Введение

Научные инструменты
микроскопы, инструменты в целом

Микроскоп – это лабораторный прибор, используемый для изучения объектов, которые слишком малы, чтобы быть видимыми невооружённым глазом. Микроскопия – это наука об исследовании мелких объектов и структур с помощью микроскопа. Микроскопический означает невидимый глазу без использования микроскопа. Существует множество типов микроскопов, и их можно классифицировать по-разному. Один из способов – описать метод, который прибор использует для взаимодействия с образцом и создания изображений: либо направляя луч света или электронов через образец по его оптическому пути, либо детектируя фотонное излучение от образца, либо сканируя поверхность образца с помощью зонда на небольшом расстоянии от неё. Наиболее распространённым микроскопом (и первым изобретённым) является оптический микроскоп, который использует линзы для преломления видимого света, проходящего через тонкий образец, чтобы создать наблюдаемое изображение. Другие основные типы микроскопов включают флуоресцентный микроскоп, электронный микроскоп (как просвечивающий, так и сканирующий) и различные типы сканирующих зондовых микроскопов.

История

Хотя объекты, напоминающие линзы, датируются 4000 лет назад, и существуют греческие описания оптических свойств сфер, заполненных водой (V век до н.э.), за которыми последовало множество веков трудов по оптике, самое раннее известное использование простых микроскопов (увеличительных стекол) связано с широким распространением линз в очках в XIII веке. Самые ранние известные примеры составных микроскопов, сочетающих объектив рядом с образцом и окуляр для наблюдения реального изображения, появились в Европе около 1620 года. Изобретатель неизвестен, хотя на протяжении многих лет было сделано множество заявлений. Некоторые из них связаны с центрами изготовления очков в Нидерландах, включая утверждения о том, что он был изобретен в 1590 году Захарием Янссеном (заявление, сделанное его сыном), или отцом Захария, Гансом Мартенсом, или обоими, утверждения о том, что он был изобретен их соседом и конкурентом-изготовителем очков Гансом Липпершеем (который подал заявку на патент на первый телескоп в 1608 году), и утверждения о том, что он был изобретен эмигрантом Корнелисом Дреббелем, у которого была версия в Лондоне в 1619 году. Галилео Галилей (также иногда упоминаемый как изобретатель составного микроскопа) обнаружил после 1610 года, что он может настроить свой телескоп на близкий фокус для рассматривания мелких объектов и, увидев составной микроскоп, созданный Дреббелем и выставленный в Риме в 1624 году, построил свою собственную улучшенную версию. Джованни Фабер предложил название «микроскоп» для составного микроскопа, представленного Галилеем в Accademia dei Lincei в 1625 году (Галилей называл его occhiolino – «маленький глаз»). Рене Декарт (Dioptrique, 1637) описывает микроскопы, в которых вогнутое зеркало, обращенное вогнутостью к объекту, используется вместе с линзой для освещения объекта, который устанавливается на точку, фиксирующую его в фокусе зеркала.

Появление современных световых микроскопов

Первый подробный отчет о микроскопической анатомии органических тканей, основанный на использовании микроскопа, появился только в 1644 году в книге Джамбатттисты Одиерны «L'occhio della mosca», или «The Fly's Eye». Микроскоп оставался в значительной степени диковинкой до 1660-х и 1670-х годов, когда натуралисты в Италии, Нидерландах и Англии начали использовать его для изучения биологии. Итальянский ученый Марчелло Малпиги, которого некоторые историки биологии называют отцом гистологии, начал свой анализ биологических структур с легких. Публикация в 1665 году книги Роберта Гука «Микрография» оказала огромное влияние, главным образом благодаря впечатляющим иллюстрациям. Гук создавал крошечные линзы из маленьких стеклянных шариков, изготовленных путем сплавления концов нитей расплавленного стекла. Затем Ван Левенгук заново открыл эритроциты (после Яна Свамердама) и сперматозоиды, а также способствовал популяризации использования микроскопов для изучения биологической ультраструктуры. 9 октября 1676 года ван Левенгук сообщил об открытии микроорганизмов. Хотя просвечивающие электронные микроскопы (TEM) использовались для исследований еще до Второй мировой войны и стали популярными после нее, сканирующие электронные микроскопы (SEM) стали коммерчески доступны только в 1965 году. Просвечивающие электронные микроскопы получили распространение после Второй мировой войны. Эрнст Руска, работавший в компании Siemens, разработал первый коммерческий просвечивающий электронный микроскоп, а в 1950-х годах начали проводиться крупные научные конференции по электронной микроскопии. В 1965 году профессор сэр Чарльз Оатли и его аспирант Гэри Стюарт разработали первый коммерческий сканирующий электронный микроскоп, который компания Cambridge Instrument Company продавала под названием «Stereoscan». Одним из последних открытий, сделанных с использованием электронного микроскопа, стала возможность идентифицировать вирусы. Поскольку этот микроскоп создает видимое и четкое изображение мелких органелл, в электронном микроскопе нет необходимости в реагентах для обнаружения вирусов или вредных клеток, что обеспечивает более эффективный способ выявления патогенов.

Сканирующие зондовые микроскопы

С 1981 по 1983 год Герд Биннинг и Генрих Роррер работали в IBM в Цюрихе, Швейцария, для изучения явления квантового туннелирования. Они создали практический прибор – сканирующий зондовый микроскоп, основанный на теории квантового туннелирования, который измерял очень малые силы, возникающие при взаимодействии зонда с поверхностью образца. Зонд подносится к поверхности настолько близко, что между зондом и образцом происходит непрерывный поток электронов, создающий ток от поверхности к зонду. Изначально микроскоп не получил широкого признания из-за сложности теоретических основ. В 1984 году Джерри Терсофф и Д. Р. Хаманн, работая в Bell Laboratories компании AT&T в Мюррей-Хилле, штат Нью-Джерси, начали публиковать статьи, устанавливающие связь между теорией и экспериментальными данными, полученными с помощью прибора. В 1985 году появились первые коммерческие образцы, а в 1986 году Герд Биннинг, Квате и Гербер изобрели атомно-силовой микроскоп, после чего Биннинг и Роррер были удостоены Нобелевской премии по физике за разработку сканирующего зондового микроскопа. Разработка новых типов сканирующих зондовых микроскопов продолжается по мере совершенствования технологий изготовления сверхтонких зондов и наконечников.

Флуоресцентные микроскопы

Последние достижения в области световой микроскопии в значительной степени связаны с развитием флуоресцентной микроскопии в биологии. Это обусловлено дифракционным пределом, возникающим из-за природы света или возбуждения, из-за чего разрешение необходимо удвоить для достижения сверхвысокой детализации. Стефан Хелль был удостоен Нобелевской премии по химии в 2014 году за разработку метода STED совместно с Эриком Бетцигом и Уильямом Моернером, которые усовершенствовали флуоресцентную микроскопию для визуализации отдельных молекул.

Рентгеновские микроскопы

Рентгеновские микроскопы – это приборы, использующие электромагнитное излучение, обычно в мягком рентгеновском диапазоне, для визуализации объектов. Технологический прогресс в области рентгеновской линзовой оптики в начале 1970-х годов сделал этот прибор практически применимым для получения изображений. Они часто используются в томографии (см. микрокомпьютерная томография) для создания трехмерных изображений объектов, включая биологические материалы, которые не были химически зафиксированы. В настоящее время ведутся исследования по улучшению оптики для жестких рентгеновских лучей, обладающих большей проникающей способностью. Микроскопы можно разделить на несколько различных классов. Одна из классификаций основана на том, что взаимодействует с образцом для формирования изображения, то есть свет или фотоны (оптические микроскопы), электроны (электронные микроскопы) или зонд (сканирующие зондовые микроскопы). Альтернативно, микроскопы можно классифицировать в зависимости от того, анализируют ли они образец посредством сканирующей точки (конфокальные оптические микроскопы, сканирующие электронные микроскопы и сканирующие зондовые микроскопы) или анализируют образец целиком (широкопольные оптические микроскопы и электронные микроскопы передачи). Широкопольные оптические микроскопы и электронные микроскопы передачи используют теорию линз (оптика для световых микроскопов и электромагнитные линзы для электронных микроскопов) для увеличения изображения, формируемого прохождением волны через образец или отражением от образца. Используемые волны являются электромагнитными (в оптических микроскопах) или электронными пучками (в электронных микроскопах). Разрешение в этих микроскопах ограничено длиной волны излучения, используемого для визуализации образца, при этом более короткие длины волн обеспечивают более высокое разрешение. Сканирующие оптические и электронные микроскопы, такие как конфокальный микроскоп и сканирующий электронный микроскоп, используют линзы для фокусировки пятна света или электронов на образце, а затем анализируют сигналы, генерируемые при взаимодействии пучка с образцом. Затем эта точка сканируется по образцу для анализа прямоугольной области. Увеличение изображения достигается путем отображения данных, полученных при сканировании физически небольшой площади образца на относительно большом экране. Эти микроскопы имеют такое же ограничение разрешения, как широкопольные оптические, зондовые и электронные микроскопы. Сканирующие зондовые микроскопы также анализируют одну точку в образце, а затем сканируют зонд по прямоугольной области образца для построения изображения. Поскольку эти микроскопы не используют электромагнитное или электронное излучение для визуализации, они не подвержены тому же ограничению разрешения, что и оптические и электронные микроскопы, описанные выше.

Оптический микроскоп

Наиболее распространенным типом микроскопа (и первым изобретенным) является оптический микроскоп. Это оптический прибор, содержащий одну или несколько линз, создающих увеличенное изображение образца, расположенного в фокальной плоскости. Оптические микроскопы используют преломляющее стекло (иногда пластик или кварц) для фокусировки света на глаз или на светочувствительный датчик. Зеркальные оптические микроскопы работают по тому же принципу. Обычно увеличение светового микроскопа, при использовании видимого света, достигает 1250×, а теоретический предел разрешения составляет около 0,250 микрометра или 250 нанометров.

Электронный микроскоп

Два основных типа электронных микроскопов – это просвечивающие электронные микроскопы (TEM) и сканирующие электронные микроскопы (SEM). Оба они оснащены серией электромагнитных и электростатических линз для фокусировки высокоэнергетического пучка электронов на образце. В просвечивающем электронном микроскопе электроны проходят сквозь образец, подобно тому, как это происходит в базовой оптической микроскопии. Атомно-силовой микроскоп имеет тонкий зонд, обычно изготовленный из кремния или нитрида кремния, прикрепленный к кантилеверу; зонд сканирует поверхность образца, и силы, вызывающие взаимодействие между зондом и поверхностью образца, измеряются и отображаются в виде карты. Микроскоп ближнего поля, сканирующий оптический микроскоп, аналогичен атомно-силовому микроскопу, но его зонд состоит из источника света в оптическом волокне, покрытого наконечником, который обычно имеет апертуру для прохождения света. Микроскоп может регистрировать как прошедший, так и отраженный свет для измерения локализованных оптических свойств поверхности, как правило, биологического образца. Сканирующие туннельные микроскопы имеют металлический наконечник с единственным атомом на вершине; наконечник прикреплен к трубке, через которую протекает ток. Наконечник сканирует поверхность проводящего образца до тех пор, пока не возникает туннельный ток; ток поддерживается постоянным посредством компьютерного управления движением наконечника, и изображение формируется на основе зарегистрированных движений наконечника.

Мобильные приложения

Мобильные микроскопы-приложения могут опционально использоваться как оптические микроскопы при включенной вспышке. Однако, пользоваться мобильными микроскопами-приложениями сложнее из-за визуальных помех, они часто ограничены 40-кратным увеличением, а также разрешающей способностью объектива камеры.