Молекулярная генетика: от основ к современным исследованиям.

Введение

Научное изучение генов на молекулярном уровне – нетехническое введение в тему.

Молекулярная генетика – это раздел биологии, изучающий, как различия в структуре или экспрессии молекул ДНК проявляются в виде изменчивости между организмами. Молекулярная генетика часто использует "исследовательский подход" для определения структуры и/или функции генов в геноме организма с помощью генетических скринингов. Эта область знаний основана на объединении нескольких дисциплин биологии: классической менделевской наследственности, клеточной биологии, молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии. Она интегрирует эти дисциплины для изучения таких явлений, как генетическая наследственность, регуляция и экспрессия генов, а также молекулярные механизмы, лежащие в основе различных жизненных процессов. Таким образом, молекулярная генетика является мощным методом установления связи между мутациями и генетическими заболеваниями, что может способствовать поиску методов лечения различных генетических болезней.

История

Открытие ДНК как чертежа жизни и прорывы в исследованиях молекулярной генетики стали результатом объединенных усилий многих ученых. В 1869 году химик Иоганн Фридрих Мишер, изучавший состав лейкоцитов, обнаружил и выделил из клеточного ядра новую молекулу, которую он назвал нуклеином – это стало первым открытием молекулы ДНК, впоследствии определенной как молекулярная основа жизни. Он установил, что она состоит из водорода, кислорода, азота и фосфора. Биохимик Альбрехт Коссель идентифицировал нуклеин как нуклеиновую кислоту и дал ей название дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Он продолжил исследования, выделив основные строительные блоки ДНК и РНК, состоящие из нуклеотидов: аденина, гуанина, тимина, цитозина и урацила. Его работа над нуклеотидами была отмечена Нобелевской премией по физиологии и медицине. В начале 1900-х годов Грегор Мендель, ставший одним из основоположников генетики, внес значительный вклад в эту область благодаря своим экспериментам с горохом, в ходе которых он открыл принципы наследования, такие как рецессивные и доминантные признаки, не зная при этом состава генов. В середине XIX века анатом Вальтер Флемминг открыл хромосомы и процесс их разделения – митоз. Его работа, совместно с работами Теодора Бовери, привела к созданию хромосомной теории наследственности, которая помогла объяснить закономерности, наблюдаемые Менделем ранее. Для развития молекулярной генетики как дисциплины потребовалось несколько научных открытий. Ключевым было открытие ДНК как средства передачи генетического кода от клетки к клетке и от поколения к поколению, что позволило идентифицировать молекулу, ответственную за наследственность. Молекулярная генетика возникла из исследований генетической трансформации бактерий. В 1944 году Эйвери, МакЛеод и Маккарти выделили ДНК из вирулентного штамма *S. pneumoniae* и, используя только эту ДНК, смогли превратить непатогенный штамм в патогенный. Они назвали процесс поглощения, включения и экспрессии ДНК бактериями «трансформацией». Это открытие показало, что ДНК является генетическим материалом бактерий. Бактериальная трансформация часто индуцируется стрессовыми условиями, а ее функция, по-видимому, заключается в восстановлении геномных повреждений. Эти закономерности, известные как правила Чаргаффа, способствовали пониманию молекулярной генетики. Фаговая группа – это неформальная сеть биологов, возглавляемая Максом Дельбрюком, которая внесла значительный вклад в молекулярную генетику и истоки молекулярной биологии в период с 1945 по 1970 год. Фаговая группа получила свое название от бактериофагов – вирусов, заражающих бактерии, которые группа использовала в качестве экспериментальных модельных организмов. Исследования молекулярных генетиков, связанных с этой группой, помогли понять, как генно-кодируемые белки функционируют в репликации ДНК, восстановлении ДНК и рекомбинации ДНК, а также как вирусы собираются из белковых и нуклеиновых компонентов (молекулярный морфогенез). Кроме того, была установлена роль кодонов, завершающих трансляцию. Одно из примечательных исследований было проведено Сиднеем Бреннером и его коллегами с использованием «янтарных» мутантов, дефектных в гене, кодирующем основной белок головки бактериофага T4. Это исследование продемонстрировало соответствие структуры гена и кодируемого им полипептида, предоставив убедительные доказательства «гипотезы последовательности», согласно которой аминокислотная последовательность белка определяется нуклеотидной последовательностью гена, определяющего этот белок. Выделение рестрикционной эндонуклеазы в *E. coli* Арбером и Линном в 1969 году открыло область генетической инженерии. Рестрикционные ферменты использовались для линеаризации ДНК для разделения с помощью электрофореза, а саузерн-блоттинг позволял идентифицировать специфические фрагменты ДНК с помощью гибридизационных зондов. В 1971 году Берг использовал рестрикционные ферменты для создания первой рекомбинантной молекулы ДНК и первой рекомбинантной ДНК-плазмиды. В 1972 году Коэн и Бойер создали первый рекомбинантный ДНК-организм, введя рекомбинантные ДНК-плазмиды в *E. coli* (процесс, известный как бактериальная трансформация), и тем самым проложили путь к молекулярному клонированию. Разработка методов секвенирования ДНК в конце 1970-х годов, сначала Максамом и Гилбертом, а затем Фредериком Сэнгером, стала ключевым моментом в исследованиях молекулярной генетики и позволила ученым начать проводить генетические скрининги для сопоставления генотипических последовательностей с фенотипами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием Taq-полимеразы, изобретенная Маллисом в 1985 году, позволила ученым создавать миллионы копий определенной последовательности ДНК, которые можно было использовать для трансформации или манипулировать ими с помощью разделения в агарозном геле. Десять лет спустя была секвенирована первая целая геномом (*Haemophilus influenzae*), за которой последовало секвенирование генома человека в рамках проекта «Геном человека» в 2001 году. Кульминацией всех этих открытий стала новая область – геномика, которая связывает молекулярную структуру гена с белком или РНК, кодируемыми этим сегментом ДНК, и функциональную экспрессию этого белка в организме. Сегодня, благодаря применению методов молекулярной генетики, геномика изучается на многих модельных организмах, а данные собираются в компьютерных базах данных, таких как NCBI и Ensembl. Компьютерный анализ и сравнение генов внутри и между различными видами называется биоинформатикой и связывает генетические мутации с эволюцией.

The discovery of DNA as the blueprint for life and breakthroughs in molecular genetics research came from the combined works of many scientists. In 1869, chemist Johann Friedrich Miescher, who was researching the composition of white blood cells, discovered and isolated a new molecule that he named nuclein from the cell nucleus, which would ultimately be the first discovery of the molecule DNA that was later determined to be the molecular basis of life. He determined it was composed of hydrogen, oxygen, nitrogen and phosphorus. Biochemist Albrecht Kosell identified nuclein as a nucleic acid and provided its name deoxyribonucleic acid (DNA). He continued to build on that by isolating the basic building blocks of DNA and RNA; made up of the nucleotides: adenine, guanine, thymine, cytosine. and uracil. His work on nucleotides earned him a Nobel Prize in Physiology. In the early 1900s, Gregor Mendel, who became known as one of the fathers of genetics, made great contributions to the field of genetics through his various experiments with pea plants where he was able to discover the principles of inheritance such as recessive and dominant traits, without knowing what genes where composed of. In the mid 19th century, anatomist Walther Flemming, discovered what we now know as chromosomes and the separation process they undergo through mitosis. His work along with Theodor Boveri first came up with the Chromosomal Theory of Inheritance, which helped explain some of the patterns Mendel had observed much earlier. For molecular genetics to develop as a discipline, several scientific discoveries were necessary. The discovery of DNA as a means to transfer the genetic code of life from one cell to another and between generations was essential for identifying the molecule responsible for heredity. Molecular genetics arose initially from studies involving genetic transformation in bacteria. In 1944 Avery, McLeod and McCarthy isolated DNA from a virulent strain of S. pneumoniae, and using just this DNA were able to convert a harmless strain to virulence. They called the uptake, incorporation and expression of DNA by bacteria "transformation". This finding suggested that DNA is the genetic material of bacteria. Bacterial transformation is often induced by conditions of stress, and the function of transformation appears to be repair of genomic damage. These rules, known as Chargaff's rules, helped to understand of molecular genetics. The phage group was an informal network of biologists centered on Max Delbrück that contributed substantially to molecular genetics and the origins of molecular biology during the period from about 1945 to 1970. The phage group took its name from bacteriophages, the bacteria infecting viruses that the group used as experimental model organisms. Studies by molecular geneticists affiliated with this group contributed to understanding how gene encoded proteins function in DNA replication, DNA repair and DNA recombination, and on how viruses are assembled from protein and nucleic acid components (molecular morphogenesis). Furthermore, the role of chain terminating codons was elucidated. One noteworthy study was performed by Sydney Brenner and collaborators using "amber" mutants defective in the gene encoding the major head protein of bacteriophage T4. This study demonstrated the co linearity of the gene with its encoded polypeptide, thus providing strong evidence for the "sequence hypothesis" that the amino acid sequence of a protein is specified by the nucleotide sequence of the gene determining the protein. The isolation of a restriction endonuclease in E. coli by Arber and Linn in 1969 opened the field of genetic engineering. Restriction enzymes were used to linearize DNA for separation by electrophoresis and Southern blotting allowed for the identification of specific DNA segments via hybridization probes. In 1971, Berg utilized restriction enzymes to create the first recombinant DNA molecule and first recombinant DNA plasmid. In 1972, Cohen and Boyer created the first recombinant DNA organism by inserting recombinant DNA plasmids into E. coli, now known as bacterial transformation, and paved the way for molecular cloning. The development of DNA sequencing techniques in the late 1970s, first by Maxam and Gilbert, and then by Frederick Sanger, was pivotal to molecular genetic research and enabled scientists to begin conducting genetic screens to relate genotypic sequences to phenotypes. Polymerase chain reaction (PCR) using Taq polymerase, invented by Mullis in 1985, enabled scientists to create millions of copies of a specific DNA sequence that could be used for transformation or manipulated using agarose gel separation. A decade later, the first whole genome was sequenced (Haemophilus influenzae), followed by the eventual sequencing of the human genome via the Human Genome Project in 2001. The culmination of all of those discoveries was a new field called genomics that links the molecular structure of a gene to the protein or RNA encoded by that segment of DNA and the functional expression of that protein within an organism. Today, through the application of molecular genetic techniques, genomics is being studied in many model organisms and data is being collected in computer databases like NCBI and Ensembl. The computer analysis and comparison of genes within and between different species is called bioinformatics, and links genetic mutations on an evolutionary scale.

Структура ДНК

Геном организма состоит из всего набора ДНК и отвечает за его генетические признаки, функции и развитие. Состав ДНК сам по себе является важнейшим компонентом в области молекулярной генетики, поскольку он определяет, как ДНК способна хранить генетическую информацию, передавать её и представлять её в формате, который может быть прочитан и транслирован. ДНК представляет собой двухцепочечную молекулу, при этом каждая цепь ориентирована антипараллельно. Нуклеотиды – это строительные блоки ДНК, каждый из которых состоит из молекулы сахара, фосфатной группы и одного из четырех азотистых оснований: аденина, гуанина, цитозина и тимина. Одна цепь ДНК удерживается вместе ковалентными связями, а две антипараллельные цепи – водородными связями между азотистыми основаниями. Аденин связывается с тимином, а цитозин – с гуанином. Именно эти четыре последовательности оснований формируют генетический код для всей биологической жизни и содержат информацию обо всех белках, которые организм способен синтезировать. Её уникальная структура позволяет ДНК хранить и передавать биологическую информацию из поколения в поколение во время клеточного деления. При клеточном делении клетки должны иметь возможность копировать свой геном и передавать его дочерним клеткам. Это возможно благодаря двухцепочечной структуре ДНК, поскольку одна цепь является комплементарной своей парной цепи, и, следовательно, каждая из этих цепей может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Именно поэтому процесс репликации ДНК известен как полуконсервативный процесс.

Генетика вперед

Форвардная генетика – это метод молекулярной генетики, используемый для идентификации генов или генетических мутаций, вызывающих определенный фенотип. В генетическом скрининге случайные мутации индуцируются мутагенами (химическими веществами или излучением) или транспозонами, после чего организмы отбираются по наличию конкретного фенотипа. Часто, если желаемый фенотип трудно наблюдать, например, в бактериях или клеточных культурах, после мутагенеза проводится дополнительный отбор, основанный на использовании селективных маркеров. Клетки могут быть трансформированы геном, обеспечивающим устойчивость к антибиотикам, или геном, кодирующим флуоресцентный репортер, чтобы отобрать мутанты с нужным фенотипом из числа немутировавших клеток. Мутанты, проявляющие интересующий фенотип, изолируются, и может быть проведен тест на комплементацию для определения, обусловлен ли фенотип мутациями в одном или нескольких генах. Затем мутантные гены характеризуются как доминантные (приводящие к усилению функции), рецессивные (приводящие к потере функции) или эпистатические (мутантный ген маскирует фенотип другого гена). В заключение, местоположение и конкретная природа мутации определяются посредством секвенирования. Форвардная генетика – это непредвзятый подход, который часто приводит к неожиданным открытиям, но может быть дорогостоящим и трудоемким. Модельные организмы, такие как нематода Caenorhabditis elegans, плодовая мушка Drosophila melanogaster и рыба-зебра Danio rerio, успешно использовались для изучения фенотипов, возникающих в результате мутаций генов.

Обратная генетика

Обратная генетика – это совокупность методов молекулярной генетики, используемых для определения фенотипа, возникающего в результате намеренной мутации в гене, представляющем интерес. Фенотип используется для выведения функции немутировавшей версии гена. Мутации могут быть случайными или преднамеренными изменениями в гене, представляющем интерес. Мутации могут представлять собой миссенс-мутацию, вызванную заменой нуклеотида, добавление или делецию нуклеотида, индуцирующие мутацию со сдвигом рамки считывания, или полное добавление/удаление гена или его сегмента. Удаление конкретного гена приводит к созданию нокаута гена, при котором ген не экспрессируется и наблюдается потеря функции (например, нокаутные мыши). Миссенс-мутации могут вызывать полную потерю функции или частичную потерю функции, известную как нокдаун. Нокдаун также может быть достигнут с помощью интерференции РНК (РНК-интерференции). Альтернативно, гены могут быть введены в геном организма (также известные как трансгены) для создания нок-ина и получения усиления функции у хозяина. Хотя эти методы имеют некоторую внутреннюю предвзятость при установлении связи между фенотипом и определенной функцией, они значительно быстрее в плане производства, чем прямая генетика, поскольку ген, представляющий интерес, уже известен.

Молекулярные генетические инструменты

Молекулярная генетика – это научный подход, использующий фундаментальные принципы генетики для более глубокого понимания молекулярных механизмов заболеваний и биологических процессов в организмах. Ниже перечислены некоторые инструменты, которые исследователи широко применяют в этой области.

Микроспутники

Микроспутники или повторяющиеся однополые последовательности (SSRS) — это короткие повторяющиеся сегменты ДНК, состоящие из до 6 нуклеотидов в определенном участке генома, которые используются в качестве генетических маркеров. Исследователи могут анализировать эти микроспутники с помощью таких методов, как ДНК-дактилоскопия и установление отцовства, поскольку эти повторы крайне уникальны для отдельных людей и семей. Они также могут использоваться для построения генетических карт и изучения генетической связи с целью локализации гена или мутации, ответственной за определенный признак или заболевание. Микроспутники также применяются в популяционной генетике для изучения различий между группами.

Исследования ассоциации в масштабах генома

Геномные ассоциативные исследования (GWAS) – это метод, основанный на однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) для изучения генетических вариаций в популяциях, которые могут быть связаны с конкретным заболеванием. Проект «Геном человека» секвенировал весь геном человека, что сделало этот подход более доступным и экономически эффективным для исследователей. Для проведения GWAS исследователи используют две группы: одну группу пациентов, страдающих изучаемым заболеванием, и контрольную группу, не имеющую этого заболевания. Образцы ДНК получают от участников, после чего их геном определяют с помощью лабораторного оборудования и быстро анализируют для сравнения участников и выявления SNP, потенциально связанных с заболеванием. Этот метод позволяет исследователям точно определить гены и участки генома, представляющие интерес, для дальнейшего изучения с целью выявления причин заболевания.

Кариотипирование

Кариотипирование позволяет исследователям анализировать хромосомы во время метафазы митоза, когда они находятся в конденсированном состоянии. Хромосомы окрашиваются и рассматриваются под микроскопом для выявления хромосомных аномалий. Эта техника может быть использована для диагностики врожденных генетических заболеваний, таких как синдром Дауна, определения пола у эмбрионов и диагностики некоторых видов рака, вызванных хромосомными мутациями, например, транслокациями.

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия – это развивающаяся область науки, и исследователи способны использовать технологии молекулярной генетики для модификации ДНК организмов и создания генетически модифицированных и улучшенных организмов для промышленных, сельскохозяйственных и медицинских целей. Это достигается с помощью методов редактирования генома, которые могут включать изменение пар оснований в последовательности ДНК, а также добавление и удаление определенных участков ДНК.

Редактирование генов

Редактирование генов позволяет ученым изменять ДНК организма. Один из способов сделать это – технология CRISPR/Cas9, адаптированная из естественной иммунной системы бактерий, защищающей их геном. Эта технология использует белок Cas9, который позволяет ученым точно разрезать цепи ДНК в заданном месте, а также специализированную направляющую РНК для обеспечения разреза в нужной точке генома. Затем ученые используют механизмы восстановления ДНК, чтобы внести изменения в геном; эта технология имеет широкие перспективы в лечении заболеваний.

Персонализированная медицина

Молекулярная генетика имеет широкое значение для прогресса в медицине, а понимание молекулярных основ заболевания открывает возможности для более эффективной диагностики и терапии. Одной из целей этой области является персонализированная медицина, при которой генетика конкретного человека может помочь определить причину болезни и подобрать наиболее эффективное лечение, а также разработать более индивидуальные подходы к терапии, которые могут быть более результативными. Например, определенные генетические вариации могут повышать восприимчивость человека к конкретному препарату, в то время как другие могут увеличивать риск нежелательных реакций на лечение. Таким образом, эта информация позволит исследователям и клиницистам принимать наиболее обоснованные решения об эффективности лечения для каждого пациента, отказавшись от стандартного метода проб и ошибок.

Судебная генетика

Судебная генетика играет важнейшую роль в уголовных расследованиях благодаря использованию различных молекулярно-генетических методов. Одним из распространенных методов является ДНК-дактилоскопия, которая выполняется с использованием комбинации молекулярно-генетических методов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и гель-электрофорез. ПЦР – это метод, позволяющий амплифицировать (увеличить количество копий) целевой последовательности ДНК, то есть даже незначительное количество ДНК с места преступления может быть извлечено и многократно реплицировано для получения достаточного количества материала для анализа. Гель-электрофорез позволяет разделить последовательности ДНК по размеру, а полученный рисунок, известный как ДНК-дактилоскопия, уникален для каждого человека. Эта комбинация молекулярно-генетических методов позволяет извлекать, амплифицировать, анализировать и сравнивать последовательности ДНК с другими и является стандартной методикой, используемой в криминалистике.