Введение
Смешивание ДНК, также известное как молекулярное размножение, является методом случайной рекомбинации in vitro для генерации мутантных генов для направленной эволюции и для быстрого увеличения размера библиотеки ДНК. Три процедуры для выполнения смешивания ДНК - это молекулярное размножение, которое основывается на гомологичной рекомбинации или сходстве последовательностей ДНК, рестрикционные ферменты, которые полагаются на общие участки рестрикции, и нехомологичная случайная рекомбинация, которая требует использования штифтов. В результате случайной рекомбинации смешивание ДНК способно производить белки с новыми качествами или множественными выгодными характеристиками, полученными из родительских генов.
История
О смешивании ДНК путем молекулярного размножения впервые сообщил в 1994 году Виллем П. С. Штеммер. Затем он завершил модифицированную реакцию ПЦР, в которой не использовались праймеры, что привело к отжигу гомологичных фрагментов или фрагментов с аналогичными последовательностями. В частности, он указал, что метод может быть использован для модификации белков. Кроме того, смешивание ДНК применяется к белкам и мелким молекулам фармацевтических препаратов, биоремедиации, генной терапии, вакцинам и эволюционировавшим вирусам.
Молекулярная разведение
Во-первых, DNase I используется для фрагментации набора родительских генов на сегменты двойной нитей ДНК, составляющие от 10 50 bp до более 1 kbp. Расширение ПЦР не будет выполнено, если не будет высоко сходных последовательностей ДНК. Недостатком молекулярного размножения является требование о сходстве между последовательностями, что вдохновило на разработку других процедур перемешивания ДНК. Основным недостатком является необходимость наличия общих участков рестрикционного фермента. Конечные части фрагментов делаются тупыми путем добавления T4 ДНК полимеразы. Затем в смесь фрагментов добавляют шнурки с определенным местом ограничения.
Биоремедиация
Перемешивание ДНК также используется для улучшения деградации биологических загрязнителей.
Вакцины
Способность выбирать желательные рекомбинанты с помощью смешивания ДНК использовалась в сочетании со скрининговыми стратегиями для улучшения потенциальных вакцин против инфекций с акцентом на улучшение иммуногенности, производства вакцин, стабильности и перекрестной реактивности на несколько штаммов патогенов. Перемешивание ДНК позволяет создавать ретровирусные векторы с этими атрибутами. Полученные полезные свойства включают повышенную резистентность к внутривенному иммуноглобулину человека (IVIG) и образование клеточного тропизма в новых вирусах. Эти случайные праймеры отжигаются до шаблона ДНК, а затем расширяются фрагментом Кленова. Основными преимуществами StEP являются простота метода и отсутствие очистки фрагментов. Недостатки StEP включают в себя то, что он занимает много времени и требует гомологии последовательности.