Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ENU, сондай-ақ N этил N нитрозурея (химиялық формуласы C3H7N3O2) деп те аталады, өте күшті мутаген болып табылады. Егешқұйрықтардағы белгілі бір ген үшін ENU әр 700 локустың бірінде 1 жаңа мутацияны тудыруы мүмкін. Ол жоғары дозада улы да. Бұл химиялық зат алкилдеуші агент, ол нуклеин қышқылындағы нуклеобазаларға (көбінесе тиминге) ENU-дың этил тобын беру арқылы әрекет етеді. Оның басты нысанасы – жетілген сперматозоидтардың пайда болатын сперматогониялық дің жасушалары.
ENU, also known as N ethyl N nitrosourea (chemical formula C3H7N3O2), is a highly potent mutagen. For a given gene in mice, ENU can induce 1 new mutation in every 700 loci. It is also toxic at high doses. The chemical is an alkylating agent, and acts by transferring the ethyl group of ENU to nucleobases (usually thymine) in nucleic acids. Its main targets are the spermatogonial stem cells, from which mature sperm are derived.
ЭНУ-ның мутаген ретінде ашылуының негізі
Билл Расселл (1951) генетикалық скринингтерде радиация және химиялық заттар сияқты мутагендерді тестілеу үшін пайдаланылатын, арнайы жасалған мысық штаммы – Т (тест) қоры арқылы егемендік құрған, мысық генетикасы саласындағы маңызды жетістікке қол жеткізді. Т қорындағы тышқандарда 7 рецессивті, тірі қалуға қабілетті және оңай танылатын белгілерге әсер ететін мутациялар бар. Оук-Ридж Ұлттық зертханасында Расселлдің бастапқы мақсаты – радиацияның әсерінен туындайтын мұрагерлік гендік мутациялардың деңгейін анықтау болды. Сондықтан ол Т қорындағы тышқандарды радиациямен локустар жиынтығының қаншалықты жиі мутацияға ұшырайтынын анықтау үшін пайдалануға шешім қабылдады. Т қорындағы тышқандардың мутациялары рецессивті болғандықтан, ұрпақтарында жабайы типтегі фенотип байқалады (мутантты [мысалы, s/s мутантты аталық] жабайы типтегі аналықпен [+/+] будандастыру нәтижесінде). Осылайша, 7 локустың бірінде радиациямен шақырылған мутацияны алып жүретін кез келген ұрпақ, алғашқы ұрпақта мутантты фенотипті көрсетеді. Бұл әдіс – нақты локустық тест (SLT) Расселлге кең ауқымды нақты мутацияларды зерттеуге және радиациямен шақырылған мутация деңгейін есептеуге мүмкіндік берді. SLT үшін радиацияның әсерін зерттеуден басқа, Расселл және әріптестері прокарбазин және этилнитрозурея сияқты химиялық мутагендердің SLT әсерін зерттеуге де қызығушылық танытты. Сол кезде прокарбазин – рентген сәулелеріне қарағанда үш есе аз болса да, SLT-де елеулі сперматогенездік мутагенезді тудыратын ең күшті химиялық мутаген болып саналды. Расселлдің диэтилнитрозаминді (DEN) қолданумен жасаған алғашқы мутагенез жұмыстары оларды SLT үшін DEN қолдануға итермеледі. Алайда, DEN мутагенді болу үшін ферменттік жолмен алкилдеуші затқа айналуы керек, ал сүтқоректілерде бұл ферменттік белсенділік жеткіліксіз болуы мүмкін. Бұл DEN қолданған тышқандардағы өте төмен мутация деңгейімен (60,179 ұрпақтан 3-еуі) көрсетілуі мүмкін. Бұл мәселені шешу үшін Экехарт Вегель Расселлге және әріптестеріне метаболизмді қажет етпейтін алкилдеуші агент – N этил N нитрозуреяны (ENU) қолдануды ұсынды. ENU (250 мг/кг) индукциялаған тышқандар 10 апта бойы стерильділік кезеңінен өтті. Сауыққаннан кейін 90 аталық Т қорына жататын аналықтармен будандастырылып, 7584 жас ұрпақ алынды. Бастапқы стерильділік кезеңінің мәселесін шешу үшін Расселл тобы ENU-дың бір үлкен дозасын инъекциялаудың орнына, апта сайынғы кестеде бөлінген дозаны (100 мг/кг) қолданудың жалпы дозаны (300-400 мг/кг) арттыруға мүмкіндік беретінін көрсетті. Бұл нүктелік мутацияларды тудырады, яғни зерттеуші қалаған фенотипті картаға түсіріп, фенотипке жауапты бір ғана кандидат генді анықтай алады. Нүктелік мутациялар шамамен 1-2 Мб (мега негіз жұп) аралығында болады және шамамен 1/700 гаметада кездеседі. Delta 1 – Notch рецепторының лигандысы. Delta 1 (Dll1lacZ/lacZ) функциясының гомозиготалық жоғалуы эмбриональды өлімге әкеледі. ENUмен емделген тышқандар Dll1lacZ гетерозиготаларымен будандастырылды. G1 ұрпағында 35 мутантты желі пайда болды, оның 7-сі Notch сигналды жолының модификаторларын көрсетті.
Bill Russell (1951) created a landmark in the field of mouse genetics by creating a specifically designed mouse strain, the T (test) stock that was used in genetic screens for testing mutagens such as radiations and chemicals. The T stock mouse harbors 7 recessive, viable mutations affecting easily recognizable traits. At the Oak Ridge National Laboratory, Russell's initial goal was to determine the rate of inheritable gene mutations in the germ line induced by radiations. Thus he decided to use T stock mice in order to define how often a set of loci could be mutated with radiations. Since the mutations in the T stock mouse were recessive, the progeny would have a wild type phenotype (as a result of crossing a mutant [e. g. s/s mutant male] to a wild type female [+/+]). Thus with any progeny carrying a mutation induced by radiation at one of the 7 loci, would exhibit the mutant phenotype in the first generation itself. This approach, the specific locus test (SLT) allowed Russell to study a wide range of specific mutations and to calculate the mutation rates induced by radiations. In addition to studying the effect of radiation for SLT, Russell et al. were also interested in studying the effect of chemical mutagens such as procarbazine and ethylnitrosourea for SLT. At that time, procarbazine was the most potent chemical mutagen known to cause a significant spermatogonial mutagenesis in an SLT, although at a rate one third of that of X rays. Russell's earlier mutagenesis work on Drosophila using diethylnitrosoamine (DEN) triggered them to use DEN for the SLT. However, DEN needs to be enzymatically converted into an alkylating agent in order to be mutagenic and probably this enzymatic activation was not sufficient in mammals. This could be illustrated by the extremely low mutation rate in mice given by DEN (3 in 60,179 offspring). To overcome this problem, a new mutagen, N ethyl N nitrosourea (ENU), an alkylating agent, which does not need to be metabolised, was suggested to be used by Ekkehart Vegel to Russell et al. The ENU (250 mg/kg) induced mice underwent a period of sterility for 10 weeks. After recovery, 90 males were crossed to the T stock females and 7584 pups were obtained. To overcome the problem of initial period of sterility, the Russell group showed that instead of injecting one large dose of ENU, a fractionated dose (100 mg/kg) on a weekly schedule permitted a total higher dose (300–400 mg/kg) However it is also shown to cause GC >AT transitions. It is known to induce point mutations, which implies that by mapping for the desired phenotype, the researcher can identify a single candidate gene responsible for the phenotype. The point mutations are at approximately 1 2 Mb (Mega base pair) interval and occur at an approximate rate of 1 per 700 gametes. Delta 1 is a ligand for the Notch receptor. A homozygous loss of function of Delta 1 (Dll1lacZ/lacZ) is embryonically lethal. ENU treated mice were crossed to Dll1lacZ heterozygotes. 35 mutant lines were generated in G1 of which 7 revealed modifiers of the Notch signaling pathway.
Сезімтал экрандар
Көптеген гендерге байланысты генетикалық аурулардың жағдайында, бірнеше гендегі мутациялар аурудың дамуына себеп болады. Дегенмен, осы гендердің тек біреуіндегі мутация фенотипке елеулі үлес қоспауы мүмкін. Мұндай "бейімділік гендерін" сезімталдығы арттырылған скрининг арқылы анықтауға болады. Осындай скринингте генетикалық немесе орталық фон өзгертіліп, тышқанды осы өзгерістерге сезімтал етуге тырысады. Мақсаты – бейімділік гендерін өзгертілген генетикалық немесе орталық фонда анықтау. Ринчик және авторлар тобы диабетикалық нефропатияға бейім тышқан мутанттарының сезімталдығын арттырылған скринингін жүргізді. Тышқандарға 1-ші типті қант диабетінің сезімталдығы арттырылған фонында ENU таңбалы зат енгізілді. Бұл диабетке шалдыққан тышқандарда инсулин 2 генінде (Ins2Akita) доминантты Акита мутациясы болды. Бұл тышқандарда альбуминурия дамыды, бұл диабетке шалдықпаған ұрпақтарда байқалмаған фенотип.
In the case of genetic diseases involving multiple genes, mutations in multiple genes contributes to the progression of a disease. Mutation in just one of these genes however, might not contribute significantly to any phenotype. Such "predisposing genes" can be identified using sensitized screens. In this type of a screen, the genetic or environmental background is modified so as to sensitize the mouse to these changes. The idea is that the predisposing genes can be unraveled on a modified genetic or environmental background. Rinchik et al. performed a sensitized screen of mouse mutants predisposed to Diabetic nephropathy. Mice were treated with ENU on a sensitized background of type 1 diabetes. These diabetic mice had a dominant Akita mutation in the insulin 2 gene (Ins2Akita). These mice developed albuminuria, a phenotype that was not observed in the non diabetic offsprings.
Тұрақтылық
Жалпы алғанда, ENU салыстырмалы түрде тұрақсыз, бұл оны EMS сияқты орташа тұрақты мутагендерге қарағанда, эксперименттік мутаген ретінде қолданғанда белсенділігін жоғалтуды жеңілдетеді. Таза кристалдық ENU жарық пен ылғалға сезімтал болғандықтан, оны салқын және құрғақ жағдайда сақтау керек, ал қажет болғанда ғана жаңадан ерітіндіге дайындау керек. Сулы ерітінділерде ENU негізді pH-та жылдам ыдырайды, ал протоколдар ENU ерітінділерін 0,1М KOH-тың тең көлемімен 24 сағат бойы, жарыққа ұшыратумен немесе ұшыратпастан, белсенділігін толық жою үшін инактивациялауды талап етеді.
Generally speaking, ENU is fairly unstable, which makes it easier to inactivate when used as an experimental mutagen, compared to moderately more stable mutagens like EMS. Pure crystalline ENU is sensitive to light and moisture, so should be stored at in cold and dry conditions, and freshly prepared into solutions when needed. In aqueous solutions, ENU rapidly degrades at a basic pH, and protocols call for inactivation of ENU solutions with an equal volume of 0.1M KOH for 24 hours, with or without ambient light exposure to supplement inactivation.