РНК-полимераза: синтез РНК из ДНК

Введение

Фермент, который синтезирует РНК из ДНК.

В молекулярной биологии РНК-полимераза (сокращенно РНКП или РНКполь), или более конкретно ДНК-зависимая РНК-полимераза (ДЗРП), является ферментом, который катализирует химические реакции, синтезирующие РНК из ДНК-матрицы. Используя фермент геликаза, РНКП локально раскручивает двойную спираль ДНК, так что одна цепь экспонированных нуклеотидов может быть использована в качестве матрицы для синтеза РНК, процесс, называемый транскрипцией. Фактор транскрипции и связанный с ним комплекс медиатора транскрипции должны быть присоединены к участку связывания ДНК, называемому промоторной областью, прежде чем РНКП сможет инициировать раскручивание ДНК в этом положении. РНКП не только инициирует транскрипцию РНК, но и направляет нуклеотиды в нужное положение, облегчает их присоединение и удлинение цепи, обладает встроенными возможностями корректуры и замены, а также способностью распознавать сигналы завершения транскрипции. У эукариот РНКП может создавать цепи длиной до 2,4 миллиона нуклеотидов. РНКП производит РНК, которая функционально либо кодирует белки, то есть является матричной РНК (мРНК), либо некодирующая (так называемые «РНК-гены»). Примеры четырех функциональных типов РНК-генов: Трансферная РНК (тРНК) — доставляет специфические аминокислоты к растущим полипептидным цепям на рибосомном участке синтеза белка во время трансляции; Рибосомальная РНК (рРНК) — входит в состав рибосом; Микро РНК (миРНК) — регулирует активность генов и осуществляет РНК-интерференцию; Каталитическая РНК (рибозим) — функционирует как ферментативно активная молекула РНК. РНК-полимераза необходима для жизни и встречается во всех живых организмах и многих вирусах. В зависимости от организма РНК-полимераза может быть белковым комплексом (многосубъединичная РНКП) или состоять только из одной субъединицы (односубъединичная РНКП, ssRNAP), каждая из которых представляет собой независимую линию эволюции. Первый тип встречается у бактерий, архей и эукариот, имеющих схожую основную структуру и механизм действия. Нобелевская премия по химии 2006 года была присуждена Роджеру Д. Корнбергу за создание детальных молекулярных изображений РНК-полимеразы на различных стадиях процесса транскрипции. У большинства прокариот один вид РНК-полимеразы транскрибирует все типы РНК. «Ядро» РНК-полимеразы из *E. coli* состоит из пяти субъединиц: двух альфа (α) субъединиц массой 36 кДа, бета (β) субъединицы массой 150 кДа, бета-штрих (β′) субъединицы массой 155 кДа и небольшой омега (ω) субъединицы. Фактор сигма (σ) связывается с ядром, образуя голофермент. После начала транскрипции фактор может отсоединяться и позволять основному ферменту продолжать работу. Комплекс РНК-полимеразы ядра образует структуру, напоминающую «крабьи клешни» или «челюсти зажима», с внутренним каналом, проходящим по всей длине. Полимеразы РНК эукариот и архей имеют схожую структуру ядра и работают аналогичным образом, хотя и содержат множество дополнительных субъединиц.

In molecular biology, RNA polymerase (abbreviated RNAP or RNApol), or more specifically DNA directed/dependent RNA polymerase (DdRP), is an enzyme that catalyzes the chemical reactions that synthesize RNA from a DNA template. Using the enzyme helicase, RNAP locally opens the double stranded DNA so that one strand of the exposed nucleotides can be used as a template for the synthesis of RNA, a process called transcription. A transcription factor and its associated transcription mediator complex must be attached to a DNA binding site called a promoter region before RNAP can initiate the DNA unwinding at that position. RNAP not only initiates RNA transcription, it also guides the nucleotides into position, facilitates attachment and elongation, has intrinsic proofreading and replacement capabilities, and termination recognition capability. In eukaryotes, RNAP can build chains as long as 2.4 million nucleotides. RNAP produces RNA that, functionally, is either for protein coding, i. e. messenger RNA (mRNA); or non coding (so called "RNA genes"). Examples of four functional types of RNA genes are:
Transfer RNA (tRNA) Transfers specific amino acids to growing polypeptide chains at the ribosomal site of protein synthesis during translation;
Ribosomal RNA (rRNA) Incorporates into ribosomes;
Micro RNA (miRNA) Regulates gene activity; and, RNA silencing
Catalytic RNA (ribozyme) Functions as an enzymatically active RNA molecule. RNA polymerase is essential to life, and is found in all living organisms and many viruses. Depending on the organism, a RNA polymerase can be a protein complex (multi subunit RNAP) or only consist of one subunit (single subunit RNAP, ssRNAP), each representing an independent lineage. The former is found in bacteria, archaea, and eukaryotes alike, sharing a similar core structure and mechanism. The 2006 Nobel Prize in Chemistry was awarded to Roger D. Kornberg for creating detailed molecular images of RNA polymerase during various stages of the transcription process. In most prokaryotes, a single RNA polymerase species transcribes all types of RNA. RNA polymerase "core" from E. coli consists of five subunits: two alpha (α) subunits of 36 kDa, a beta (β) subunit of 150 kDa, a beta prime subunit (β′) of 155 kDa, and a small omega (ω) subunit. A sigma (σ) factor binds to the core, forming the holoenzyme. After transcription starts, the factor can unbind and let the core enzyme proceed with its work. The core RNA polymerase complex forms a "crab claw" or "clamp jaw" structure with an internal channel running along the full length. Eukaryotic and archaeal RNA polymerases have a similar core structure and work in a similar manner, although they have many extra subunits.

Введение

Связывание РНК-полимеразы у бактерий включает в себя распознавание сигма-фактором основной промоторной области, содержащей элементы −35 и −10 (расположенные перед началом транскрибируемой последовательности), а также, в некоторых промоторах, распознавание α-субъединицей C-концевого домена элементов промотора, расположенных выше по течению. Существует несколько взаимозаменяемых сигма-факторов, каждый из которых распознает определенный набор промоторов. Например, в *E. coli* σ70 экспрессируется в нормальных условиях и распознает промоторы генов, необходимых для нормальной жизнедеятельности ("гены домашнего хозяйства"), в то время как σ32 распознает промоторы генов, необходимых при высоких температурах ("гены теплового шока"). У архей и эукариот функции бактериального общего транскрипционного фактора сигма выполняются несколькими общими транскрипционными факторами, работающими совместно. Закрытый комплекс РНК-полимеразы с промотором обычно называют "комплексом преинициации транскрипции". После связывания с ДНК РНК-полимераза переходит из закрытого комплекса в открытый комплекс. Это изменение включает в себя разделение цепей ДНК с образованием развернутого участка ДНК длиной около 13 п.н., называемого "пузырем транскрипции". Суперспирализация играет важную роль в активности полимеразы из-за разматывания и сматывания ДНК. Поскольку участки ДНК перед РНК-полимеразой разматываются, возникают компенсаторные положительные суперспирали. Участки ДНК за РНК-полимеразой сматываются, и присутствуют отрицательные суперспирали. Во время перехода от промотора к элонгации РНК-полимераза рассматривается как "напряженное промежуточное состояние". Термодинамически напряжение накапливается из-за разматывания ДНК и компактизации ДНК. Как только ДНК-РНК гетеродиплекс достигает достаточной длины (~10 п.н.), РНК-полимераза высвобождает свои контакты выше по течению и эффективно осуществляет переход от промотора к фазе элонгации. Гетеродиплекс в активном центре стабилизирует комплекс элонгации. Однако побег от промотора – не единственный возможный исход. РНК-полимераза также может снять напряжение, освободив свои контакты ниже по течению, останавливая транскрипцию. У комплекса транскрипции, находящегося в состоянии паузы, есть два варианта: (1) высвободить зарождающийся транскрипт и начать транскрипцию заново с промотора или (2) восстановить новый 3'-OH на зарождающемся транскрипте в активном центре посредством каталитической активности РНК-полимеразы и возобновить "сжимание" ДНК для достижения побега от промотора. Абортная инициация, непродуктивный цикл РНК-полимеразы перед переходом от промотора к элонгации, приводит к образованию коротких фрагментов РНК длиной около 9 п.н. в процессе, известном как абортивная транскрипция. Степень абортной инициации зависит от наличия факторов транскрипции и прочности контактов с промотором.

RNA polymerase binding in bacteria involves the sigma factor recognizing the core promoter region containing the −35 and −10 elements (located before the beginning of sequence to be transcribed) and also, at some promoters, the α subunit C terminal domain recognizing promoter upstream elements. There are multiple interchangeable sigma factors, each of which recognizes a distinct set of promoters. For example, in E. coli, σ70 is expressed under normal conditions and recognizes promoters for genes required under normal conditions ("housekeeping genes"), while σ32 recognizes promoters for genes required at high temperatures ("heat shock genes"). In archaea and eukaryotes, the functions of the bacterial general transcription factor sigma are performed by multiple general transcription factors that work together. The RNA polymerase promoter closed complex is usually referred to as the "transcription preinitiation complex." After binding to the DNA, the RNA polymerase switches from a closed complex to an open complex. This change involves the separation of the DNA strands to form an unwound section of DNA of approximately 13 bp, referred to as the "transcription bubble". Supercoiling plays an important part in polymerase activity because of the unwinding and rewinding of DNA. Because regions of DNA in front of RNAP are unwound, there are compensatory positive supercoils. Regions behind RNAP are rewound and negative supercoils are present. During the promoter escape transition, RNA polymerase is considered a "stressed intermediate." Thermodynamically the stress accumulates from the DNA unwinding and DNA compaction activities. Once the DNA RNA heteroduplex is long enough (~10 bp), RNA polymerase releases its upstream contacts and effectively achieves the promoter escape transition into the elongation phase. The heteroduplex at the active center stabilizes the elongation complex. However, promoter escape is not the only outcome. RNA polymerase can also relieve the stress by releasing its downstream contacts, arresting transcription. The paused transcribing complex has two options: (1) release the nascent transcript and begin anew at the promoter or (2) reestablish a new 3′ OH on the nascent transcript at the active site via RNA polymerase's catalytic activity and recommence DNA scrunching to achieve promoter escape. Abortive initiation, the unproductive cycling of RNA polymerase before the promoter escape transition, results in short RNA fragments of around 9 bp in a process known as abortive transcription. The extent of abortive initiation depends on the presence of transcription factors and the strength of the promoter contacts.

Верность

В отличие от механизмов корректуры ДНК-полимеразы, механизмы РНК-полимеразы были исследованы лишь недавно. Корректура начинается с отделения неправильно включенного нуклеотида от ДНК-матрицы. Это приводит к паузе в транскрипции. Затем полимераза отступает на одну позицию и расщепляет динуклеотид, содержащий неспаренный нуклеотид. У РНК-полимеразы это происходит в том же активном центре, который используется для полимеризации, что существенно отличается от ДНК-полимеразы, где корректура осуществляется в отдельном активном центре нуклеазы. Общая частота ошибок составляет примерно 10−4 – 10−6.

Прекращение

У бактерий прекращение транскрипции РНК может быть ро-зависимым или ро-независимым. Ро-зависимое прекращение опирается на фактор ро, который дестабилизирует гетеродуплекс ДНК-РНК и вызывает высвобождение РНК. Ро-независимое прекращение, также известное как внутреннее прекращение, опирается на палиндромный участок ДНК. Транскрипция этого участка приводит к образованию структуры "шпильки" из-за зацикливания и самосвязывания молекулы РНК. Эта шпилечная структура часто богата GC-парами оснований, что делает её более стабильной, чем сам гибрид ДНК-РНК. В результате, гибрид ДНК-РНК в транскрипционном комплексе, состоящий из 8 пар оснований, переходит в гибрид из 4 пар оснований. Эти последние 4 пары оснований – слабые AU-пары, и вся молекула РНК отсоединяется от ДНК. Прекращение транскрипции у эукариот изучено хуже, чем у бактерий, но включает в себя расщепление новообразованного транскрипта с последующим добавлением аденинов к его новому 3'-концу независимо от матричного принципа, в процессе, называемом полиаденилированием.

Другие организмы

Учитывая, что ДНК- и РНК-полимеразы обе осуществляют зависимую от шаблона нуклеотидную полимеризацию, можно было бы ожидать структурного родства между этими двумя типами ферментов. Однако рентгеноструктурные исследования обоих типов ферментов показывают, что, за исключением наличия критического иона Mg2+ в каталитическом центре, они практически не связаны друг с другом. Действительно, ферменты, осуществляющие зависимую от шаблона нуклеотидную полимеризацию, по-видимому, возникли независимо дважды в ходе ранней эволюции клеток. Одна линия привела к современным ДНК-полимеразам и обратным транскриптазам, а также к некоторым односубъединичным РНК-полимеразм (ssRNAP) из фагов и органелл. β′ Субъединица β′ является крупнейшей и кодируется геном rpoC. Субъединица β′ содержит часть активного центра, ответственного за синтез РНК, и содержит некоторые детерминанты неспецифических взаимодействий с ДНК и формирующейся РНК. Она разделена на две субъединицы у цианобактерий и хлоропластов. β Субъединица β является второй по величине и кодируется геном rpoB. Субъединица β содержит остальную часть активного центра, ответственного за синтез РНК, и содержит остальные детерминанты неспецифических взаимодействий с ДНК и формирующейся РНК. α (αI и αII) Две копии субъединицы α, являющейся третьей по величине субъединицей, присутствуют в молекуле РНК-полимеразы: αI и αII (одна и две). Каждая субъединица α содержит два домена: αNTD (N-концевой домен) и αCTD (C-концевой домен). αNTD содержит детерминанты для сборки РНК-полимеразы. αCTD (C-концевой домен) содержит детерминанты для взаимодействия с ДНК-промотором, обеспечивая неспецифические взаимодействия в большинстве промоторов и специфические взаимодействия в промоторах, содержащих восходящие элементы, а также содержит детерминанты для взаимодействия с регуляторными факторами. ω Субъединица ω является самой маленькой субъединицей. Субъединица ω облегчает сборку РНК-полимеразы и стабилизирует собранную РНК-полимеразу. Для связывания с промоторами, основной комплекс РНК-полимеразы ассоциируется с фактором инициации транскрипции сигма (σ) с образованием голофермента РНК-полимеразы. Сигма снижает аффинность РНК-полимеразы к неспецифической ДНК, одновременно повышая специфичность к промоторам, что позволяет транскрипции начинаться в правильных местах. Таким образом, полный голофермент состоит из 6 субъединиц: β′βαI и αIIωσ (~450 кДа).

Given that DNA and RNA polymerases both carry out template dependent nucleotide polymerization, it might be expected that the two types of enzymes would be structurally related. However, x ray crystallographic studies of both types of enzymes reveal that, other than containing a critical Mg2+ ion at the catalytic site, they are virtually unrelated to each other; indeed template dependent nucleotide polymerizing enzymes seem to have arisen independently twice during the early evolution of cells. One lineage led to the modern DNA polymerases and reverse transcriptases, as well as to a few single subunit RNA polymerases (ssRNAP) from phages and organelles. β′ The β′ subunit is the largest subunit, and is encoded by the rpoC gene. The β′ subunit contains part of the active center responsible for RNA synthesis and contains some of the determinants for non sequence specific interactions with DNA and nascent RNA. It is split into two subunits in Cyanobacteria and chloroplasts. β The β subunit is the second largest subunit, and is encoded by the rpoB gene. The β subunit contains the rest of the active center responsible for RNA synthesis and contains the rest of the determinants for non sequence specific interactions with DNA and nascent RNA. α (αI and αII) Two copies of the α subunit, being the third largest subunit, are present in a molecule of RNAP: αI and αII (one and two). Each α subunit contains two domains: αNTD (N terminal domain) and αCTD (C terminal domain). αNTD contains determinants for assembly of RNAP. αCTD (C terminal domain) contains determinants for interaction with promoter DNA, making non sequence non specific interactions at most promoters and sequence specific interactions at upstream element containing promoters, and contains determinants for interactions with regulatory factors. ω The ω subunit is the smallest subunit. The ω subunit facilitates assembly of RNAP and stabilizes assembled RNAP. In order to bind promoters, RNAP core associates with the transcription initiation factor sigma (σ) to form RNA polymerase holoenzyme. Sigma reduces the affinity of RNAP for nonspecific DNA while increasing specificity for promoters, allowing transcription to initiate at correct sites. The complete holoenzyme therefore has 6 subunits: β′βαI and αIIωσ (~450 kDa).

Эукариоты

У эукариот есть несколько типов ядерной РНК-полимеразы, каждый из которых отвечает за синтез отдельного подмножества РНК. Все они структурно и механически связаны друг с другом и с бактериальной РНК-полимеразой: эукариотические хлоропласты содержат РНК-полимеразу, очень похожую на бактериальную РНК-полимеразу ("пластидная кодируемая полимераза, PEP"). Они используют сигма-факторы, закодированные в ядерном геноме. Хлоропласты также содержат вторую, структурно и механически не связанную, односубъединичную РНК-полимеразу ("нуклеазно-кодируемая полимераза, NEP"). Митохондрии эукариот используют POLRMT (человеческую), односубъединичную РНК-полимеразу, закодированную в ядре. Такие фагоподобные полимеразы называются RpoT у растений. История открытия археальной РНК-полимеразы относительно недавняя. Первый анализ РНК-полимеразы археи был проведен в 1971 году, когда РНК-полимераза из крайне галофильной *Halobacterium cutirubrum* была изолирована и очищена. Кристаллические структуры РНК-полимераз из *Sulfolobus solfataricus* и *Sulfolobus shibatae* установили общее количество идентифицированных археальных субъединиц в тринадцать. У архей субъединица, соответствующая эукариотической Rpb1, разделена на две. В комплексе *S. shibatae* отсутствует гомолог эукариотической Rpb9 (POLR2I), хотя TFS (гомолог TFIIS) был предложен в качестве такового на основе сходства. Существует дополнительная субъединица, получившая название Rpo13; вместе с Rpo5 она занимает пространство, заполненное вставкой, обнаруженной в бактериальных β′-субъединицах (1377–1420 в Taq). В любом случае, этот домен выполняет структурную функцию. Ранее субъединицы археальной РНК-полимеразы использовали номенклатуру "RpoX", где каждой субъединице присваивалась буква, не связанная с другими системами. Вопрос о том, на какую РНК-полимеразу они наиболее похожи, остается предметом дискуссий. Большинство других вирусов, синтезирующих РНК, используют не связанные механизмы. Многие вирусы используют односубъединичную ДНК-зависимую РНК-полимеразу (ssRNAP), которая структурно и механически связана с односубъединичными РНК-полимеразами эукариотических хлоропластов (RpoT) и митохондрий (POLRMT) и, более отдаленно, с ДНК-полимеразами и обратными транскриптазами. Вероятно, наиболее широко изученной такой односубъединичной РНК-полимеразой является РНК-полимераза бактериофага T7. ssRNAP не способны к корректуре. Другие вирусы используют РНК-зависимую РНК-полимеразу (РНК-полимеразу, использующую РНК в качестве матрицы вместо ДНК). Это происходит в вирусах с отрицательной нитью РНК и вирусах dsRNA, которые в течение части своего жизненного цикла существуют в виде двухцепочечной РНК. Однако некоторые вирусы с положительной нитью РНК, такие как полиовирус, также содержат РНК-зависимую РНК-полимеразу.

Eukaryotes have multiple types of nuclear RNAP, each responsible for synthesis of a distinct subset of RNA. All are structurally and mechanistically related to each other and to bacterial RNAP:

Eukaryotic chloroplasts contain an RNAP very highly similar to bacterial RNAP ("plastid encoded polymerase, PEP"). They use sigma factors encoded in the nuclear genome. Chloroplast also contain a second, structurally and mechanistically unrelated, single subunit RNAP ("nucleus encoded polymerase, NEP"). Eukaryotic mitochondria use POLRMT (human), a nucleus encoded single subunit RNAP. Such phage like polymerases are referred to as RpoT in plants. The history of the discovery of the archaeal RNA polymerase is quite recent. The first analysis of the RNAP of an archaeon was performed in 1971, when the RNAP from the extreme halophile Halobacterium cutirubrum was isolated and purified. Crystal structures of RNAPs from Sulfolobus solfataricus and Sulfolobus shibatae set the total number of identified archaeal subunits at thirteen. Archaea has the subunit corresponding to Eukaryotic Rpb1 split into two. There is no homolog to eukaryotic Rpb9 (POLR2I) in the S. shibatae complex, although TFS (TFIIS homolog) has been proposed as one based on similarity. There is an additional subunit dubbed Rpo13; together with Rpo5 it occupies a space filled by an insertion found in bacterial β′ subunits (1,377–1,420 in Taq). This domain, in either case, serves a structural function. Archaeal RNAP subunit previously used an "RpoX" nomenclature where each subunit is assigned a letter in a way unrelated to any other systems. Exactly which RNAP they are most similar to is a topic of debate. Most other viruses that synthesize RNA use unrelated mechanics. Many viruses use a single subunit DNA dependent RNAP (ssRNAP) that is structurally and mechanistically related to the single subunit RNAP of eukaryotic chloroplasts (RpoT) and mitochondria (POLRMT) and, more distantly, to DNA polymerases and reverse transcriptases. Perhaps the most widely studied such single subunit RNAP is bacteriophage T7 RNA polymerase. ssRNAPs cannot proofread. Other viruses use an RNA dependent RNAP (an RNAP that employs RNA as a template instead of DNA). This occurs in negative strand RNA viruses and dsRNA viruses, both of which exist for a portion of their life cycle as double stranded RNA. However, some positive strand RNA viruses, such as poliovirus, also contain RNA dependent RNAP.

История

РНК-полимераза была открыта независимо друг от друга Чарльзом Лоу, Одри Стивенс и Джераром Хурвицем в 1960 году. К этому времени половина Нобелевской премии по физиологии и медицине 1959 года была присуждена Северо Очоа за открытие того, что считалось РНК-полимеразой, но впоследствии оказалось полинуклеотидной фосфорилазой.