Вирустарды зерттеу: тарихы, құрылысы және маңызы

Вирусология – вирустарды зерттеу ғылымы. Құрылысы, жіктелуі, эволюциясы, инфекция механизмі, емдеуде қолданылуы туралы маңызды мәліметтер.

15 мин оқу

100%

Дереккөз: Virology — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Вирустарды зерттеу

Study of viruses

the journals

Virology is the scientific study of biological viruses. It is a subfield of microbiology that focuses on their detection, structure, classification and evolution, their methods of infection and exploitation of host cells for reproduction, their interaction with host organism physiology and immunity, the diseases they cause, the techniques to isolate and culture them, and their use in research and therapy. The identification of the causative agent of tobacco mosaic disease (TMV) as a novel pathogen by Martinus Beijerinck (1898) is now acknowledged as being the official beginning of the field of virology as a discipline distinct from bacteriology. He realized the source was neither a bacterial nor a fungal infection, but something completely different. Beijerinck used the word "virus" to describe the mysterious agent in his 'contagium vivum fluidum' ('contagious living fluid'). Rosalind Franklin proposed the full structure of the tobacco mosaic virus in 1955. One main motivation for the study of viruses is because they cause many infectious diseases of plants and animals. The study of the manner in which viruses cause disease is viral pathogenesis. The degree to which a virus causes disease is its virulence. These fields of study are called plant virology, animal virology and human or medical virology. Virology began when there were no methods for propagating or visualizing viruses or specific laboratory tests for viral infections. The methods for separating viral nucleic acids (RNA and DNA) and proteins, which are now the mainstay of virology, did not exist. Now there are many methods for observing the structure and functions of viruses and their component parts. Thousands of different viruses are now known about and virologists often specialize in either the viruses that infect plants, or bacteria and other microorganisms, or animals. Viruses that infect humans are now studied by medical virologists. Virology is a broad subject covering biology, health, animal welfare, agriculture and ecology.

Вирусология – биологиялық вирустарды ғылыми тұрғыдан зерттеу саласы. Бұл микробиологияның вирус түрлерін анықтау, құрылымын, жіктелуін және эволюциясын, олардың инфекциялану әдістерін, жаңа қонақ клеткаларды пайдалану арқылы көбейтуін, қонақ организмнің физиологиясымен және иммунитетімен өзара әрекеттесуін, олар туғызатын ауруларды, оларды оқшаулау және өсіру тәсілдерін, сондай-ақ зерттеу және терапияда қолдануын қамтитын саласы. Мартинус Бейжеринктың (1898) темекі мозаикасы ауруын (ТМВ) жаңа патоген ретінде анықтауы вирусологияның бактериологиядан ерекше ғылым ретінде ресми түрде басталуы деп есептеледі. Ол бұл көздің бактериялық немесе саңырауқұлақтық инфекция емес, мүлдем басқа нәрсе екенін түсінді. Бейжеринк өз еңбегіндегі «contagium vivum fluidum» («жұқпалы тірі сұйықтық») деп аталатын құпия агентті сипаттау үшін «вирус» сөзін қолданды. Розалинд Франклин 1955 жылы темекі мозаикасы вирусының толық құрылымын ұсынды. Вирустарды зерттеудің басты себептерінің бірі – олардың өсімдіктер мен жануарлардың көптеген жұқпалы ауруларын тудыруы. Вирустардың ауруды қалай туғызатынын зерттеу вирустық патогенез деп аталады. Вирустың ауру тудыру қабілеті оның вируленттілігімен анықталады. Бұл зерттеу салалары өсімдік вирусологиясы, жануар вирусологиясы және адам немесе медициналық вирусология деп аталады. Вирусология вирустарды көбейту немесе көру, сондай-ақ вирустық инфекцияларды анықтау үшін арнайы зертханалық тесттердің жоқ болған кезде басталды. Вирустық нуклеин қышқылдарын (РНК және ДНҚ) және белоктарды бөлу әдістері, қазір вирусологияның негізгі құралы болып табылады, бұрын болған емес. Қазір вирустардың құрылымын және функцияларын, олардың құрамдас бөліктерін зерттеуге арналған көптеген әдістер бар. Мыңдаған түрлі вирустар белгілі және вирусологтар көбінесе өсімдіктерді, бактерияларды және басқа микроорганизмдерді немесе жануарларды инфекциялайтын вирустарға маманданған. Адамдарды инфекциялайтын вирустарды қазір медициналық вирусологтар зерттейді. Вирусология – биология, денсаулық сақтау, жануарлардың әл-ауқатын қорғау, ауыл шаруашылығы және экологияны қамтитын кең ауқымды пән.

Тарих

Луи Пастер құтыру ауруының қоздырғышын таба алмады және микроскоппен анықтау мүмкін емес патоген туралы болжам жасады. 1884 жылы француз микробиологы Шарль Шамберланд (немесе Пастер-Шамберланд сүзгісі) бактерияларды ерітіндіден толығымен алып тастауға жеткілікті кішкентай тесіктері бар сүзгіні ойлап тапты. 1892 жылы орыс биологы Дмитрий Ивановский осы сүзгіні қазір темекі мозаикасы вирусы деп белгілі болған нәрсені зерттеу үшін пайдаланды: жұққан темекі өсімдіктерінен алынған майдаланған жапырақтар бактерияларды алып тастағаннан кейін де жұқпалы болып қала берді. Ивановский инфекцияны бактериялар өндіретін токсин тудырған болуы мүмкін деп болжады, бірақ бұл идеяны дамытпады. Ол кезде барлық жұқпалы агенттер сүзгі арқылы тоқтатылып, қоректік ортада өсіріледі деп есептелді – бұл аурудың микробтық теориясының бір бөлігі болды. 1898 жылы голланд микробиологы Мартинус Бейеринк тәжірибелерді қайталап, сүзгіленген ерітіндіде жаңа инфекциялық агент бар екеніне көз жеткізді. Ол агенттің тек бөлінетін жасушаларда ғана көбейетінін байқады, бірақ оның тәжірибелері оның бөлшектерден тұратынын көрсетпегендіктен, оны «контагиум вивум флюидум» (ерітілген тірі микроб) деп атады және «вирус» сөзін қайта енгізді. Бейеринк вирустардың сұйық табиғатта екенін мәлімдеді, бұл кейіннен Венделл Стэнли вирустардың бөлшектік екенін дәлелдеген теорияны жоққа шығарды. 20 ғасырдың басында ағылшын бактериологы Фредерик Творт бактерияларды жұқтыратын вирустар тобын ашты, олар қазір бактериофагтар (немесе жиі «фагтар») деп аталады, ал француз-канад микробиологы Феликс д’Эрель ағар табақта бактерияларға қосылғанда бактериялардың өлі аймақтарын тудыратын вирустарды сипаттады. Ол осы вирустардың суспензиясын дәл сұйылтып, барлық бактерияларды өлтірудің орнына, ең жоғары сұйылту (ең төмен вирус концентрациясы) өлі организмдердің дискретті аймақтарын құрайтынын анықтады. Осы аймақтарды санап, сұйылту коэффициентіне көбейту оған бастапқы суспензиядағы вирустардың санын есептеуге мүмкіндік берді. Фагтар тиф және холера сияқты ауруларды емдеудің әлеуетті құралы ретінде жарияланды, бірақ олардың перспективасы пенициллиннің дамуымен ұмытылды. Бактериялардың антибиотиктерге қарсы тұру қабілетінің өсуі бактериофагтарды терапиялық мақсатта қолдануға қызығушылықты қайта жақтандырды. 19 ғасырдың соңында вирустар жұқпалылығы, сүзгілерден өту қабілеті және тірі иегерге қажеттілігі тұрғысынан сипатталды. Вирустар тек өсімдіктер мен жануарларда ғана өсірілді. 1906 жылы Росс Гранвилл Харрисон лимфада тінді өсіру әдісін ойлап тапты, ал 1913 жылы Э. Стейнхардт, К. Израиль және Р. А. Ламберт осы әдісті теңіз шошқасының мүйіз қабығының тінді фрагменттерінде вакцина вирусын өсіру үшін пайдаланды. 1928 жылы Х. Б. Мейтленд және М. С. Мейтленд вакцина вирусын майдаланған тауық бүйректерінің суспензиясында өсірді. Олардың әдісі 1950 жылдарға дейін, полиомиелит вирусы вакцина өндірісі үшін кең көлемде өсірілгенге дейін кеңінен қолданылмады. 1931 жылы американдық патолог Эрнест Уильям Гудпастур мен Элис Майлз Вудрафф құрт жұмыртқасында тұмау және басқа да бірнеше вирустарды өсірген кезде тағы бір маңызды жаңалық болды. 1949 жылы Джон Франклин Эндерс, Томас Веллер және Фредерик Роббинс абортталған адам эмбрионының жасушаларынан полиомиелит вирусын өсірді, бұл тұтас жануарлар тіні немесе жұмыртқалар қолданылмай өсірілген алғашқы вирус болды. Бұл жұмыс Хилари Копровскиге, содан кейін Джонас Салкке полиомиелитке қарсы тиімді вакцина жасауға мүмкіндік берді. Вирустардың алғашқы суреттері 1931 жылы неміс инженерлері Эрнст Руска мен Макс Кноллдың электронды микроскопияны ойлап тапқаннан кейін алынды. 1935 жылы американдық биохимигі және вирусологы Венделл Мередит Стэнли темекі мозаикасы вирусын зерттеп, оның көбінесе ақуыздан тұратынын анықтады. Біраз уақыттан кейін бұл вирус ақуыз және РНК бөліктеріне бөлінді. Темекі мозаикасы вирусы алғаш рет кристалданып, оның құрылымын егжей-тегжейлі зерттеуге мүмкіндік берді. Кристалданған вирусқа алғашқы рентгендік дифракциялық суреттерді 1941 жылы Бернал мен Фанкухен түсірді. Рентген кристалографиялық суреттеріне сүйене отырып, Розалинд Франклин 1955 жылы вирус құрылымын толық анықтады. Сол жылы Хайнц Френкель Конрат пен Робли Уильямс тазартылған темекі мозаикасы вирусының РНК және оның ақуыздық қабығы өздігінен жиналып, функционалды вирустарды құрай алатынын көрсетті, бұл қарапайым механизм вирустардың қонақ жасушаларында қалай пайда болатынының ықтимал жолы екенін ұсынды. 20 ғасырдың екінші жартысы вирус ашудың «алтын ғасыры» болды, және осы жылдар ішінде жануарлар, өсімдіктер және бактериялар вирустарының көп бөлігі ашылды. 1957 жылы жылқы артериовирусы және сиырдың вирус диареясының (пестивирус) қоздырғышы ашылды. 1963 жылы Барух Блумберг гепатит B вирусын ашты, ал 1965 жылы Ховард Темін алғашқы ретровирусты сипаттады. Ретровирустардың РНК-дан ДНК көшірмелерін жасау үшін қолданатын фермент – кері транскриптаза 1970 жылы Темін мен Дэвид Балтимор тәуелсіз түрде сипатталды. 1983 жылы Люк Монтанье басқаратын Франциядағы Пастер институтының командасы қазір ВИЧ деп аталатын ретровирусты алғаш рет оқшаулады. 1989 жылы Майкл Хаугтон басқаратын Chiron Corporation командасы гепатит C вирусын ашты.

Louis Pasteur was unable to find a causative agent for rabies and speculated about a pathogen too small to be detected by microscopes. In 1884, the French microbiologist Charles Chamberland invented the Chamberland filter (or Pasteur Chamberland filter) with pores small enough to remove all bacteria from a solution passed through it. In 1892, the Russian biologist Dmitri Ivanovsky used this filter to study what is now known as the tobacco mosaic virus: crushed leaf extracts from infected tobacco plants remained infectious even after filtration to remove bacteria. Ivanovsky suggested the infection might be caused by a toxin produced by bacteria, but he did not pursue the idea. At the time it was thought that all infectious agents could be retained by filters and grown on a nutrient medium—this was part of the germ theory of disease. In 1898, the Dutch microbiologist Martinus Beijerinck repeated the experiments and became convinced that the filtered solution contained a new form of infectious agent. He observed that the agent multiplied only in cells that were dividing, but as his experiments did not show that it was made of particles, he called it a contagium vivum fluidum (soluble living germ) and reintroduced the word virus. Beijerinck maintained that viruses were liquid in nature, a theory later discredited by Wendell Stanley, who proved they were particulate. In the early 20th century, the English bacteriologist Frederick Twort discovered a group of viruses that infect bacteria, now called bacteriophages (or commonly 'phages'), and the French Canadian microbiologist Félix d'Herelle described viruses that, when added to bacteria on an agar plate, would produce areas of dead bacteria. He accurately diluted a suspension of these viruses and discovered that the highest dilutions (lowest virus concentrations), rather than killing all the bacteria, formed discrete areas of dead organisms. Counting these areas and multiplying by the dilution factor allowed him to calculate the number of viruses in the original suspension. Phages were heralded as a potential treatment for diseases such as typhoid and cholera, but their promise was forgotten with the development of penicillin. The development of bacterial resistance to antibiotics has renewed interest in the therapeutic use of bacteriophages. By the end of the 19th century, viruses were defined in terms of their infectivity, their ability to pass filters, and their requirement for living hosts. Viruses had been grown only in plants and animals. In 1906 Ross Granville Harrison invented a method for growing tissue in lymph, and in 1913 E. Steinhardt, C. Israeli, and R. A. Lambert used this method to grow vaccinia virus in fragments of guinea pig corneal tissue. In 1928, H. B. Maitland and M. C. Maitland grew vaccinia virus in suspensions of minced hens' kidneys. Their method was not widely adopted until the 1950s when poliovirus was grown on a large scale for vaccine production. Another breakthrough came in 1931 when the American pathologist Ernest William Goodpasture and Alice Miles Woodruff grew influenza and several other viruses in fertilised chicken eggs. In 1949, John Franklin Enders, Thomas Weller, and Frederick Robbins grew poliovirus in cultured cells from aborted human embryonic tissue, the first virus to be grown without using solid animal tissue or eggs. This work enabled Hilary Koprowski, and then Jonas Salk, to make an effective polio vaccine. The first images of viruses were obtained upon the invention of electron microscopy in 1931 by the German engineers Ernst Ruska and Max Knoll. In 1935, American biochemist and virologist Wendell Meredith Stanley examined the tobacco mosaic virus and found it was mostly made of protein. A short time later, this virus was separated into protein and RNA parts. The tobacco mosaic virus was the first to be crystallised and its structure could, therefore, be elucidated in detail. The first X ray diffraction pictures of the crystallised virus were obtained by Bernal and Fankuchen in 1941. Based on her X ray crystallographic pictures, Rosalind Franklin discovered the full structure of the virus in 1955. In the same year, Heinz Fraenkel Conrat and Robley Williams showed that purified tobacco mosaic virus RNA and its protein coat can assemble by themselves to form functional viruses, suggesting that this simple mechanism was probably the means through which viruses were created within their host cells. The second half of the 20th century was the golden age of virus discovery, and most of the documented species of animal, plant, and bacterial viruses were discovered during these years. In 1957 equine arterivirus and the cause of bovine virus diarrhoea (a pestivirus) were discovered. In 1963 the hepatitis B virus was discovered by Baruch Blumberg, and in 1965 Howard Temin described the first retrovirus. Reverse transcriptase, the enzyme that retroviruses use to make DNA copies of their RNA, was first described in 1970 by Temin and David Baltimore independently. In 1983 Luc Montagnier's team at the Pasteur Institute in France, first isolated the retrovirus now called HIV. In 1989 Michael Houghton's team at Chiron Corporation discovered hepatitis C.

Вирустарды анықтау

Вирустарды анықтаудың бірнеше тәсілдері бар, олар вирус бөлшектерін (вириондарды) немесе олардың антигендерін немесе нуклеин қышқылын, сондай-ақ инфекциялық белсенділікті анықтауды қамтиды.

Электрондық микроскопия

Вирустар алғаш рет 1930 жылдары электронды микроскоптар ойда келген кезде көрінді. Бұл микроскоптар жарық орнына электрондық сәулелерді пайдаланады, олардың толқын ұзындығы өте қысқа болып келеді және жарық микроскоптарымен көрінбейтін нысандарды анықтауға мүмкіндік береді. Электрондық микроскоптардың максималды ұлғайту қабілеті 10 000 000 есеге дейін жетеді, ал жарық микроскоптары үшін бұл көрсеткіш шамамен 1500 еседі құрайды. Вирусологтар вирустарды жақсырақ көру үшін көбінесе теріс бояу әдісін қолданады. Осы процедурада вирустар уран ацетаты сияқты металл тұздарының ерітіндісіне шашыратылады. Металл атомдары электрондарды өткізбейді, сондықтан вирустар металл атомдарының қара фондық түсінде көрінеді. Көптеген вирустар осы техника арқылы ашылды және теріс бояу электронды микроскопиясы вирусологтар үшін әлі де құнды құрал болып табылады. Традициялық электронды микроскопияның кемшіліктері бар: вирустар электронды микроскоптың ішіндегі жоғары вакуумда кептіруден зақымданады, сондай-ақ электрондық сәуле өзі де бұзушылыққа әкеледі. Бұл биомолекулалық құрылымдарды дерлік атомдық дәлдікпен анықтауға мүмкіндік береді және вирустардың құрылымын анықтау үшін рентгендік кристаллографияға немесе ЯМР спектроскопиясына альтернатива ретінде кең назар аударды.

Өсімдіктердің өсуі

Вирустар - міндетті жасушалық паразиттер, олар тек қожайынның тірі жасушаларының ішінде көбейеді, сондықтан оларды зертханада өсіру үшін осы жасушалар қажет. Жануарларды жұқтыратын вирустар үшін (әдетте "жануар вирустары" деп аталады) зертханалық жасуша мәдениеттерінде өсірілген жасушалар қолданылады. Бұрын құрт жұмыртқаларын пайдаланып, эмбрионды қоршап тұрған мембраналарда вирустарды өсіретін. Бұл әдіс әлі күнге дейін кейбір вакциналарды өндіруде қолданылады. Бактерияларды жұқтырған вирустар үшін – бактериофагтар – сынақ түтіктерінде өсетін бактерияларды тікелей пайдалануға болады. Өсімдік вирустары үшін табиғи қожайын өсімдіктерін немесе, әсіресе инфекция анық емес болғанда, инфекция белгілері айқын көрінетін индикатор өсімдіктерін қолдануға болады. Жасуша мәдениеттерінде өскен вирустарды олардың қожайын жасушаға тигізетін зиянды әсері арқылы жанама түрде анықтауға болады. Бұл цитопатиялық әсерлер көбінесе вирустың түріне тән. Мысалы, герпес симплекс вирустары жасушалардың, әдетте адам фибробластарының, ерекше "көпіршіктенуін" тудырады. Кейбір вирустар, мысалы, сілекей без вирусы, тауықтардың қызыл қан жасушаларының жұқтырылған жасушаларға қатты жабысуына себеп болады. Бұл "гемасорбция" деп аталады. Кейбір вирустар жасушалық қабаттарда жергілікті "зақымданулар" тудырады, олар – плактар – сандық талдауларда және плактарды азайту арқылы вирустың түрін анықтау үшін пайдалы. Жасуша мәдениеттерінде өсірілген вирустар олардың расталған және жаңа вирусқа қарсы препараттарға сезімталдығын өлшеу үшін қолданылады.

Серология

Вирустар – антиденелерді өндіруге түрткіс беретін антигендер, ал осы антиденелер вирустарды зерттеу үшін зертханаларда қолданылады. Туысқан вирустар көбінесе бір-бірінің антиденелерімен әрекеттеседі және кейбір вирустар олар әрекеттесетін антиденелерге сәйкес аталады. Бұрын тек жануарлардың сарысуынан (қан сұйықтығынан) алынған антиденелерді пайдалану серология деп аталады. Тестте антиденелердің реакциясы болғаннан кейін, оны растау үшін басқа әдістер қажет. Ескі әдістерге комплементті бекіту сынағы, гемагглютинацияны тежеу және вирус бейтараптандыру кіретін. Жаңа әдістер ферменттік иммуноанализді (ЭИА) қолданады. ПТР ойлап табылғанға дейін вирустық инфекцияларды жылдам растау үшін иммунофлуоресценция қолданылды. Бұл антиденелер қолданылатындықтан вирус түріне тән инфекциялық тест. Антиденелер люминесцентті бояумен белгіленеді және өзгертілген жарық көзі бар оптикалық микроскопты қолданғанда, инфекцияланған жасушалар қараңғыда жарқырайды.

Полимеразалық тізбекті реакция (ПЦР) және басқа нуклеин қышқылының анықталу әдістері

ПТР – өсімдіктер мен жануарларды қоса алғанда, барлық түрдегі вирустарды анықтаудың негізгі әдісі болып табылады. Ол вирусқа тән РНК немесе ДНҚ іздерін анықтау арқылы жұмыс істейді. ПТР өте сезімтал және нақты, бірақ оңай ластануға ұшырауы мүмкін. Ветеринариялық және медициналық вирусологияда қолданылатын көптеген тесттер ПТР немесе транскрипциялық күшейту сияқты ұқсас әдістерге негізделген. Жаңа вирус, мысалы, COVID-19 коронавирусы пайда болғанда, вирус геномы тізбектелген және вирус ДНК немесе РНК-ның ерекше аймақтары анықталған жағдайда, нақты тестті жылдам жасауға болады. Микрофлюидтік тесттердің енгізілуі осы тесттердің көпшілігін автоматтандыруға мүмкіндік берді. ПТР-дың нақтылығы мен сезімталдығына қарамастан, ол жұқпалы және жұқпалы емес вирустарды ажырата алмайды, сондықтан "емнің сәттілігін тексеру" тесттерін инфекция орнынан қалдық вирус нуклеин қышқылы жоғалуына мүмкіндік беру үшін 21 күнге дейін кешіктіруге тура келеді.

Диагностикалық сынақтар

Зертханаларда вирустарды анықтауға арналған көптеген диагностикалық тесттер нуклеин қышқылын күшейту әдістері, мысалы ПТР болып табылады. Кейбір тесттер вирустарды немесе олардың құраушыларын анықтайды, оларға электронды микроскопия және ферменттік иммуноанализ кіреді. "Үйде" немесе "өздік тестілеу" деп аталатын құрылғылар көбінесе жақтық ағын тестілері болып табылады, олар вирусты таңбаланған моноклоналды антиденелерді пайдаланып анықтайды. Бұлар сондай-ақ ауыл шаруашылығы, тамақ өнімдері және экология ғылымдарында да қолданылады.

Квантизация және вирустық жүктеме

Вирустарды санау (сандастыру) вирусологияда әрқашан маңызды рөл атқарды және вирустық жүктемені өлшеу арқылы адамдарға жұққан кейбір инфекцияларды бақылауда маңызды болып табылады. Екі негізгі әдіс бар: толық жұқпалы вирус бөлшектерін санайтын жұқпалылық талдауы және барлық бөлшектерді, соның ішінде бұзылғандарын санайтын әдіс. Қонақ жасушалар ретінде өсімдіктер немесе бактериялық және жануарлар жасушаларының мәдениеттері қолданылады. Лабораториялық жануарлар, мысықтар ветеринариялық вирусологияда да қолданылады. Бұл талдаулар сандық болып табылады, онда нәтижелер үздіксіз шкаламен беріледі, немесе кванттық, онда оқиға орын алады немесе орын алмайды. Сандық талдаулар абсолютті мәндерді, ал кванттық талдаулар статистикалық ықтималдықты көрсетеді, мысалы, 50% қонақ жасушалардың, өсімдіктердің немесе жануарлардың жұқтырылуын қамтамасыз ету үшін қажетті сынама көлемі. Бұл инфекциялық дозаның медианасы немесе ID50 деп аталады. Жұқпалы бактериофагтарды бактериялардың "көктемесіндегі" мәдениеттік табақшаларға егу арқылы санауға болады. Вирустардың концентрациясы төмен болғанда, олар көктемеде санайтын тесіктерді құрайды. Вирустардың саны плака құрайтын бірліктерде (PFU) көрсетіледі. Бактериофагтар үшін, мәдениетте өсірілмейтін бактерияларда, вирустық жүктеме талдауы қолданылады. Фокус құру талдауы (FFA) – плака құру талдауының бір түрі, бірақ плака құруды анықтау үшін жасуша лизіне сүйенудің орнына, FFA вирус антигеніне арналған флуоресцентті антиденелерді қолданатын иммунохимиялық әдістерді қолданады, жұққан жасушаларды және жұқпалы вирус бөлшектерін плака пайда болғанға дейін анықтау үшін. FFA жасуша мембраналарын лизаламаған вирустардың кластарын сандық анықтау үшін өте пайдалы, себебі бұл вирустар плака талдауына жарамсыз. Плака талдауы сияқты, қонақ жасушаларының моноқабаттары вирустың әртүрлі еңкейтілген үлгілерімен жұқтырылады және жұқпалы вирустың таралуын шектейтін жартылай қатты жабылатын ортада салыстырмалы түрде қысқа инкубация кезеңіне (мысалы, 24–72 сағат) инкубацияланады, бұл жұққан жасушалардың локалданған кластерлерін (ошақтарын) құрайды. Плакалар вирус антигеніне қарсы флуоресцентті антиденелермен зерттеледі және ошақтардың санын санау және сандық бағалау үшін флуоресценттік микроскопия қолданылады. FFA әдетте плака немесе елу пайыздық жасуша мәдениетінің жұқпалы дозасы (TCID50) талдауынан тезірек нәтижелер береді, бірақ қажетті реагенттер мен жабдықтар тұрғысынан қымбат болуы мүмкін. Тәжірибе аяқталу уақыты пайдаланушы санап отырған аумақтың мөлшеріне байланысты. Үлкен аумақ көбірек уақытты қажет етеді, бірақ сынаманың нақтырақ бейнесін бере алады. FFA нәтижелері миллилитрге шаққандағы фокус құру бірліктері (FFU/мл) ретінде көрсетіледі.

Counting viruses (quantitation) has always had an important role in virology and has become central to the control of some infections of humans where the viral load is measured. There are two basic methods: those that count the fully infective virus particles, which are called infectivity assays, and those that count all the particles including the defective ones. For host cells, plants or cultures of bacterial or animal cells are used. Laboratory animals such as mice have also been used particularly in veterinary virology. These are assays are either quantitative where the results are on a continuous scale or quantal, where an event either occurs or it does not. Quantitative assays give absolute values and quantal assays give a statistical probability such as the volume of the test sample needed to ensure 50% of the hosts cells, plants or animals are infected. This is called the median infectious dose or ID 50. Infective bacteriophages can be counted by seeding them onto "lawns" of bacteria in culture dishes. When at low concentrations, the viruses form holes in the lawn that can be counted. The number of viruses is then expressed as plaque forming units. For the bacteriophages that reproduce in bacteria that cannot be grown in cultures, viral load assays are used. The focus forming assay (FFA) is a variation of the plaque assay, but instead of relying on cell lysis in order to detect plaque formation, the FFA employs immunostaining techniques using fluorescently labeled antibodies specific for a viral antigen to detect infected host cells and infectious virus particles before an actual plaque is formed. The FFA is particularly useful for quantifying classes of viruses that do not lyse the cell membranes, as these viruses would not be amenable to the plaque assay. Like the plaque assay, host cell monolayers are infected with various dilutions of the virus sample and allowed to incubate for a relatively brief incubation period (e. g., 24–72 hours) under a semisolid overlay medium that restricts the spread of infectious virus, creating localized clusters (foci) of infected cells. Plates are subsequently probed with fluorescently labeled antibodies against a viral antigen, and fluorescence microscopy is used to count and quantify the number of foci. The FFA method typically yields results in less time than plaque or fifty percent tissue culture infective dose (TCID50) assays, but it can be more expensive in terms of required reagents and equipment. Assay completion time is also dependent on the size of area that the user is counting. A larger area will require more time but can provide a more accurate representation of the sample. Results of the FFA are expressed as focus forming units per milliliter, or FFU/

Вирустық жүктемеге арналған тесттер

Инфекциялық вирус бөлшегін өлшеу үшін анализ жасалғанда (плакалық анализ, фокустық анализ), вирустық титр көбінесе инфекциялық вирус бөлшектерінің концентрациясын көрсетеді, бұл жалпы вирус бөлшектерінен өзгеше. Вирустық жүктемеге арналған тестілер әдетте бөлшектердің санынан гөрі вирустық геномдардың санын есептейді және ПТР-ге ұқсас әдістерді пайдаланады. Вирустық жүктеме тестілері HIV инфекциясын бақылауда маңызды рөл атқарады. Бұл әмбебап әдіс өсімдік вирустарына да қолданылуы мүмкін.

Молекулалық биология

Молекулалық вирусология – вирустарды нуклеин қышқылдары және ақуыздар деңгейінде зерттеу пәні. Молекулалық биологтар жасаған әдістердің бәрі вирусологияда тиімді екенін дәлелдеді. Вирустардың шағын өлшемдері және салыстырмалы түрде қарапайым құрылысы оларды осы техникалармен зерттеу үшін өте қолайлы жасайды.

Тазартқыш вирустар және олардың құрамдас бөліктері

[[Файл:CsCl тығыздық градиентімен центрифугалау. JPG файл оң жақта. Каэзий хлориді (CsCl) ерітіндісі және ротавирустың екі морфологиялық түрі көрсетілген. 100 г күшпен центрифугалаудан кейін CsCl ерітіндісінде тығыздық градиенті пайда болады және вирус бөлшектері тығыздықтарына сәйкес бөлінеді. Түтіктің биіктігі 10 см. Вирустар – екі "сүтті" аймақ, бір-біріне жақын орналасқан. Дифференциалды центрифугалаудан кейін вирус суспензиялары көбінесе бірдей тұндыру коэффициентіне ие қалдықтармен ластанады, оларды процедура арқылы жою мүмкін емес. Мұндай жағдайларда центрифугалау әдісіне өзгеріс енгізіліп, оны жүзу тығыздығы бойынша центрифугалау деп атайды. Бұл әдісте дифференциалдық центрифугадан алынған вирустар бірнеше сағат бойы өте жоғары жылдамдықпен қант немесе тұздардың тығыз ерітінділерінде центрифугаланады, осы кезде түтікте тығыздық градиенті төменнен жоғарыға қарай қалыптасады. Кейбір жағдайларда алдын ала жасалған градиенттер қолданылады, онда тығыздығы бірте-бірте төмендейтін ерітінділер бір-біріне мұқият жабыстырылады. Өлі теңіздегі зат сияқты, центробегтік күшке қарамастан вирус бөлшектері өзінен тығыз ерітінділерге шөге алмайды және түтікте көрінетін, шоғырланған вирус қабаттарын құрайды. Цезий хлориді осы ерітінділер үшін жиі қолданылады, себебі ол салыстырмалы түрде инертті, бірақ ультрацентрифугада жоғары жылдамдықпен центрифугаланғанда оңай градиент түзеді. Жүзу тығыздығы бойынша центрифугалау вирустың нуклеин қышқылдары мен белоктары сияқты компоненттерін тазарту үшін де қолданылуы мүмкін.

Вирустық геномдарды секвенирлеу

Вирустардың көпшілігі жарық микроскопымен көруге тым кішкентай болғандықтан, вирусты анықтау және зерттеу үшін вирусологияда секвенирлеу негізгі құралдардың бірі болып табылады. Дәстүрлі Сангер секвенирлеуі және жаңа буын секвенирлеуі (NGS) вирустарды негізгі және клиникалық зерттеулерде, сондай-ақ жаңа вирустық инфекцияларды диагностикалау, вирустық патогендердің молекулалық эпидемиологиясы және дәріге қарсы тұруды тексеру үшін қолданылады. ГенБанкте 2,3 миллионнан астам бірегей вирустық секвенирлеулер бар. Вирустық геномды секвенирлеу вирустық эпидемиология мен вирусты жіктеудің орталық әдісіне айналды.

Филогенетикалық талдау

Вирустық геномдарды тізбектеуден алынған деректер эволюциялық байланыстарды анықтауға қолданылады, және бұл филогенетикалық талдау деп аталады. PHYLIP сияқты бағдарламалық қамтамасы филогенетикалық ағаштарды құру үшін пайдаланылады. Бұл талдау вирустық инфекциялардың қауымдастықта таралуын зерттеуде (эпидемиология) де қолданылады.

Клондау

Диагностикалық тесттер немесе вакциналар үшін тазартылған вирустар немесе вирус компоненттері қажет болғанда, вирустарды өсірудің орнына клондау қолданылуы мүмкін. COVID-19 пандемиясының басында ауыр тыныс алу синдромы коронавирусының 2 РНК тізбегінің болуы, тесттерді жылдам дайындауға мүмкіндік берді. Вирустарды және олардың компоненттерін клондаудың бірнеше расталған әдістері бар. Клондау векторлары деп аталатын ДНК-ның шағын бөліктері көбінесе қолданылады, ал ең көп таралғандары – зертханада өзгертілген плазмидтер (бактериялар жасаған ДНК-ның кішкентай дөңгелек молекулалары). Вирустың нуклеин қышқылы немесе оның бір бөлігі плазмидке енгізіледі, оны бактериялар көптеген рет көшіреді. Бұл рекомбинантты ДНК вирус компоненттерін өндіру үшін табиғи вирустардың қажеті болмай пайдаланылуы мүмкін.

Фаг вирусологиясы

Бактерияларда, археяларда және саңырауқұлақтарда көбейетін вирустар бейресми түрде "фагтар" деп аталады, ал бактерияларды жұқтыратындары – бактериофагтар – вирусологияда және жалпы биологияда ерекше пайдалы. Бактериофагтар ХХ ғасырдың басында ашылған алғашқы вирустардың бірі болды, және оларды зертханада салыстырмалы түрде оңай және жылдам өсіруге болатындықтан, вирустар туралы біліміміздің көп бөлігі оларды зерттеу нәтижесінде пайда болды.

Генетика

Барлық вирустарда генетикалық зерттеулерге арналған гендер бар. Молекулалық биологияда қолданылатын клондау, мутация жасау, РНК-ны басу сияқты барлық техникалар вирустық генетикада қолданылады.

Қайта топтастыру

Қайта сұрыптау – әр түрлі ата-аналардан гендердің алмасуы, және ол сегменттелген геномдары бар (екі немесе одан көп нуклеин қышқылы молекулаларына бөлінген) вирустардың, мысалы, тұмау вирустары мен ротавирустардың генетикасын зерттеуде ерекше пайдалы. Осылайша, серотип сияқты қасиеттерді кодтайтын гендерді анықтауға болады.

Қайта үйлестіру

Көп жағдайда реассортиментпен шатастырылатын рекомбинация да гендердің араласуы болып табылады, бірақ оның механизмі басқаша: толық молекулалардың орнына, РНК немесе ДНҚ көшіру циклы кезінде ДНК немесе РНК молекулаларының бөліктері біріктіріледі. Рекомбинация табиғатта реассортименттен сирек кездеседі, бірақ вирустық гендердің құрылымын және функцияларын зерттеу үшін зертханалардағы тиімді құрал болып табылады.

Кері генетика

Кері генетика вирусологиядағы қуатты зерттеу әдісі болып табылады. Бұл процедурада вирустың геномдарының комплементарлы ДНҚ (cDNA) көшірмелері, "жұқпалы клондары" деп аталады, генетикалық өзгертілген вирустарды жасау үшін пайдаланылады, олар кейін вируленттілік немесе жұқтыру қабілеті сияқты өзгерістерге қатысты тексеріледі.

ICTV жіктеуіші

ICTV қазіргі классификация жүйесін әзірледі және отбасылық біртектілікті сақтау үшін кейбір вирустардың қасиеттеріне басымдық беретін нұсқаулар жазды. Бірыңғай таксономия (вирустарды жіктеудің әмбебап жүйесі) құрылды. Вирустардың жалпы әртүрлілігінің аз ғана бөлігі зерттелді. 2021 жылға дейін 6 әлем, 10 патшалық, 17 тип, 2 субтип, 39 класс, 65 тәртіп, 8 подтәртіп, 233 отбасы, 168 подотбасы, 2606 туыс, 84 субтуыс және вирустардың 10434 түрі ICTV арқылы анықталды. Таксономиялық атауларда қолданылатын таксономиялық деңгейлердің жалпы құрылымы және жұрнақтары төменде көрсетілген. 2021 жылдан бастап субәлем, субпатшалық және субкласс деңгейлері қолданылмайды, ал қалған деңгейлердің барлығы қолданылуда. Вирустардың Балтимор классификациясы мРНК өндірісінің механизміне негізделген. Вирустар ақуыздарды өндіру және көбейту үшін геномдарынан мРНК жасауы керек, бірақ әр вирустың отбасында бұған жету үшін әртүрлі механизмдер қолданылады. Вирустық геномдар бір тізбекті (ss) немесе екі тізбекті (ds), РНК немесе ДНҚ болуы мүмкін, сондай-ақ кері транскриптазаны (RT) пайдалануы немесе пайдаланбауы мүмкін. Бұған қоса, ssРНК вирустары оң (+) немесе теріс (-) полюсті болуы мүмкін. Бұл классификация вирустарды жеті топқа бөледі: