерных рецепторов, которые гомодимеризуются при стимуляции их когнитивными цитокинами (то есть GCSF, нейротрофин 3, EGF). Однако химера GCSFR/LIFR не смогла сигнализировать в клетках M1 или Baf. Различия в использовании рецепторов ОСМ у человека и мыши были неизвестны. В результате несколько исследователей использовали человеческий ОСМ в мышиных анализах, и любые выводы, сделанные из результатов этих экспериментов, будут представлять LIF, то есть сигналинг через комплексы gp130/LIFR. ОСМ синтезируется стимулированными Т-клетками и моноцитами. Стимуляция первичной культуры эндотелиальных клеток (HUVEC) с помощью hOSM приводит к задержанной, но продолжительной регуляции P-селектина, который облегчает адгезию и перекатывание лейкоцитов, необходимые для их экстравазации. ОСМ также способствует продукции IL-6 этими клетками. ОСМ является основным фактором роста для "веретенообразных клеток" саркомы Капоши, которые имеют эндотелиальное происхождение. Эти клетки не экспрессируют LIFR, но экспрессируют OSMR на высоком уровне. Например, ОСМ может модулировать экспрессию IL-6, важного регулятора системы защиты хозяина. ОСМ регулирует экспрессию различных протеаз и ингибиторов протеаз, например, желатиназы и ингибитора альфа-1-химотрипсина.

Primary sequence analysis of OSM allocates it to the gp130 group of cytokines. OSM most resembles LIF, bearing 22% sequence identity and 30% similarity. Incidentally the genes for OSM and LIF occur in tandem on human chromosome 22. Both LIF and OSM genes have very similar gene structures sharing similar promoter elements and intron exon structure. These data suggest that OSM and LIF arose relatively recently in evolutionary terms by gene duplication. Of the five cysteine residues within the human OSM sequence four participate in disulfide bridges, one of these disulfide bonds namely between helices A and B is necessary for OSM activity. The free cysteine residue does not appear to mediate dimerisation of OSM. The three dimensional structure of human OSM has been solved to atomic resolution, confirming the predicted long chain four helix bundle topology. Subsequently it was shown that the presence of gp130 alone was sufficient to reproduce the low affinity form of the receptor, and co transfection of COS 7 cells with LIFR and gp130 produced a high affinity receptor. However further experiments demonstrated that not all actions of OSM could be replicated by LIF, that is certain cells that are irresponsive to LIF would respond to OSM. This data hinted to the existence of an additional ligand specific receptor chain which led to the cloning of OSMR. These two receptor complexes, namely gp130/LIFR and gp130/OSMR, were termed the type I and type II Oncostatin M receptors. The ability of OSM to signal via two receptor complexes conveniently offers a molecular explanation to the shared and unique effects of OSM with respect to LIF. Thus common biological activities of LIF and OSM are mediated through the type I receptor and OSM specific activities are mediated through the type II receptor. The murine homologue of OSM was not discovered until 1996, whereas the murine OSMR homologue was not cloned until 1998. Until recently, it was thought that mOSM only signals through the murine type II receptor, namely through mOSMR/mgp130 complexes, because of a low affinity for the type I receptor counterpart. However, it is now known that, in bone at least, mOSM is able to signal through both mOSMR/mgp130 and mLIFR/mgp130. JAK1, JAK2, and tyk2 are not interchangeable in the gp130 system, this has been demonstrated with the use of JAK1, Jak2 or Tyk2 deficient cell lines obtained from mutant mice. Cells from JAK1 deficient mice show reduced STAT activation and generation of biological responses in response to IL 6 and LIF. In contrast, fibroblasts derived from JAK2 null mice can respond to IL 6, with demonstratable tyrosine phosphorylation of gp130, JAK1 and TYK2. Thus it seems JAK1 is the critical JAK required for gp130 signalling. Activation of the same Jaks by all three receptor combinations (gp130/gp130, gp130/LIFR, gp130/OSMR) raises the question of how IL6, LIF and OSM can activate distinct intracellular signaling pathways. Selection of particular substrates, i. e. STAT isoform, depended not on which Jak is activated, but instead are determined by specific motifs, especially tyrosine based motifs, within each receptor intracellular domain. Aligning the intracellular domains of gp130, LIFR and hOSMR results in some interesting observations. Sequence identity is generally quite low across the group averaging at 4.6%. However, as with many Class I Haematopoeitin receptors, two short membrane proximal motifs, termed box 1 and box 2 are present. In addition these receptors also contain a serine rich region and a third more poorly conserved motif termed box 3. Box 1 is present in all signalling cytokine receptors. It is characteristically rich in proline residues and is essential for the association and activation of JAKs. Box 2 is also important for association with JAKs. Gp130 contains box1 and box2 sequences within the membrane proximal part of the cytoplasmic region, lying within the minimum 61 amino acids required for receptor activation. Mutations within the box1 region reduce the ability of gp130 to associate with Jaks and abolish ligand induced activation of Jak1 and Jak2. Box 2 also contributes to activation and binding of JAKs. Studies with various gp130 truncation mutants show a reduction of Jak2 binding and abrogation of certain biological effects upon deletion of box2. However, Jaks are able to associate with gp130 devoid of box2 when overexpressed. Coprecipitation of Jak1, Jak2 and Tyk2 with receptors containing cytoplasmic parts of the LIFR or OSMR. In the case of gp130 box 3 is dispensable for activity, however the presence of an intact box 3 sequence is required for certain aspects of gp130 signalling, i. e. stimulation of transcription through the STAT 3 response element. In addition to the poor sequence conservation amongst the intracellular domains of gp130 receptors, the number and position of conserved tyrosine residues are also poorly conserved. For example, LIFR and OSMR share three homologous tyrosines. In contrast none of the tyrosine residues present in the intracellular domain of gp130 share equivalents with LIFR or OSMR, even though the intracellular regions of LIFR and gp130 share more sequence identity than LIFR and OSMR. Of the proteins recruited to type I cytokine receptors STAT proteins remain the best studied. Homodimerisation of gp130 has been shown to phosphorylate and activate both STAT1 and STAT3. gp130 preferentially activates STAT3 which it can do through four STAT3 activation consensus sequences YXXQ: (YRHQ), (YFKQ), Y905 (YLPQ), Y915 (YMPQ). The lower propensity for STAT1 activation may be a reflection of the lower number of STAT1 activation sequences, YZPQ (where X is any residue and Z is any uncharged residue), namely Y905 and Y915. Cytokines that signal via homodimeric complexes of LIFR or OSMR (i. e. devoid of gp130) are currently unknown in nature. However, various investigators have attempted artificial homodimerisation of LIFR and OSMR intracellular domains, with conflicting results, by constructing receptor chimeras that fuse the extracellular domain of one cytokine receptor with the intracellular domain of LIFR or OSMR. Signalling by LIFR intracellular domain homodimerisation has been demonstrated in hepatoma and neuroblastoma cells, and COS 1 cells by using chimeric receptors that homodimerise upon stimulation with their cognate cytokines (i. e. GCSF, neurotrophin 3, EGF). However a GCSFR/LIFR chimera was not capable of signaling in M1 or Baf cells. differences in human and murine OSM receptor usage were unknown. As a result, several investigators used human OSM in mouse assays and thus any conclusion drawn from the results of these experiments will be representative of LIF, i. e. signalling through gp130/LIFR complexes. OSM is synthesized by stimulated T cells and monocytes. Stimulation of a primary endothelial culture (HUVEC) with hOSM results in delayed but prolonged upregulation of P selectin, which facilitates leukocyte adhesion and rolling, necessary for their extravasation. OSM also promotes the production of IL 6 from these cells. OSM is a major growth factor for Kaposi's sarcoma "spindle cells", which are of endothelial origin. These cells do not express LIFR but do express OSMR at high levels. For example, OSM can modulate the expression of IL 6, an important regulator of the host defence system. OSM regulates the expression of various protease and protease inhibitors, for example Gelatinase and a1 chymotrypsin inhibitor.