Этилнитрозомочевина (ENU): мутагенный агент и его применение в генетических исследованиях мышей.

Введение

ENU, также известный как N-этил-N-нитрозомочевина (химическая формула C3H7N3O2), является высокоэффективным мутагеном. Для конкретного гена у мышей ENU может вызывать 1 новую мутацию на каждые 700 локусов. Он также токсичен в высоких дозах. Это химическое вещество является алкилирующим агентом и действует, перенося этильную группу ENU на нуклеотидные основания (обычно тимин) в нуклеиновых кислотах. Его основными мишенями являются сперматогониевые стволовые клетки, из которых развиваются зрелые сперматозоиды.

Фон открытия ЭНУ как мутаген

Билл Расселл (1951) совершил прорыв в области генетики мышей, создав специально разработанный штамм мышей, T (тестовый) штамм, который использовался в генетических скринингах для тестирования мутагенов, таких как радиация и химические вещества. Мыши T-штамма несут 7 рецессивных, жизнеспособных мутаций, влияющих на легко определяемые признаки. В Национальной лаборатории Оук-Ридж первоначальной целью Расселла было определение скорости индуцированных радиацией наследственных мутаций генов в зародышевой линии. Поэтому он решил использовать мышей T-штамма для определения частоты мутаций в наборе локусов под воздействием радиации. Поскольку мутации в мышах T-штамма были рецессивными, потомство будет иметь фенотип дикого типа (в результате скрещивания мутантного самца [например, s/s] с самкой дикого типа [+/+]). Таким образом, любое потомство, несущее мутацию, индуцированную радиацией в одном из 7 локусов, проявит мутантный фенотип уже в первом поколении. Этот подход, специфический локусный тест (SLT), позволил Расселу изучить широкий спектр специфических мутаций и рассчитать частоту мутаций, вызванных радиацией. Помимо изучения влияния радиации в рамках SLT, Расселл и его коллеги также интересовались изучением влияния химических мутагенов, таких как прокарбазин и этилнитрозомочевина, с использованием SLT. В то время прокарбазин был самым мощным известным химическим мутагеном, вызывающим значительный мутагенез сперматогоний в SLT, хотя и со скоростью в одну треть от скорости рентгеновского излучения. Более ранняя работа Расселла по мутагенезу на дрозофиле с использованием диэтилнитрозамина (DEN) побудила его использовать DEN для SLT. Однако DEN необходимо ферментативно превратить в алкилирующий агент, чтобы он стал мутагенным, и, вероятно, эта ферментативная активация была недостаточной у млекопитающих. Это иллюстрируется крайне низкой частотой мутаций у мышей, обработанных DEN (3 из 60 179 потомков). Чтобы решить эту проблему, Эккехарт Вегель предложил Расселлу и его коллегам использовать новый мутаген, N-этил-N-нитрозомочевину (ENU), алкилирующий агент, не требующий метаболизма. Мыши, получившие 250 мг/кг ENU, испытывали 10-недельную стерильность. После восстановления 90 самцов были скрещены с самками T-штамма, и было получено 7584 детенышей. Чтобы преодолеть проблему начальной стерильности, группа Расселла показала, что вместо однократной инъекции большой дозы ENU, фракционированная доза (100 мг/кг) еженедельно позволяет ввести более высокую общую дозу (300–400 мг/кг). Однако также было показано, что она вызывает переходы GC > AT. Известно, что ENU индуцирует точечные мутации, что означает, что путем картирования желаемого фенотипа исследователь может идентифицировать один ген-кандидат, ответственный за этот фенотип. Точечные мутации возникают с интервалом примерно 1–2 Мб (мегабаза) и с частотой примерно 1 на 700 гамет. Дельта-1 является лигандом рецептора Notch. Гомозиготная потеря функции Дельта-1 (Dll1lacZ/lacZ) приводит к эмбриональной летальности. Мышей, обработанных ENU, скрестили с гетерозиготами Dll1lacZ. В G1 было получено 35 мутантных линий, из которых 7 выявили модификаторы пути передачи сигнала Notch.

Bill Russell (1951) created a landmark in the field of mouse genetics by creating a specifically designed mouse strain, the T (test) stock that was used in genetic screens for testing mutagens such as radiations and chemicals. The T stock mouse harbors 7 recessive, viable mutations affecting easily recognizable traits. At the Oak Ridge National Laboratory, Russell's initial goal was to determine the rate of inheritable gene mutations in the germ line induced by radiations. Thus he decided to use T stock mice in order to define how often a set of loci could be mutated with radiations. Since the mutations in the T stock mouse were recessive, the progeny would have a wild type phenotype (as a result of crossing a mutant [e. g. s/s mutant male] to a wild type female [+/+]). Thus with any progeny carrying a mutation induced by radiation at one of the 7 loci, would exhibit the mutant phenotype in the first generation itself. This approach, the specific locus test (SLT) allowed Russell to study a wide range of specific mutations and to calculate the mutation rates induced by radiations. In addition to studying the effect of radiation for SLT, Russell et al. were also interested in studying the effect of chemical mutagens such as procarbazine and ethylnitrosourea for SLT. At that time, procarbazine was the most potent chemical mutagen known to cause a significant spermatogonial mutagenesis in an SLT, although at a rate one third of that of X rays. Russell's earlier mutagenesis work on Drosophila using diethylnitrosoamine (DEN) triggered them to use DEN for the SLT. However, DEN needs to be enzymatically converted into an alkylating agent in order to be mutagenic and probably this enzymatic activation was not sufficient in mammals. This could be illustrated by the extremely low mutation rate in mice given by DEN (3 in 60,179 offspring). To overcome this problem, a new mutagen, N ethyl N nitrosourea (ENU), an alkylating agent, which does not need to be metabolised, was suggested to be used by Ekkehart Vegel to Russell et al. The ENU (250 mg/kg) induced mice underwent a period of sterility for 10 weeks. After recovery, 90 males were crossed to the T stock females and 7584 pups were obtained. To overcome the problem of initial period of sterility, the Russell group showed that instead of injecting one large dose of ENU, a fractionated dose (100 mg/kg) on a weekly schedule permitted a total higher dose (300–400 mg/kg) However it is also shown to cause GC >AT transitions. It is known to induce point mutations, which implies that by mapping for the desired phenotype, the researcher can identify a single candidate gene responsible for the phenotype. The point mutations are at approximately 1 2 Mb (Mega base pair) interval and occur at an approximate rate of 1 per 700 gametes. Delta 1 is a ligand for the Notch receptor. A homozygous loss of function of Delta 1 (Dll1lacZ/lacZ) is embryonically lethal. ENU treated mice were crossed to Dll1lacZ heterozygotes. 35 mutant lines were generated in G1 of which 7 revealed modifiers of the Notch signaling pathway.

Экраны с сенсибилизацией

В случае генетических заболеваний, связанных с несколькими генами, мутации в нескольких генах способствуют развитию заболевания. Однако мутация только в одном из этих генов может не оказывать существенного влияния на фенотип. Такие "гены предрасположенности" можно выявить с помощью сенсибилизированных скринингов. В этом типе скрининга генетический или экологический фон модифицируется для повышения чувствительности мышей к этим изменениям. Цель состоит в том, чтобы выявить гены предрасположенности на измененном генетическом или экологическом фоне. Ринчик и соавторы провели сенсибилизированный скрининг мышиных мутантов, предрасположенных к диабетической нефропатии. Мышей обрабатывали ЭНУ на сенсибилизированном фоне диабета 1 типа. У этих диабетических мышей была доминантная мутация Akita в гене инсулина 2 (Ins2Akita). У этих мышей развилась альбуминурия – фенотип, который не наблюдался у недиабетических потомков.

Стабильность

В целом, ENU достаточно нестабилен, что облегчает его инактивацию при использовании в качестве экспериментального мутагена по сравнению с умеренно более стабильными мутагенами, такими как EMS. Чистый кристаллический ENU чувствителен к свету и влаге, поэтому его следует хранить в холодных и сухих условиях и готовить растворы непосредственно перед использованием. В водных растворах ENU быстро разлагается в щелочной среде, и протоколы предписывают инактивацию растворов ENU равным объемом 0,1 М KOH в течение 24 часов, с или без воздействия окружающего света для усиления инактивации.