Вирусология: история, методы и значение изучения вирусов.

Вирусология: изучение вирусов – структура, классификация, эволюция, механизмы заражения и лечения. История развития науки о вирусах с 1898 года.

16 мин чтения

100%

Источник: Virology — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Изучение вирусов

Study of viruses

the journals

Virology is the scientific study of biological viruses. It is a subfield of microbiology that focuses on their detection, structure, classification and evolution, their methods of infection and exploitation of host cells for reproduction, their interaction with host organism physiology and immunity, the diseases they cause, the techniques to isolate and culture them, and their use in research and therapy. The identification of the causative agent of tobacco mosaic disease (TMV) as a novel pathogen by Martinus Beijerinck (1898) is now acknowledged as being the official beginning of the field of virology as a discipline distinct from bacteriology. He realized the source was neither a bacterial nor a fungal infection, but something completely different. Beijerinck used the word "virus" to describe the mysterious agent in his 'contagium vivum fluidum' ('contagious living fluid'). Rosalind Franklin proposed the full structure of the tobacco mosaic virus in 1955. One main motivation for the study of viruses is because they cause many infectious diseases of plants and animals. The study of the manner in which viruses cause disease is viral pathogenesis. The degree to which a virus causes disease is its virulence. These fields of study are called plant virology, animal virology and human or medical virology. Virology began when there were no methods for propagating or visualizing viruses or specific laboratory tests for viral infections. The methods for separating viral nucleic acids (RNA and DNA) and proteins, which are now the mainstay of virology, did not exist. Now there are many methods for observing the structure and functions of viruses and their component parts. Thousands of different viruses are now known about and virologists often specialize in either the viruses that infect plants, or bacteria and other microorganisms, or animals. Viruses that infect humans are now studied by medical virologists. Virology is a broad subject covering biology, health, animal welfare, agriculture and ecology.

Вирусология – это научное исследование биологических вирусов. Это раздел микробиологии, который фокусируется на их обнаружении, структуре, классификации и эволюции, способах заражения и использовании клеток хозяина для размножения, их взаимодействии с физиологией и иммунитетом организма хозяина, вызываемых ими заболеваниях, методах их изоляции и культивирования, а также их применении в исследованиях и терапии. Идентификация возбудителя болезни табачной мозаики (TMV) как нового патогена Мартинусом Бейеринком (1898) теперь признается официальным началом вирусологии как самостоятельной дисциплины, отличной от бактериологии. Он понял, что причиной является не бактериальная и не грибковая инфекция, а нечто совершенно иное. Бейеринк использовал слово «вирус» для описания таинственного агента в своем «contagium vivum fluidum» («заразная живая жидкость»). Розалинд Франклин предложила полную структуру вируса табачной мозаики в 1955 году. Одной из основных причин изучения вирусов является то, что они вызывают множество инфекционных заболеваний растений и животных. Изучение механизмов, посредством которых вирусы вызывают заболевания, называется вирусным патогенезом. Степень, в которой вирус вызывает заболевание, определяется его вирулентностью. Эти области исследования называются вирусологией растений, вирусологией животных и медицинской (или человеческой) вирусологией. Вирусология начала развиваться в период, когда отсутствовали методы культивирования или визуализации вирусов, а также специфические лабораторные тесты для выявления вирусных инфекций. Методы разделения вирусных нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) и белков, которые сейчас являются основой вирусологии, тогда еще не существовали. В настоящее время существует множество методов для изучения структуры и функций вирусов и их компонентов. Известно о тысячах различных вирусов, и вирусологи часто специализируются на вирусах, заражающих растения, бактерии и другие микроорганизмы, или животных. Вирусы, заражающие людей, изучаются медицинскими вирусологами. Вирусология – это широкая область, охватывающая биологию, здравоохранение, благополучие животных, сельское хозяйство и экологию.

История

Луи Пастер не смог обнаружить возбудителя бешенства и предположил о существовании патогена, слишком малого для выявления под микроскопом. В 1884 году французский микробиолог Шарль Шамберлан изобрел фильтр Шамберлана (или фильтр Пастера-Шамберлана) с порами, достаточно малыми для удаления всех бактерий из раствора, пропущенного через него. В 1892 году русский биолог Дмитрий Ивановский использовал этот фильтр для изучения того, что сейчас известно как вирус табачной мозаики: измельченные экстракты листьев зараженных табачных растений оставались инфекционными даже после фильтрации для удаления бактерий. Ивановский предположил, что инфекция может быть вызвана токсином, производимым бактериями, но не стал развивать эту идею. В то время считалось, что все инфекционные агенты могут быть удержаны фильтрами и выращены на питательной среде – это было частью теории зародышей болезней. В 1898 году голландский микробиолог Мартинус Бейеринк повторил эксперименты и убедился, что отфильтрованный раствор содержит новый вид инфекционного агента. Он заметил, что агент размножается только в делящихся клетках, но поскольку его эксперименты не показали, что он состоит из частиц, он назвал его *contagium vivum fluidum* (живой растворимый зародыш) и вновь ввел термин «вирус». Бейеринк утверждал, что вирусы по своей природе жидкие, теорию, впоследствии опровергнутую Венделлом Стэнли, доказавшим, что они являются частицами. В начале XX века английский бактериолог Фредерик Творт обнаружил группу вирусов, инфицирующих бактерии, ныне известных как бактериофаги (или обычно «фаги»), а французский канадский микробиолог Феликс д’Эрель описал вирусы, которые при добавлении к бактериям на агарной пластинке создавали области гибели бактерий. Он точно разбавлял суспензию этих вирусов и обнаружил, что самые высокие разведения (наименьшие концентрации вирусов) вместо того, чтобы убивать все бактерии, формировали отдельные области мертвых организмов. Подсчет этих областей и умножение на коэффициент разведения позволяли ему рассчитать количество вирусов в исходной суспензии. Фаги были провозглашены потенциальным средством лечения таких заболеваний, как тиф и холера, но их перспективы были забыты с разработкой пенициллина. Развитие устойчивости бактерий к антибиотикам вновь пробудило интерес к терапевтическому использованию бактериофагов. К концу XIX века вирусы определялись с точки зрения их инфекционности, способности проходить через фильтры и необходимости в живых хозяевах. Вирусы выращивались только на растениях и животных. В 1906 году Росс Гранвилл Харрисон изобрел метод выращивания тканей в лимфе, а в 1913 году Э. Стейнхардт, К. Израиль и Р. А. Ламберт использовали этот метод для выращивания вируса вакцины во фрагментах роговицы морской свиньи. Их метод не получил широкого распространения до 1950-х годов, когда полиовирус был выращен в больших масштабах для производства вакцины. Еще одним прорывом стало открытие в 1931 году, когда американский патолог Эрнест Уильям Гудпастур и Элис Майлз Вудрафф вырастили вирус гриппа и несколько других вирусов в оплодотворенных куриных яйцах. В 1949 году Джон Франклин Эндерс, Томас Веллер и Фредерик Роббинс вырастили полиовирус в культивируемых клетках из абортированной эмбриональной ткани человека – это был первый вирус, выращенный без использования животных тканей или яиц. Эта работа позволила Хилари Копровски, а затем Джонасу Солку создать эффективную вакцину против полиомиелита. Первые изображения вирусов были получены после изобретения электронной микроскопии в 1931 году немецкими инженерами Эрнстом Руской и Максом Кноллем. В 1935 году американский биохимик и вирусолог Уэнделл Мередит Стэнли исследовал вирус табачной мозаики и обнаружил, что он в основном состоит из белка. Вскоре после этого вирус был разделен на белковые и РНК-части. Вирус табачной мозаики стал первым вирусом, который был кристаллизован, и его структура могла быть, таким образом, детально изучена. Первые рентгенодифракционные снимки кристаллизованного вируса были получены Берналом и Фанкухеном в 1941 году. На основе рентгенокристаллографических снимков Розалинд Франклин обнаружила полную структуру вируса в 1955 году. В том же году Хайнц Френкель-Конрат и Робли Уильямс показали, что очищенная РНК вируса табачной мозаики и его белковая оболочка могут самопроизвольно собираться, образуя функциональные вирусы, что указывает на то, что этот простой механизм, вероятно, является способом создания вирусов внутри их клеток-хозяев. Вторая половина XX века стала золотым веком открытия вирусов, и большинство известных видов вирусных инфекций животных, растений и бактерий были обнаружены в эти годы. В 1957 году были открыты вирус артериита лошадей и возбудитель диареи крупного рогатого скота (пестивирус). В 1963 году Барух Блумберг открыл вирус гепатита B, а в 1965 году Говард Теммин описал первый ретровирус. Обратная транскриптаза, фермент, который ретровирусы используют для создания ДНК-копий своей РНК, была впервые описана в 1970 году Теммином и Дэвидом Балтимором независимо друг от друга. В 1983 году группа Люка Монтанье из Института Пастера во Франции впервые выделила ретровирус, ныне известный как ВИЧ. В 1989 году группа Майкла Хоутона из Chiron Corporation открыла вирус гепатита C.

Louis Pasteur was unable to find a causative agent for rabies and speculated about a pathogen too small to be detected by microscopes. In 1884, the French microbiologist Charles Chamberland invented the Chamberland filter (or Pasteur Chamberland filter) with pores small enough to remove all bacteria from a solution passed through it. In 1892, the Russian biologist Dmitri Ivanovsky used this filter to study what is now known as the tobacco mosaic virus: crushed leaf extracts from infected tobacco plants remained infectious even after filtration to remove bacteria. Ivanovsky suggested the infection might be caused by a toxin produced by bacteria, but he did not pursue the idea. At the time it was thought that all infectious agents could be retained by filters and grown on a nutrient medium—this was part of the germ theory of disease. In 1898, the Dutch microbiologist Martinus Beijerinck repeated the experiments and became convinced that the filtered solution contained a new form of infectious agent. He observed that the agent multiplied only in cells that were dividing, but as his experiments did not show that it was made of particles, he called it a contagium vivum fluidum (soluble living germ) and reintroduced the word virus. Beijerinck maintained that viruses were liquid in nature, a theory later discredited by Wendell Stanley, who proved they were particulate. In the early 20th century, the English bacteriologist Frederick Twort discovered a group of viruses that infect bacteria, now called bacteriophages (or commonly 'phages'), and the French Canadian microbiologist Félix d'Herelle described viruses that, when added to bacteria on an agar plate, would produce areas of dead bacteria. He accurately diluted a suspension of these viruses and discovered that the highest dilutions (lowest virus concentrations), rather than killing all the bacteria, formed discrete areas of dead organisms. Counting these areas and multiplying by the dilution factor allowed him to calculate the number of viruses in the original suspension. Phages were heralded as a potential treatment for diseases such as typhoid and cholera, but their promise was forgotten with the development of penicillin. The development of bacterial resistance to antibiotics has renewed interest in the therapeutic use of bacteriophages. By the end of the 19th century, viruses were defined in terms of their infectivity, their ability to pass filters, and their requirement for living hosts. Viruses had been grown only in plants and animals. In 1906 Ross Granville Harrison invented a method for growing tissue in lymph, and in 1913 E. Steinhardt, C. Israeli, and R. A. Lambert used this method to grow vaccinia virus in fragments of guinea pig corneal tissue. In 1928, H. B. Maitland and M. C. Maitland grew vaccinia virus in suspensions of minced hens' kidneys. Their method was not widely adopted until the 1950s when poliovirus was grown on a large scale for vaccine production. Another breakthrough came in 1931 when the American pathologist Ernest William Goodpasture and Alice Miles Woodruff grew influenza and several other viruses in fertilised chicken eggs. In 1949, John Franklin Enders, Thomas Weller, and Frederick Robbins grew poliovirus in cultured cells from aborted human embryonic tissue, the first virus to be grown without using solid animal tissue or eggs. This work enabled Hilary Koprowski, and then Jonas Salk, to make an effective polio vaccine. The first images of viruses were obtained upon the invention of electron microscopy in 1931 by the German engineers Ernst Ruska and Max Knoll. In 1935, American biochemist and virologist Wendell Meredith Stanley examined the tobacco mosaic virus and found it was mostly made of protein. A short time later, this virus was separated into protein and RNA parts. The tobacco mosaic virus was the first to be crystallised and its structure could, therefore, be elucidated in detail. The first X ray diffraction pictures of the crystallised virus were obtained by Bernal and Fankuchen in 1941. Based on her X ray crystallographic pictures, Rosalind Franklin discovered the full structure of the virus in 1955. In the same year, Heinz Fraenkel Conrat and Robley Williams showed that purified tobacco mosaic virus RNA and its protein coat can assemble by themselves to form functional viruses, suggesting that this simple mechanism was probably the means through which viruses were created within their host cells. The second half of the 20th century was the golden age of virus discovery, and most of the documented species of animal, plant, and bacterial viruses were discovered during these years. In 1957 equine arterivirus and the cause of bovine virus diarrhoea (a pestivirus) were discovered. In 1963 the hepatitis B virus was discovered by Baruch Blumberg, and in 1965 Howard Temin described the first retrovirus. Reverse transcriptase, the enzyme that retroviruses use to make DNA copies of their RNA, was first described in 1970 by Temin and David Baltimore independently. In 1983 Luc Montagnier's team at the Pasteur Institute in France, first isolated the retrovirus now called HIV. In 1989 Michael Houghton's team at Chiron Corporation discovered hepatitis C.

Обнаружение вирусов

Существует несколько подходов к обнаружению вирусов, в том числе обнаружение вирусных частиц (вирионов), их антигенов или нуклеиновых кислот, а также определение инфекционной активности.

Электронная микроскопия

Вирусы были впервые обнаружены в 1930-х годах с изобретением электронных микроскопов. Эти микроскопы используют пучки электронов вместо света, которые имеют гораздо более короткую длину волны и позволяют визуализировать объекты, невидимые в световых микроскопах. Максимальное увеличение, достигаемое электронными микроскопами, составляет до 10 000 000 раз, в то время как для световых микроскопов оно составляет около 1500 раз. Вирусологи часто применяют метод негативного контрастирования для визуализации вирусов. В этом методе вирусы суспендируют в растворе солей металлов, таких как ацетат урана. Атомы металла непрозрачны для электронов, поэтому вирусы видны как объекты, окруженные темным фоном из атомов металла. Многие вирусы были открыты с использованием этой техники, и негативное контрастирование в электронной микроскопии по-прежнему является ценным инструментом в арсенале вирусолога. Традиционная электронная микроскопия имеет недостатки, поскольку вирусы повреждаются при высушивании в высоком вакууме внутри микроскопа, а сам электронный луч оказывает разрушительное воздействие. Это позволяет определять структуры биомолекул с почти атомным разрешением и привлекло значительное внимание к этому методу как к альтернативе рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии для определения структуры вирусов.

Рост в культурах

Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, и поскольку они размножаются только внутри живых клеток хозяина, для их культивирования в лаборатории необходимы эти клетки. Для вирусов, инфицирующих животных (обычно называемых "вирусами животных"), используются клетки, выращенные в лабораторных клеточных культурах. Ранее использовались оплодотворенные куриные яйца, и вирусы выращивались на мембранах, окружающих эмбрион. Этот метод до сих пор применяется в производстве некоторых вакцин. Для вирусов, инфицирующих бактерии – бактериофагов – можно непосредственно использовать бактерии, растущие в пробирках. Для вирусов растений можно использовать естественные растения-хозяева или, особенно когда инфекция не очевидна, так называемые индикаторные растения, которые более явно проявляют признаки инфекции. Вирусы, выращенные в клеточных культурах, можно косвенно обнаружить по их вредному воздействию на клетку-хозяина. Эти цитопатические эффекты часто характерны для конкретного типа вируса. Например, вирусы простого герпеса вызывают характерное "раздувание" клеток, обычно человеческих фибробластов. Некоторые вирусы, такие как вирус паротита, заставляют эритроциты курицы прочно прикрепляться к инфицированным клеткам. Это называется гемадсорбцией или гемагглютинацией. Некоторые вирусы формируют локализованные "дефекты" в клеточных слоях, называемые бляшками, которые полезны в количественных анализах и для идентификации вида вируса с помощью анализа снижения бляшек. Вирусы, культивируемые в клеточных культурах, используются для определения их чувствительности к валидированным и новым противовирусным препаратам.

Серология

Вирусы – это антигены, которые индуцируют выработку антител, и эти антитела могут использоваться в лабораториях для изучения вирусов. Родственные вирусы часто перекрестно реагируют с антителами друг друга, и некоторые вирусы могут быть названы по антителам, с которыми они реагируют. Использование антител, которые ранее получали исключительно из сыворотки (жидкой части крови) животных, называется серологией. После проведения антитело-реакции в тесте, для ее подтверждения требуются дополнительные методы. К более старым методам относились тесты на фиксацию комплемента, ингибирование гемагглютинации и нейтрализацию вирусов. Современные методы используют ферментные иммуноанализы (EIA). До изобретения ПЦР иммунофлуоресценция использовалась для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это тест на инфекционность, специфичный для вида вируса, поскольку в нем используются антитела. Антитела маркируются люминесцентным красителем, и при использовании оптического микроскопа с модифицированным источником света инфицированные клетки светятся в темноте.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы обнаружения нуклеиновых кислот

ПЦР является основным методом обнаружения вирусов у всех видов, включая растения и животных. Метод основан на выявлении даже незначительных следов вирус-специфичной РНК или ДНК. Он отличается высокой чувствительностью и специфичностью, но подвержен риску контаминации. Большинство тестов, используемых в ветеринарной и медицинской вирусологии, основаны на ПЦР или подобных методах, таких как амплификация, опосредованная транскрипцией. При появлении нового вируса, например, коронавируса, вызывающего COVID-19, специфический тест может быть разработан оперативно, при условии секвенирования вирусного генома и идентификации уникальных участков вирусной ДНК или РНК. Изобретение микрофлюидных систем позволило автоматизировать большинство этих тестов. Несмотря на высокую специфичность и чувствительность, ПЦР имеет недостаток: она не различает инфекционные и неинфекционные вирусы, поэтому "тесты на выздоровление" приходится откладывать до 21 дня, чтобы остаточная вирусная нуклеиновая кислота успела исчезнуть из очага инфекции.

Диагностические тесты

В лабораториях многие диагностические тесты для выявления вирусов основаны на методах амплификации нуклеиновых кислот, таких как ПЦР. Некоторые тесты обнаруживают сами вирусы или их компоненты, например, с помощью электронной микроскопии и иммуноферментного анализа. Так называемые "домашние" или "самотесты" обычно представляют собой тест-системы на основе латерального потока, которые обнаруживают вирус, используя меченное моноклональное антитело. Они также применяются в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и науках об окружающей среде.

Количественная и вирусная нагрузки

Подсчет вирусов (количественное определение) всегда играл важную роль в вирусологии и стал центральным в контроле некоторых инфекций человека, где измеряется вирусная нагрузка. Существует два основных метода: методы, подсчитывающие полностью инфекционные вирусные частицы, называемые анализами инфекционности, и методы, подсчитывающие все частицы, включая дефектные. В качестве клеток-хозяев используются растительные, бактериальные или культуры животных клеток. Лабораторные животные, такие как мыши, также используются, особенно в ветеринарной вирусологии. Эти анализы могут быть количественными, когда результаты представлены в непрерывном масштабе, или квантовыми, когда событие либо происходит, либо не происходит. Количественные анализы дают абсолютные значения, а квантовые – статистическую вероятность, например, объем образца, необходимый для заражения 50% клеток-хозяев, растений или животных. Это называется медианной инфекционной дозой или ID50. Инфекционные бактериофаги можно подсчитать, засевая их на «газоны» бактерий в чашках Петри. При низких концентрациях вирусы образуют отверстия в газоне, которые можно подсчитать. Количество вирусов затем выражается в единицах формирования бляшек. Для бактериофагов, размножающихся в бактериях, которые нельзя выращивать в культурах, используются анализы вирусной нагрузки. Анализ формирования фокусов (FFA) является модификацией анализа на бляшки, но вместо того, чтобы полагаться на лизис клеток для обнаружения образования бляшек, FFA использует методы иммуноокрашивания с использованием флуоресцентно меченных антител, специфичных к вирусным антигенам, для обнаружения инфицированных клеток-хозяев и инфекционных вирусных частиц до фактического формирования бляшки. FFA особенно полезен для количественного определения классов вирусов, которые не лизируют клеточные мембраны, поскольку эти вирусы не подходят для анализа на бляшки. Как и в анализе на бляшки, монослои клеток-хозяев заражаются различными разведениями вирусного образца и инкубируются в течение относительно короткого периода (например, 24–72 часа) в полутвердой среде, которая ограничивает распространение инфекционного вируса, создавая локализованные скопления (фокусы) инфицированных клеток. Затем пластинки исследуются флуоресцентно меченными антителами к вирусным антигенам, а флуоресцентная микроскопия используется для подсчета и количественного определения количества фокусов. Метод FFA обычно дает результаты быстрее, чем анализ на бляшки или анализ на 50% инфекционную дозу в культуре тканей (TCID50), но может быть дороже с точки зрения необходимых реагентов и оборудования. Время завершения анализа также зависит от площади, которую подсчитывает пользователь. Большая площадь потребует больше времени, но может обеспечить более точное представление об образце. Результаты FFA выражаются в единицах формирования фокусов на миллилитр, или FFU/мл.

Counting viruses (quantitation) has always had an important role in virology and has become central to the control of some infections of humans where the viral load is measured. There are two basic methods: those that count the fully infective virus particles, which are called infectivity assays, and those that count all the particles including the defective ones. For host cells, plants or cultures of bacterial or animal cells are used. Laboratory animals such as mice have also been used particularly in veterinary virology. These are assays are either quantitative where the results are on a continuous scale or quantal, where an event either occurs or it does not. Quantitative assays give absolute values and quantal assays give a statistical probability such as the volume of the test sample needed to ensure 50% of the hosts cells, plants or animals are infected. This is called the median infectious dose or ID 50. Infective bacteriophages can be counted by seeding them onto "lawns" of bacteria in culture dishes. When at low concentrations, the viruses form holes in the lawn that can be counted. The number of viruses is then expressed as plaque forming units. For the bacteriophages that reproduce in bacteria that cannot be grown in cultures, viral load assays are used. The focus forming assay (FFA) is a variation of the plaque assay, but instead of relying on cell lysis in order to detect plaque formation, the FFA employs immunostaining techniques using fluorescently labeled antibodies specific for a viral antigen to detect infected host cells and infectious virus particles before an actual plaque is formed. The FFA is particularly useful for quantifying classes of viruses that do not lyse the cell membranes, as these viruses would not be amenable to the plaque assay. Like the plaque assay, host cell monolayers are infected with various dilutions of the virus sample and allowed to incubate for a relatively brief incubation period (e. g., 24–72 hours) under a semisolid overlay medium that restricts the spread of infectious virus, creating localized clusters (foci) of infected cells. Plates are subsequently probed with fluorescently labeled antibodies against a viral antigen, and fluorescence microscopy is used to count and quantify the number of foci. The FFA method typically yields results in less time than plaque or fifty percent tissue culture infective dose (TCID50) assays, but it can be more expensive in terms of required reagents and equipment. Assay completion time is also dependent on the size of area that the user is counting. A larger area will require more time but can provide a more accurate representation of the sample. Results of the FFA are expressed as focus forming units per milliliter, or FFU/

Анализы вирусной нагрузки

При проведении анализа для измерения инфекционных вирусных частиц (плаковый анализ, анализ фокусов) вирусный титр обычно обозначает концентрацию инфекционных вирусных частиц, что отличается от общей концентрации вирусных частиц. Анализы вирусной нагрузки обычно определяют количество присутствующих вирусных геномов, а не количество частиц, и используют методы, подобные ПЦР. Определение вирусной нагрузки играет важную роль в контроле инфекций, вызванных ВИЧ. Этот универсальный метод также может применяться к вирусам растений.

Молекулярная биология

Молекулярная вирусология – это изучение вирусов на уровне нуклеиновых кислот и белков. Методы, разработанные молекулярными биологами, оказались полезными в вирусологии. Небольшие размеры и относительно простая структура делают вирусы идеальным объектом для изучения с использованием этих методов.

Вирусы очищающие и их компоненты

Раствор хлорида цезия (CsCl) и два морфологических типа ротавируса. После центрифугирования при 100 g в растворе CsCl формируется градиент плотности, и частицы вируса разделяются в соответствии со своей плотностью. Высота трубки составляет 10 см. Вирусы представлены двумя близко расположенными "молочными" зонами. После дифференциальной центрифуги вирусные суспензии часто остаются загрязненными остатками с тем же коэффициентом седиментации, которые не удаляются в ходе процедуры. В таких случаях используется модификация центрифугирования, называемая центрифугированием по плотности. В этом методе вирусы, выделенные при дифференциальной центрифуге, повторно центрифугируют с очень высокой скоростью в течение нескольких часов в концентрированных растворах сахаров или солей, которые образуют градиент плотности от низкой к высокой в трубке во время центрифугирования. В некоторых случаях используются предварительно сформированные градиенты, где растворы с последовательно уменьшающейся плотностью аккуратно наносятся друг на друга. Подобно объекту в Мертвом море, несмотря на центробежную силу, частицы вируса не могут опуститься в растворы, плотность которых выше их собственной, и формируют отдельные, часто видимые, слои концентрированного вируса в трубке. Хлорид цезия часто используется для этих растворов, поскольку он относительно инертен, но легко самопроизвольно образует градиент при центрифугировании на высокой скорости в ультрацентрифуге. Центрифугирование по плотности также может быть использовано для очистки компонентов вирусов, таких как их нуклеиновые кислоты или белки.

Секвенирование вирусных геномов

Поскольку большинство вирусов слишком малы, чтобы их можно было увидеть в световой микроскоп, секвенирование является одним из основных инструментов в вирусологии для идентификации и изучения вирусов. Традиционное секвенирование по Сэнгеру и секвенирование нового поколения (NGS) используются для секвенирования вирусов в фундаментальных и клинических исследованиях, а также для диагностики новых вирусных инфекций, молекулярной эпидемиологии вирусных патогенов и определения лекарственной устойчивости. В GenBank содержится более 2,3 миллиона уникальных вирусных последовательностей. Секвенирование вирусного генома стало центральным методом в вирусной эпидемиологии и классификации вирусов.

Филогенетический анализ

Данные, полученные в результате секвенирования вирусных геномов, могут быть использованы для определения эволюционных взаимосвязей, что называется филогенетическим анализом. Для построения филогенетических деревьев используется программное обеспечение, например, PHYLIP. Этот анализ также применяется при изучении распространения вирусных инфекций в популяциях (эпидемиология).

Клонирование

Когда для диагностических тестов или вакцин требуются очищенные вирусы или вирусные компоненты, клонирование можно использовать вместо культивирования вирусов. В начале пандемии COVID-19 доступность последовательности РНК коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 позволила оперативно наладить производство тестов. Существует несколько проверенных методов клонирования вирусов и их компонентов. Часто используются небольшие фрагменты ДНК, называемые векторами клонирования, и наиболее распространенными из них являются лабораторно модифицированные плазмиды (небольшие кольцевые молекулы ДНК, производимые бактериями). Вирусная нуклеиновая кислота или ее часть встраивается в плазмиду, которая затем многократно копируется бактериями. Полученную рекомбинантную ДНК можно использовать для производства вирусных компонентов без необходимости использования исходных вирусов.

Фаговирусология

Вирусы, размножающиеся в бактериях, археях и грибах, неформально называют "фагами", а вирусы, заражающие бактерии – бактериофаги – особенно полезны в вирусологии и биологии в целом. Бактериофаги были одними из первых открытых вирусов в начале двадцатого века, и благодаря относительной простоте и быстроте их культивирования в лабораториях, значительная часть наших знаний о вирусах сформировалась именно при их изучении.

Генетика

Все вирусы имеют гены, которые изучаются с помощью генетики. Все методы, используемые в молекулярной биологии, такие как клонирование, создание мутаций и РНК-интерференция, применяются в вирусной генетике.

Пересортировка

Пересортировка – это обмен генетическим материалом между разными родителями, и она особенно полезна при изучении генетики вирусов с сегментированными геномами (разделенными на два или более фрагмента нуклеиновых кислот), таких как вирусы гриппа и ротавирусы. С помощью этого метода можно идентифицировать гены, кодирующие такие характеристики, как серотип.

Рекомбинация

Рекомбинация, которую часто путают с реассортиментом, также представляет собой смешение генов, но механизм ее отличается тем, что в процессе репликации РНК или ДНК соединяются фрагменты молекул ДНК или РНК, а не целые молекулы. Рекомбинация встречается в природе реже, чем реассортимент, но является мощным инструментом в лабораториях для изучения структуры и функций вирусных генов.

Обратная генетика

Обратная генетика — мощный метод исследования в вирусологии. В этой процедуре копии комплементарной ДНК (cDNA) геномов вирусов, называемые «инфекционными клонами», используются для создания генетически модифицированных вирусов, которые затем можно тестировать на изменения, например, в вирулентности или заразности.

Классификация ICTV

ICTV разработала современную систему классификации и сформулировала руководящие принципы, придающие большее значение определенным свойствам вирусов для обеспечения однородности семейств. Была установлена унифицированная таксономия (универсальная система классификации вирусов). Изучена лишь небольшая часть всего видового разнообразия вирусов. По состоянию на 2021 год ICTV определила 6 областей, 10 царств, 17 отделов, 2 подотдела, 39 классов, 65 порядков, 8 подпорядков, 233 семейства, 168 подсемейств, 2606 родов, 84 подродов и 10434 видов вирусов. Общая таксономическая структура таксономических рангов и суффиксы, используемые в таксономических названиях, представлены ниже. По состоянию на 2021 год ранги подобласти, подцарства и подкласса не используются, в то время как все остальные ранги находятся в использовании. Классификация Балтимора основана на механизме продукции мРНК. Вирусы должны генерировать мРНК из своих геномов для производства белков и репликации, однако в каждом семействе вирусов используются различные механизмы для достижения этой цели. Вирусные геномы могут быть одноцепочечными (ss) или двуцепочечными (ds), РНК или ДНК, и могут использовать или не использовать обратную транскриптазу (RT). Кроме того, одноцепочечные РНК-вирусы могут быть позитивными (+) или негативными (−). Эта классификация разделяет вирусы на семь групп: