Введение

Повторяющиеся последовательности ДНК из 2–13 пар оснований, последовательность ДНК.

Микроспутник – это участок повторяющейся ДНК, в котором повторяются определенные ДНК-мотивы (длиной от одного до шести и более пар оснований), как правило, от 5 до 50 раз. Микроспутники встречаются в тысячах мест в геноме организма. Они имеют более высокую скорость мутаций, чем другие участки ДНК.

Микроспутники и их более крупные аналоги, миниспутники, вместе классифицируются как ДНК с переменным числом тандемных повторов (VNTR). Название "спутниковая ДНК" происходит от раннего наблюдения, что центрифугирование геномной ДНК в пробирке разделяет заметный слой основной ДНК от сопутствующих "спутниковых" слоев повторяющейся ДНК. Они широко используются для ДНК-профилирования в диагностике рака, в анализе родства (особенно в установлении отцовства) и в криминалистической идентификации. Они также применяются в генетическом анализе сцепления для локализации гена или мутации, ответственной за определенный признак или заболевание. Микроспутники также используются в популяционной генетике для измерения степени родства между подвидами, группами и отдельными особями.

История

Хотя первый микроспутник был охарактеризован в 1984 году в Лестерском университете Уэллером, Джеффрисом и коллегами как полиморфное повторение GGAT в гене миоглобина человека, термин "микроспутник" был введен позже, в 1989 году, Литтом и Люти. Человеческий геном, например, содержит 50 000–100 000 динуклеотидных микроспутников и меньшее количество три-, тетра- и пентануклеотидных микроспутников. Многие из них расположены в некодирующих частях генома человека и, следовательно, не кодируют белки, но они также могут находиться в регуляторных и кодирующих областях. Микроспутники в некодирующих регионах могут не выполнять какой-либо специфической функции и, следовательно, не подвергаются отбору; это позволяет им беспрепятственно накапливать мутации из поколения в поколение, что приводит к изменчивости, которую можно использовать для ДНК-идентификации и установления личности. Другие микроспутники расположены во фланкирующих или интронных регуляторных областях генов или непосредственно в кодонах генов – мутации микроспутников в таких случаях могут приводить к фенотипическим изменениям и заболеваниям, особенно при заболеваниях, связанных с расширением триплетных повторов, таких как синдром хрупкой Х-хромосомы и болезнь Гентингтона. Теломеры состоят из повторяющейся ДНК, с гексануклеотидным повторяющимся мотивом TTAGGG у позвоночных. Таким образом, они классифицируются как миниспутники. Аналогично, у насекомых в теломерах имеются более короткие повторяющиеся мотивы, которые можно рассматривать как микроспутники.

Механизмы мутации и скорость мутации

В отличие от точечных мутаций, которые затрагивают только один нуклеотид, микроспутниковые мутации приводят к увеличению или потере целой единицы повтора, а иногда и двух или более повторов одновременно. Таким образом, скорость мутаций в микроспутниковых локусах, как ожидается, будет отличаться от других скоростей мутаций, таких как скорость замещения оснований. Скорость мутаций в микроспутниковых локусах зависит от последовательности повторяющегося мотива, числа повторяющихся мотивов и чистоты канонической повторяющейся последовательности. Различные механизмы мутаций микроспутниковых локусов были рассмотрены, и их результирующая полиморфная природа была количественно оценена. Фактическая причина мутаций в микроспутниках остается предметом дискуссий. Одной из предложенных причин таких изменений длины является скольжение репликации, вызванное неспариванием оснований между цепями ДНК во время репликации в мейозе. ДНК-полимераза, фермент, ответственный за считывание ДНК во время репликации, может соскальзывать, перемещаясь вдоль матричной цепи и продолжая синтез с неправильного нуклеотида. Скольжение ДНК-полимеразы более вероятно при репликации повторяющихся последовательностей (например, CGCGCG). Поскольку микроспутники состоят из таких повторяющихся последовательностей, ДНК-полимераза может допускать ошибки с более высокой частотой в этих участках последовательности. Ряд исследований предоставили доказательства того, что скольжение является причиной микроспутниковых мутаций. Как правило, скольжение в каждом микроспутнике происходит примерно раз в 1000 поколений. Таким образом, изменения в повторяющейся ДНК встречаются на три порядка чаще, чем точечные мутации в других частях генома. В большинстве случаев скольжение приводит к изменению всего лишь одной единицы повтора, а скорость скольжения варьируется в зависимости от длины аллелей и размера единицы повтора, а также у разных видов. Если существует значительная разница в размерах между отдельными аллелями, это может привести к повышенной нестабильности во время рекомбинации в мейозе.

Микроспутниковые мутации

Прямые оценки частот мутаций микросателлитов были получены для множества организмов, от насекомых до человека. У пустынной саранчи Schistocerca gregaria частота мутаций микросателлитов была оценена в 2,1 × 10−4 на поколение на локус. Частота мутаций микросателлитов в мужских половых клетках человека в пять-шесть раз выше, чем в женских половых клетках, и варьируется от 0 до 7 × 10−3 на локус на гамету в поколение. Частоты мутаций микросателлитов зависят от положения основания относительно микросателлита, типа повтора и идентичности основания, особенно при значительной разнице в длине между аллелями. Вероятно, это связано с гомологичными хромосомами разной длины плеч, вызывающими нестабильность во время мейоза.

Биологические эффекты микроспутниковых мутаций

Многие микроспутники расположены в некодирующей ДНК и биологически неактивны. Другие находятся в регуляторной или даже кодирующей ДНК – мутации микроспутников в таких случаях могут приводить к фенотипическим изменениям и заболеваниям. По оценкам полногеномного исследования, вариация микроспутников вносит вклад в 10–15% вариабельности наследственной экспрессии генов у человека. Большинство коротких повторяющихся последовательностей в белкокодирующих участках генома имеют повторяющуюся единицу из трех нуклеотидов, поскольку такая длина не вызывает сдвига рамки считывания при мутации. Каждая тринуклеотидная повторяющаяся последовательность транскрибируется в повторяющуюся серию одной и той же аминокислоты. У дрожжей наиболее часто встречающимися повторяющимися аминокислотами являются глутамин, глутаминовая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота и серин. Мутации в этих повторяющихся сегментах могут влиять на физические и химические свойства белков, потенциально вызывая постепенные и предсказуемые изменения в их функции. Например, изменения длины тандемных повторов в гене Runx2 приводят к различиям в длине морды у домашних собак (Canis familiaris), при этом более длинные последовательности связаны с более длинной мордой. Эта связь также наблюдается у более широкого круга видов отряда хищных. Изменения длины полиаланиновых трактов в гене HOXA13 связаны с синдромом рук-ног-гениталий, нарушением развития у человека. Изменения длины других триплетных повторов связаны с более чем 40 неврологическими заболеваниями у человека, в частности, с тринуклеотидными повторными заболеваниями, такими как синдром ломкой Х-хромосомы и болезнь Гентингтона. Эволюционные изменения, вызванные проскальзыванием репликации, также происходят в более простых организмах. Например, изменения длины микроспутников часто встречаются в поверхностных мембранных белках дрожжей, обеспечивая быструю эволюцию клеточных свойств. В частности, изменения длины в гене FLO1 контролируют степень адгезии к субстратам. Короткие повторяющиеся последовательности также обеспечивают быструю эволюционную изменчивость поверхностных белков у патогенных бактерий, что может позволить им адаптироваться к иммунологическим изменениям у хозяев. Изменения длины коротких повторяющихся последовательностей у гриба (Neurospora crassa) регулируют продолжительность циклов циркадных ритмов.

Влияние на регуляцию генов

Изменения длины микроспутников в промоторах и других цис-регуляторных областях могут быстро изменять экспрессию генов из поколения в поколение. Геном человека содержит множество (>16 000) коротких повторов последовательностей в регуляторных областях, которые служат "регуляторами" экспрессии многих генов. Изменения длины бактериальных SSR могут влиять на формирование фимбрий у Haemophilus influenzae, изменяя расстояние между промоторами. При саркоме Юинга (вид болезненного рака костей у молодых людей) точечная мутация привела к образованию удлиненного микроспутника GGAA, который связывает транскрипционный фактор, который, в свою очередь, активирует ген EGR2, стимулирующий развитие рака. Кроме того, другие микроспутники GGAA могут влиять на экспрессию генов, определяющих клинические результаты у пациентов с саркомой Юинга.

Влияние внутри интронов

Микроспутники внутри интронов также влияют на фенотип, посредством механизмов, которые в настоящее время не изучены. Например, расширение триплетного повтора GAA в первом интроне гена X25, по-видимому, нарушает транскрипцию и вызывает атаксию Фридрейха. Тандемные повторы в первом интроне гена аспарагиносинтетазы связаны с острым лимфобластным лейкозом. Повторный полиморфизм в четвертом интроне гена NOS3 ассоциирован с гипертонией в тунисской популяции. Укорочение длины повторов в гене EGFR связано с остеосаркомами. Архаичная форма сплайсинга, сохранившаяся у данио рерио (рыб-зебр), использует микроспутниковые последовательности внутри интронной мРНК для удаления интронов в отсутствие U2AF2 и других компонентов сплайсингового аппарата. Предполагается, что эти последовательности формируют высокостабильные клеверлистообразные структуры, которые сближают 3'- и 5'-сайты сплайсинга интрона, эффективно заменяя сплайсосому. Считается, что этот способ сплайсинга РНК отделился от эволюции человека на этапе формирования тетрапод и представляет собой пережиток мира РНК.

Влияние на транспозионы

Почти 50% генома человека составляют различные типы транспозируемых элементов (также называемые транспозонами или «прыгающими генами»), и многие из них содержат повторяющиеся последовательности ДНК. Вероятно, короткие повторы последовательностей в этих участках также вовлечены в регуляцию экспрессии генов.

Приложения

Микроспутники используются для оценки делеций ДНК в хромосомах при диагностике рака. Микроспутники широко применяются для профилирования ДНК, также известного как "генетический отпечаток", при анализе следов с мест преступлений (в криминалистике) и тканей (у пациентов после трансплантации). Они также широко используются в анализе родственных связей, в частности, при установлении отцовства. Кроме того, микроспутники применяются для картирования генома, особенно в анализе генетической связи для локализации гена или мутации, ответственных за определенный признак или заболевание. В качестве частного случая картирования они могут использоваться для изучения дупликаций или делеций генов. Исследователи используют микроспутники в популяционной генетике и проектах по сохранению видов. Специалисты в области генетики растений предложили использовать микроспутники для отбора по маркерам желаемых признаков в селекции растений.

Диагноз рака

В опухолевых клетках, где нарушены механизмы контроля репликации, микроспутники могут приобретать или терять с особенно высокой частотой при каждом делении митоза. Следовательно, клеточная линия опухоли может демонстрировать генетический профиль, отличный от профиля ткани организма, и, особенно при колоректальном раке, может наблюдаться потеря гетерозиготности. Анализ микроспутников в первичной ткани поэтому регулярно используется в диагностике рака для оценки прогрессирования опухоли. Исследования полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) применялись для выявления микроспутниковых биомаркеров как источника генетической предрасположенности к различным видам рака.

Судебно-медицинские отпечатки пальцев

Микроспутниковый анализ получил широкое распространение в криминалистике в 1990-х годах. Микроспутники, используемые сегодня для криминалистического анализа, представляют собой тетра- или пентануклеотидные повторы, поскольку они обеспечивают высокую точность данных, будучи при этом достаточно короткими, чтобы выдерживать деградацию в неблагоприятных условиях. Еще более короткие повторные последовательности склонны к возникновению артефактов, таких как PCR-статтер и преимущественное амплифицирование, в то время как более длинные повторные последовательности сильнее подвержены деградации под воздействием окружающей среды и хуже амплифицируются методом ПЦР. Важным криминалистическим аспектом является соблюдение медицинской тайны, поэтому для криминалистических STR выбирают некодирующие участки, не влияющие на регуляцию генов, и, как правило, избегают тринуклеотидных STR, которые могут быть связаны с заболеваниями, вызванными расширением триплетных повторов, например, с болезнью Гентингтона. Криминалистические профили STR хранятся в базах данных ДНК, таких как Национальная база данных ДНК Великобритании (NDNAD), американская CODIS или австралийская NCIDD.

Анализ родства (тестирование отцовства)

Автосомные микроспутники широко используются для ДНК-профилирования при анализе родственных связей (наиболее часто – при установлении отцовства). Y-STR (микроспутники на Y-хромосоме), наследуемые по отцовской линии, часто применяются в генеалогическом ДНК-тестировании.

Анализ генетической связи

В 1990-х и в первые несколько лет этого тысячелетия микроспутники являлись основными генетическими маркерами для полногеномного сканирования с целью локализации генов, ответственных за определенный фенотип или заболевание, на основе анализа сегрегации признаков в нескольких поколениях исследуемой родословной. Несмотря на то, что развитие высокопроизводительных и экономически выгодных платформ для анализа однонуклеотидных полиморфизмов (СНП) ознаменовало наступление эры СНП в полногеномных исследованиях, микроспутники по-прежнему остаются высокоинформативными показателями геномной вариации для исследований генетической связи и ассоциаций. Их устойчивое преимущество обусловлено более высоким аллельным разнообразием по сравнению с биаллельными СНП, благодаря чему микроспутники способны различать аллели внутри блока линковидного дисбаланса, определенного СНП. Таким образом, с помощью микроспутников были успешно идентифицированы гены, связанные с диабетом 2 типа (TCF7L2) и раком предстательной железы (регион 8q21).

Генетика популяций

Микроспутники получили широкое распространение в популяционной генетике в 1990-х годах, поскольку с повсеместным внедрением ПЦР в лаборатории исследователи получили возможность разрабатывать праймеры и амплифицировать наборы микроспутников с низкой стоимостью. Область их применения весьма широка. Микроспутник с нейтральной эволюционной историей позволяет измерять или оценивать прохождение через "узкие места", локальную адаптацию, индекс фиксации аллелей (FST), численность популяции и генный поток. С удешевлением секвенирования нового поколения использование микроспутников сократилось, однако они по-прежнему остаются важным инструментом в этой области.

Растительная селекция

Маркерный отбор (MAS) – это косвенный процесс селекции, при котором признак, представляющий интерес, отбирается на основе маркера (морфологической, биохимической или ДНК/РНК-вариации), сцепленного с этим признаком (например, продуктивность, устойчивость к заболеваниям, устойчивость к стрессам и качество), а не на основе самого признака. Микросателлиты предложены для использования в качестве таких маркеров с целью содействия селекции растений.

Анализ

Повторяющаяся ДНК не поддается легкой аналитике методами секвенирования ДНК следующего поколения, так как некоторые технологии испытывают трудности с гомополимерными участками. Для анализа необработанных данных секвенирования ДНК следующего поколения разработаны различные программные подходы для определения генотипа и вариантов в повторяющихся локусах. Микроспутники можно анализировать и подтверждать с помощью стандартной амплификации ПЦР и определения размера ампликонов, иногда с последующим секвенированием ДНК по Сэнгеру. В криминалистике анализ проводится путем извлечения ядерной ДНК из клеток интересующего образца, а затем амплификации специфических полиморфных регионов извлеченной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции. После амплификации эти последовательности разделяют либо с помощью гелевого электрофореза, либо капиллярного электрофореза, что позволяет аналитику определить количество повторов в исследуемой последовательности микроспутника. Если ДНК разделялась гелевым электрофорезом, ее можно визуализировать с помощью протравливания серебром (низкая чувствительность, безопасно, недорого), интеркалирующего красителя, такого как бромид этидия (достаточно высокая чувствительность, умеренный риск для здоровья, недорого), или, как это делают в большинстве современных криминалистических лабораторий, флуоресцентных красителей (очень высокая чувствительность, безопасно, дорого). Приборы, предназначенные для разделения фрагментов микроспутников с помощью капиллярного электрофореза, также используют флуоресцентные красители, используя 10 локусов и маркер пола. Американцы увеличили это число до 13 локусов. Австралийская база данных называется NCIDD, и с 2013 года она использует 18 основных маркеров для ДНК-профилирования.

Усиление

Микроспутники могут быть амплифицированы для идентификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя уникальные последовательности фланкирующих областей в качестве праймеров. ДНК многократно денатурируется при высокой температуре для разделения двойной спирали, затем охлаждается для обеспечения гибридизации праймеров и удлинения нуклеотидных последовательностей через микроспутник. Этот процесс приводит к получению достаточного количества ДНК для визуализации на агарозных или полиакриламидных гелях; для амплификации требуется лишь небольшое количество ДНК, поскольку термоциклирование обеспечивает экспоненциальный рост реплицированного фрагмента. Благодаря широкой доступности технологии ПЦР, праймеры, фланкирующие микроспутниковые локусы, просты и удобны в использовании, однако разработка правильно работающих праймеров часто является трудоемким и затратным процессом.

Конструкция микроспутниковых праймеров

Если искать микроспутниковые маркеры в определенных областях генома, например, внутри конкретного интрона, праймеры можно разработать вручную. Это включает поиск микроспутниковых повторов в геномной последовательности ДНК, который можно проводить визуально или с помощью автоматизированных инструментов, таких как RepeatMasker. После определения потенциально полезных микроспутников, фланкирующие последовательности используются для разработки олигонуклеотидных праймеров, которые будут амплифицировать конкретный микроспутниковый повтор в ПЦР-реакции. Случайные микроспутниковые праймеры можно получить путем клонирования случайных фрагментов ДНК из целевого вида. Эти фрагменты вставляются в плазмидный или бактериофаговый вектор, который затем вводится в бактерии Escherichia coli. Выращиваются колонии и проводится их скрининг с помощью флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных последовательностей, которые гибридизуются с микроспутниковым повтором, если он присутствует в фрагменте ДНК. Если в результате этой процедуры удается получить положительные клоны, ДНК секвенируется, а ПЦР-праймеры выбираются из последовательностей, фланкирующих эти области, для определения конкретного локуса. Этот процесс требует значительных усилий и проб и ошибок со стороны исследователей, поскольку необходимо предсказывать последовательности микроспутниковых повторов, а случайно выделенные праймеры могут не проявлять существенного полиморфизма. Микроспутниковые локусы широко распространены по всему геному и могут быть выделены из полурасщепленной ДНК старых образцов, поскольку для амплификации с помощью ПЦР требуется лишь подходящий субстрат. Более современные методы включают использование олигонуклеотидных последовательностей, состоящих из повторов, комплементарных повторам в микроспутнике, для "обогащения" выделенной ДНК (микроспутниковое обогащение). Олигонуклеотидный зонд гибридизуется с повтором в микроспутнике, а затем комплекс зонд/микроспутник извлекается из раствора. Обогащенная ДНК затем клонируется обычным способом, но процент успешных клонов теперь будет значительно выше, что значительно сократит время, необходимое для разработки регионов для использования. Однако выбор подходящих зондов также может быть процессом проб и ошибок.

МИСР-ПКР

ISSR (для интерпростых повторов последовательностей) – общий термин для участка генома между микросателлитными локусами. В качестве праймеров для ПЦР используются комплементарные последовательности двух соседних микросателлитов; переменный участок между ними подвергается амплификации. Ограниченное количество циклов амплификации в ПЦР предотвращает избыточную репликацию слишком длинных непрерывных последовательностей ДНК, поэтому результатом является смесь различных амплифицированных фрагментов ДНК, которые обычно короткие, но значительно различаются по длине. Последовательности, амплифицированные с помощью ПЦР ISSR, могут использоваться для ДНК-дактилоскопии. Поскольку ISSR может представлять собой как консервативный, так и некорсервативный участок, этот метод не подходит для различения отдельных особей, а скорее для филогеографических исследований или, возможно, для определения границ видов; разнообразие последовательностей ниже, чем при ПЦР SSR, но все же выше, чем в самих последовательностях генов. Кроме того, секвенирование микросателлитов и секвенирование ISSR являются взаимодополняющими, поскольку одно используется для получения праймеров для другого.

Ограничения

Повторяющаяся ДНК сложно анализировать методами секвенирования ДНК следующего поколения, которые испытывают трудности с гомополимерными участками. Поэтому микроспутники обычно анализируют с помощью обычной ПЦР-амплификации и определения размера ампликона. Использование ПЦР означает, что анализ длины микроспутников подвержен ограничениям ПЦР, как и любой другой ПЦР-амплифицированный локус ДНК. Особую проблему представляет возникновение "нулевых аллелей": иногда, при анализе образцов индивидуумов, например, в делах об установлении отцовства, мутация в ДНК, фланкирующей микроспутник, может препятствовать связыванию ПЦР-праймера и образованию ампликона (создавая "нулевой аллель" при анализе в геле), в результате чего усиливается только один аллель (с немутированной сестринской хромосомы), и индивидуум может ложно казаться гомозиготным. Это может привести к путанице при расследовании дел об установлении отцовства. В таких случаях может потребоваться амплифицировать микроспутник с использованием другого набора праймеров. Нулевые аллели особенно часто вызываются мутациями в 3'-конце, где начинается удлинение. При анализе видов или популяций, например, в природоохранной работе, праймеры ПЦР, усиливающие микроспутники у одного индивидуума или вида, могут работать и у других видов. Однако риск использования ПЦР-праймеров для разных видов заключается в том, что нулевые аллели становятся более вероятными, когда расхождение последовательностей слишком велико для связывания праймеров. В этом случае виды могут искусственно казаться менее разнообразными. В таких случаях нулевые аллели иногда можно выявить по избыточной частоте гомозигот, вызывающей отклонения от ожиданий равновесия Харди-Вайнберга.