Multicopy single-stranded DNA

Введение

[[Файл:Myxobacterial msDNA. svg 173thumb 173px 173ms ДНК Stigmatella aurantiaca по сравнению с msDNA из близкородственного Myxococcus xanthus. Гиперизменный домен в последовательности ДНК имеет оттенки серого. Высококонсервативная последовательность АГК РНК, включая ветвь G, окрашена в розовый цвет. Место расщепления РНК между прекурсором и продуктом формы мсДНК обозначено красным треугольником. Перерисован из Dhundale et al.

Открытие

До открытия мсДНК в миксобактериях, группе роящихся, живущих в почве бактерий, считалось, что ферменты, известные как обратные транскриптазы (РТ), существуют только у эукариот и вирусов. Это открытие привело к увеличению исследований в этом районе. В результате было обнаружено, что мсДНК широко распространена среди бактерий, включая различные штаммы Escherichia coli и патогенных бактерий. Дальнейшие исследования обнаружили сходство между кодируемой ВИЧ обратной транскриптазой и открытой рамкой чтения (ORF), обнаруженной в области кодирования мсДНК. Испытания подтвердили наличие активности обратной транскриптазы в сырых лизатах штаммов, содержащих ретроны. Хотя домен RNase H был предварительно идентифицирован в ретроном ORF, позже было обнаружено, что активность RNase H, необходимая для синтеза мсДНК, фактически обеспечивается хозяином.

Ретроны

Открытие мсДНК привело к более широким вопросам относительно того, откуда возникла обратная транскриптаза, поскольку гены, кодирующие обратную транскриптазу (не обязательно связанные с мсДНК), были обнаружены в прокариот, эукариот, вирусах и даже археях. После того, как был обнаружен фрагмент ДНК, кодирующий производство мсДНК в E. coli, было выдвинуто предположение, что бактериофаги могли быть ответственны за введение гена RT в E. coli. Эти открытия свидетельствуют о том, что обратная транскриптаза сыграла роль в эволюции вирусов из бактерий, причем одна из гипотез гласит, что с помощью обратной транскриптазы вирусы могли возникнуть как отколовшийся ген мсДНК, который приобрел белковый слой. Поскольку почти все гены РТ функционируют в ретровирусной репликации и/или движении переносимых элементов, разумно предположить, что ретроны могут быть подвижными генетическими элементами, но мало доказательств в поддержку такой гипотезы, за исключением наблюдаемого факта, что мсДНК широко, но спорадически рассеян среди бактериальных видов таким образом, что предполагает как горизонтальную, так и вертикальную передачу. Поскольку неизвестно, представляют ли ретроны по себе подвижные элементы, ретроны функционально определяются их способностью производить мсДНК, сознательно избегая спекуляций о других возможных действиях.

Функция

Функция мсДНК остается неизвестной, хотя в клетках присутствует много копий. Мутации нокаута, которые не экспрессируют мсДНК, жизнеспособны, поэтому производство мсДНК не является необходимым для жизни в лабораторных условиях. Избыточная экспрессия мсДНК мутагенна, по-видимому, в результате титрования восстановительных белков несовместимыми парами оснований, типичными для их структуры. Сравнение последовательностей мсДНК у Myxococcus xanthus, Stigmatella aurantiaca и многих других бактерий Основные мсДНК, например, у M. xanthus и S. aurantiaca, имеют 94% гомологии последовательности, за исключением домена 19 пар оснований, которая имеет только 42% гомологии последовательности.

Биосинтез

[[Файл:Синтез MSDN. pnggadisthumbgadis270pxgadisProposed механизм синтеза мсДНК. (A) Складка первичной РНК-шаблона в вторичную структуру позволяет 2'-OH группе специфического ветвящегося остатка G служить первичным для инициирования синтеза сДНК ретроновой обратной транскриптазой. (B) Синтез cDNA сопровождается RNase H-перевариванием струн шаблона. (C) В завершенной молекуле мсДНК часть шаблона РНК остается присоединенной к 5'-концу сДНК. RT распознает специфические структуры стволовой петли в предшественнике РНК, что делает синтез msDNA RT очень специфичным для его собственного ретрона. Прим синтеза мсДНК представляет собой увлекательную проблему для нашего понимания синтеза ДНК. ДНК-полимеразы (включая RT) имеют общие высококонсервативные структурные особенности, что означает, что их активные каталитические участки мало различаются от вида к виду или даже между ДНК-полимеразами, использующими ДНК в качестве шаблона, по сравнению с ДНК-полимеразами, использующими РНК в качестве шаблона. Каталитическая область эукариотической обратной транскриптазы включает три домена, называемые "пальцами", "дланью" и "пальцем", которые держат двустворчатый шаблон праймера в правой руке с 3'-OH праймера, зарытым в активном месте полимеразы, кластер высококонсервативных кислотных и полярных остатков, расположенных на ладони между указательным и средним пальцами. В эукариотических РТ домен RNase H находится на запястье ниже основания большого пальца, но у ретронических РТ отсутствует активность RNase H. Сщелка связывания нуклеиновой кислоты, простирающаяся от активного полимеразного участка до активного участка RNase H, имеет длину около 60 Å в эукариотических RT, что соответствует почти двум спиральным поворотам. Когда эукариотическая РТ расширяет обычный праймер, растущая ДНК/РНК двойная спираль спираль вдоль щели, и по мере того, как двойная спираль проходит через домен RNase H, шаблонная РНК переваривается, чтобы освободить зарождающуюся нить cDNA. Однако в случае расширения праймера мДНК длинная нить РНК остается прикрепленной к 3' ОН примайринга G. Хотя возможно моделирование комплекса шаблона RT-праймера, который сделает 2' ОН доступным для реакции примайринга, дальнейшее расширение нитки ДНК представляет проблему: по мере прогрессирования синтеза ДНК громоздкая нить РНК, выходящая из 3' ОН, должна каким-то образом по спирали спускаться вниз по связующей щеле, не блокируясь стерическим препятствием. Для преодоления этой проблемы, реверсная транскриптаза мсДНК явно потребует особых особенностей, не разделяемых другими РТ.

[[File:Msdna synthesis. png|thumb|270px|Proposed mechanism for the synthesis of msDNA. (A) Folding of the primer template RNA into a secondary structure allows the 2' OH group of a specific branching G residue to serve as a primer to initiate cDNA synthesis by the retron reverse transcriptase. (B) Synthesis of cDNA is accompanied by RNase H digestion of the template strand. (C) In the completed msDNA molecule, part of the RNA template remains joined to the 5' end of the cDNA. The RT recognizes specific stem loop structures in the precursor RNA, rendering synthesis of msDNA by the RT highly specific to its own retron. The priming of msDNA synthesis offers a fascinating challenge to our understanding of DNA synthesis. DNA polymerases (which include RT) share highly conserved structural features, which means that their active catalytic sites vary little from species to species, or even between DNA polymerases using DNA as a template, versus DNA polymerases using RNA as a template. The catalytic region of eukaryotic reverse transcriptase comprises three domains termed the "fingers", "palm", and "thumb" which hold the double stranded primer template in a right hand grip with the 3' OH of the primer buried in the active site of the polymerase, a cluster of highly conserved acidic and polar residues situated on the palm between what would be the index and middle fingers. In eukaryotic RTs, the RNase H domain lies on the wrist below the base of the thumb, but retron RTs lack RNase H activity. The nucleic acid binding cleft, extending from the polymerase active site to the RNase H active site, is about 60 Å in length in eukaryotic RTs, corresponding to nearly two helical turns. When eukaryotic RT extends a conventional primer, the growing DNA/RNA double helix spirals along the cleft, and as the double helix passes the RNase H domain, the template RNA is digested to release the nascent strand of cDNA. In the case of msDNA primer extension, however, a long strand of RNA remains attached to the 3' OH of the priming G. Although it is possible to model an RT primer template complex which would make the 2' OH accessible for the priming reaction, further extension of the DNA strand presents a problem: as DNA synthesis progresses, the bulky RNA strand extending from the 3' OH needs somehow to spiral down the binding cleft without being blocked by steric hindrance. To overcome this issue, the msDNA reverse transcriptase clearly would require special features not shared by other RTs.