Аместің сынағы: Мутацияны анықтау әдісі

Кіріспе

Биологиялық сынақ әдісі – химиялық заттардың мутагенділік сынағы.

Аймс сынағы – бактерияларды пайдаланып, белгілі бір химиялық заттың сынақ организмінің ДНК-сында мутация тудыру мүмкіндігін тексеруге арналған кеңінен қолданылатын әдіс. Бұл химиялық қосылыстардың мутагендік потенциалын бағалауға мүмкіндік беретін биологиялық талдау. Оң нәтиже химиялық заттың мутагенді екенін және, демек, канцерогендік әсер ете алуы мүмкін екенін көрсетеді, өйткені қатерлі ісіктер көбінесе мутациямен байланысты. Бұл сынақ – қосылыстың канцерогендік потенциалын бағалаудың жылдам және ыңғайлы тәсілі, себебі егешқұйрықтар мен тышқандардағы стандартты канцерогендік сынақтар көп уақыт алады (оларды аяқтауға екі-үш жыл кетеді) және қымбатқа түседі. Алайда, жалған оң және жалған теріс нәтижелер болуы мүмкін. Бұл процедураны 1970 жылдардың басында Берклидегі Калифорния университетінде Брюс Эймс және оның тобы бірнеше мақаласында сипаттаған. Сынақ штаммдары липополисахаридтер синтезіне жауапты гендерде мутацияларды алып жүреді, бұл бактериялардың жасуша қабырғасын көбірек өткізгіш етеді, сондай-ақ сынақтың сезімталдығын арттыру үшін экзизиялық жөндеу жүйесінде де мутациялар болады. Адамдар сияқты ірі организмдерде химиялық затты мутагенді емес деп есептелетін жағдайда мутагендіге айналдыратын, немесе керісінше, мутагенді затты мутагенді емес ете алатын метаболикалық процестер бар. Сондықтан, химиялық қосылыстың ірі организмдерге қатысты мутагенділігін тиімдірек тексеру үшін, Ames сынағында метаболикалық процестердің әсерін имитациялау мақсатында егешқұйрық бауыр ферменттерін қосуға болады. Кейбір қосылыстар, мысалы, бензо[а]пирен, өздері мутагенді емес, бірақ олардың метаболикалық өнімдері мутагенді болып келеді, сондықтан метаболизмнің әсерін модельдеу үшін егешқұйрық бауыр экстрактысы қосымша қолданылады. Бактериялар гистидиннің шағын мөлшері бар агар табағына таратылады. Өсу ортасындағы гистидиннің шағын мөлшері бактерияларға бастапқыда өсуге және мутацияға ұшырау мүмкіндігін береді. Гистидиннің толық жетіспеуіне байланысты, тек өздігінен гистидин өндіре алатын бактериялар ғана тірі қалады. Табақ 48 сағат бойы инкубацияланады. Заттың мутагенділігі байқалатын колониялар санына пропорционалды.

The Ames test is a widely employed method that uses bacteria to test whether a given chemical can cause mutations in the DNA of the test organism. More formally, it is a biological assay to assess the mutagenic potential of chemical compounds. A positive test indicates that the chemical is mutagenic and therefore may act as a carcinogen, because cancer is often linked to mutation. The test serves as a quick and convenient assay to estimate the carcinogenic potential of a compound because standard carcinogen assays on mice and rats are time consuming (taking two to three years to complete) and expensive. However, false positives and false negatives are known. The procedure was described in a series of papers in the early 1970s by Bruce Ames and his group at the University of California, Berkeley. The tester strains also carry mutations in the genes responsible for lipopolysaccharide synthesis, making the cell wall of the bacteria more permeable, and in the excision repair system to make the test more sensitive. Larger organisms like mammals have metabolic processes that could potentially turn a chemical considered not mutagenic into one that is or one that is considered mutagenic into one that is not. Therefore, to more effectively test a chemical compound's mutagenicity in relation to larger organisms, rat liver enzymes can be added in an attempt to replicate the metabolic processes' effect on the compound being tested in the Ames Test. Rat liver extract is optionally added to simulate the effect of metabolism, as some compounds, like benzo[a]pyrene, are not mutagenic themselves but their metabolic products are. The bacteria are spread on an agar plate with small amount of histidine. This small amount of histidine in the growth medium allows the bacteria to grow for an initial time and have the opportunity to mutate. When the histidine is depleted only bacteria that have mutated to gain the ability to produce its own histidine will survive. The plate is incubated for 48 hours. The mutagenicity of a substance is proportional to the number of colonies observed.

Аймс сынағы және канцерогендер

Аймс тесті арқылы анықталған мутагендер де канцероген болуы мүмкін, ал Аймстың алғашқы зерттеулері белгілі канцерогендердің 90%-ын осы тест арқылы анықтауға болатындығын көрсетті. Бірақ кейінгі зерттеулер белгілі канцерогендердің 50–70%-ы анықталғанын көрсетті. Бұл тест бұрын коммерциялық өнімдерде қолданылған бірқатар қосылыстарды потенциалды канцерогендер ретінде анықтау үшін пайдаланылды. Мысалы, трис(2,3-дибромопропил)фосфат, ол балалардың ұйқы киімдері сияқты пластик және маталарда отты баяулатушы ретінде қолданылды, және фурилфурамид, ол 1960 және 1970 жылдары Жапонияда тағамдық өнімдерде антибактериялық қоспа ретінде қолданылды. Фурилфурамид бұрын жануарлар үстіндегі сынақтардан өткен, бірақ Аймс тестінде анықталғаннан кейін жүргізілген қатаң сынақтар оның канцерогендік екенін көрсетті. Осы сынақтардың оң нәтижелері осы химиялық заттардың тұтыну өнімдерінде қолданылуын тоқтатуға әкелді. Аймс тестінің бір қызықты нәтижесі – химиялық заттың әртүрлі концентрацияларын қолдана отырып жасалған доза-жауап қисызы көбінесе сызықтық болады. Дегенмен, кейбір ғалымдар организмдердің ДНК жөндеуі сияқты қорғаныш механизмдерінің арқасында мутагендердің төмен деңгейлеріне төзімді болуы мүмкін екенін, сондықтан кейбір химиялық мутагендер үшін шекті деңгей болуы мүмкін деп санайды. Брюс Эймс өзі жануарлар жүйесіндегі канцерогенез сынақтарында қолданылатын жоғары дозадан химиялық заттардың адамдарда әдетте кездесетін төмен дозасына сызықтық доза-жауап экстраполяциясына қарсы шықты, себебі нәтижелер мұндай сынақтарда қолданылатын химиялық заттардың жасанды түрде жоғары дозасынан туындаған митогендік жауаптан қате оң нәтижелер болуы мүмкін. Сондай-ақ ол "қандай да бір дененің ісік тудыруы мүмкін немесе мүмкін емес кішкентай химиялық іздеріне байланысты туындайтын "гистерияға" қарсы ескертіп, бұл "неге назар аудару керек екенін білуіңіз керек негізгі тәуекелдерді толығымен ығыстырып тастайды" деді. Аймс тесті көбінесе потенциалдық дәрілерді алғашқы скринингтен өткізу үшін, мүмкін канцерогендерді анықтау үшін қолданылады, және ол АҚШ-тың Пестицидтер заңында талап етілетін сегіз сынақтың бірі, сондай-ақ АҚШ-тың Улы заттарды бақылау заңында талап етілетін алты сынақтың бірі болып табылады.

Шектеулер

Salmonella typhimurium прокариота болып табылады, сондықтан ол адамдар үшін толыққанды үлгі емес. Емшекжануарлардың метаболизміне ұқсас жағдайларды жасау үшін, бауыр жүйесіндегі бастапқы молекуладан түзілген метаболиттердің мутагендік әлеуетін бағалау мақсатында, егеуқұйрықтың S9 бауыр фракциясы қолданылады; алайда, адам мен егеуқұйрықтың метаболизмі арасындағы айырмашылықтар сыналып жатқан химиялық заттардың мутагенділігіне әсер етуі мүмкін. Сондықтан, адам бауырының S9 фракциясын пайдалану арқылы сынақты жақсартуға болады; бұрын оның қолжетімділігімен шектелгенімен, қазір ол коммерциялық түрде қолжетімді және осылайша тиімдірек болуы мүмкін. Эукариоттық жасушалар үшін, мысалы, ашытқы үшін бейімделген in vitro модель жасалды. Ames сынағында анықталған мутагендер міндетті түрде канцерогенді болуы керек емес, сондықтан сынақта анықталған кез келген потенциалды канцероген үшін қосымша сынақтар қажет. Нитрат тобын қамтитын дәрілер, шындығында қауіпсіз болса да, кейде Ames сынағында оң нәтиже береді. Нитрат қосылыстары маңызды сигналдық молекула – азот оксидін бөліп шығаруы мүмкін, бұл жалған оң нәтижеге әкелуі мүмкін. Нитроглицерин – Ames сынағында оң нәтиже беретін, бірақ қазір де емдеуде қолданылатын мысал. Алайда, тағамдағы нитраттар бактериялардың әрекетінен нитриттерге дейін тотығып, аминдер мен амидтермен реакцияласып канцерогендерді тудыруы мүмкін. Мұндай қосылыстармен жүргізілген Ames сынағының оң нәтижелерін жоққа шығару үшін ұзақ мерзімді токсикологиялық зерттеулер мен нәтижелерді бағалау қажет.

Сәйкестену әдісі

Амес сынағы бастапқыда жоғарыда сипатталғандай, агар пластиналарын (пластиналарды қосу әдісі) қолдану арқылы жасалды. Одан бері "флюктуация әдісі" деп аталатын Амес сынағын орындаудың баламасы әзірленді. Бұл әдіс агарға негізделген әдіспен ұқсас, бактериялар реакциялық қоспаға гистидиннің шағын мөлшерімен қосады, бұл бактериялардың өсуіне және мутациялауына мүмкіндік береді, олар өз гистидинін синтездеуге қайта оралады. pH индикаторын қосу арқылы, мутация жиілігі микропластиналардағы түсі өзгерген ұңғымалардың саны ретінде есептеледі (көбейіп жатқан бактериялардың метаболикалық процестерінен pH төмендеуіне байланысты). Дәстүрлі Амес сынағы сияқты, заттың генотоксикалық әсерін анықтау үшін сынама кері мутацияның табиғи деңгейімен салыстырылады. Флюктуация әдісі толығымен сұйық ортада жүргізіледі және нәтижелері 96 немесе 384 ұңғымалы микропластиналардағы түсі қызғылттан сарыға өзгерген ұңғымалардың санын санау арқылы бағаланады. 96 ұңғымалы пластинка әдісінде мутация жиілігі 96 ұңғыманың ішінде түсі өзгерген ұңғымалардың саны ретінде есептеледі. Пластиналарға дейін бес күнге дейін инкубация жасалады, мутацияланған (сары) колониялар күн сайын саналады және сынаманың кері мутация деңгейімен салыстырылады, маңызды айырмашылықтарды анықтау үшін белгіленген маңыздылық кестелері қолданылады. 384 ұңғымалы пластинкадағы микрофлюктуация әдісінде мутация жиілігі 2 күн инкубациядан кейін түсі өзгерген 48 ұңғыманың саны ретінде есептеледі. Сынама 6 доза деңгейінде, сондай-ақ нөлдік доза (фон) және оң бақылаулармен бірге 384 ұңғымалық пластинкаға сыйымды. Статистикалық сенімділікті қамтамасыз ету үшін талдау үш рет қайталанады. Қолданылатын штамдар ЭЫДҰ 471 нұсқаулығында ұсынылған тестілеу штаммдары (гистидинге және триптофанға тәуелді штамдар). Флюктуация әдісі сезімталдық және дәлдік тұрғысынан дәстүрлі құю әдісімен салыстыруға болады, бірақ бірнеше артықшылықтары бар: оған сынаманың аз мөлшері қажет, қарапайым колориметриялық нәтижесі бар, 96 немесе 48 ұңғыманың ішіндегі оң ұңғымалардың санын санау агар пластинасындағы жеке колонияларды санауға қарағанда аз уақыт алады. Көптеген коммерциялық жиынтықтар қол жетімді. Көптеген жиынтықтарда пайдалануға дайын тұтыну материалдары бар, соның ішінде лиофилденген бактериялар, сынақтарды көп арналы пипеткалармен орындауға болады. Флюктуация әдісі сулы сынамалардың жоғары көлемін (75% v/v дейін) сынауға мүмкіндік береді, сезімталдығын арттырады және оны қоршаған ортаның төмен деңгейдегі мутагендерін анықтау үшін қолдануға кеңейтеді.

The Ames test was initially developed using agar plates (the plate incorporation technique), as described above. Since that time, an alternative to performing the Ames test has been developed, which is known as the "fluctuation method". This technique is the same in concept as the agar based method, with bacteria being added to a reaction mixture with a small amount of histidine, which allows the bacteria to grow and mutate, returning to synthesize their own histidine. By including a pH indicator, the frequency of mutation is counted in microplates as the number of wells which have changed color (caused by a drop in pH due to metabolic processes of reproducing bacteria). As with the traditional Ames test, the sample is compared to the natural background rate of reverse mutation in order to establish the genotoxicity of a substance. The fluctuation method is performed entirely in liquid culture and is scored by counting the number of wells that turn yellow from purple in 96 well or 384 well microplates. In the 96 well plate method the frequency of mutation is counted as the number of wells out of 96 which have changed color. The plates are incubated for up to five days, with mutated (yellow) colonies being counted each day and compared to the background rate of reverse mutation using established tables of significance to determine the significant differences between the background rate of mutation and that for the tested samples. In the more scaled down 384 well plate microfluctuation method the frequency of mutation is counted as the number of wells out of 48 which have changed color after 2 days of incubation. A test sample is assayed across 6 dose levels with concurrent zero dose (background) and positive controls which all fit into one 384 well plate. The assay is performed in triplicates to provide statistical robustness. It uses the recommended OECD Guideline 471 tester strains (histidine auxotrophs and tryptophan auxotrophs). The fluctuation method is comparable to the traditional pour plate method in terms of sensitivity and accuracy, however, it does have a number of advantages: it needs less test sample, it has a simple colorimetric endpoint, counting the number of positive wells out of possible 96 or 48 wells is much less time consuming than counting individual colonies on an agar plate. Several commercial kits are available. Most kits have consumable components in a ready to use state, including lyophilized bacteria, and tests can be performed using multichannel pipettes. The fluctuation method also allows for testing higher volumes of aqueous samples (up to 75% v/v), increasing the sensitivity and extending its application to low level environmental mutagens.