Иммуностаинды біохимиялық техника: антиденелерді қолданып, нақтылы ақуызды анықтау. Гистология, клеткалық биологияда қолданылады. IHC, иммунофлуоресценция және т.б.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Биохимиялық техника
Biochemical technique
Биохимияда иммунотақылау – үлгідегі белгілі бір белокты анықтау үшін антиденеге негізделген кез келген әдіс. "Иммунотақылау" термині бастапқыда 1941 жылы Альберт Кунс алғаш сипаттаған тіндік кесімдердің иммуногистохимиялық боялуын білдірген. Дегенмен, иммунотақылау қазір гистология, жасуша биологиясы және молекулалық биология салаларында қолданылатын, антиденеге негізделген бояу әдістерін пайдаланатын кең ауқымды техникаларды қамтиды.
In biochemistry, immunostaining is any use of an antibody based method to detect a specific protein in a sample. The term "immunostaining" was originally used to refer to the immunohistochemical staining of tissue sections, as first described by Albert Coons in 1941. However, immunostaining now encompasses a broad range of techniques used in histology, cell biology, and molecular biology that use antibody based staining methods.
Иммуногистохимиялық
Иммуногистохимия немесе тіндік кесінділерді IHC бояу (немесе иммуноцитохимия, яғни жасушаларды бояу) – иммунобойаудың ең көп қолданылатын әдісі болып табылады. IHC бояудың алғашқы жағдайларында флуоресцентті бояулар қолданылса (иммунофлуоресценцияны қараңыз), қазір пероксидаза (иммунопероксидаза бояуды қараңыз) және сілтілік фосфатаза сияқты ферменттерді пайдаланатын флуоресцентті емес әдістер қолданылады. Бұл ферменттер реакцияларды катализдейді, нәтижесінде жарық микроскопиясымен оңай анықталатын түсті өнім пайда болады. Балама ретінде, радиоактивті элементтерді маркер ретінде қолдануға болады, ал иммунореакцияны авторадиография арқылы визуализациялауға болады. Жасуша морфологиясы мен тіндердің құрылымын сақтау үшін тінді дайындау немесе бекіту маңызды. Тиісті емес немесе ұзаққа созылған бекіту антиденелердің байланысу қабілетін айтарлықтай төмендетуі мүмкін. Формалинмен бекітілген парафинге сіңген тіндік кесінділерде көптеген антигендерді сәтті көрсетуге болады. Дегенмен, кейбір антигендер альдегидтің тіпті орташа мөлшерде бекітілуінен де зардап шегеді. Мұндай жағдайларда тіндерді сұйық азотта жылдам мұздатып, криостатпен кесу керек. Мұздатылған кесінділердің кемшіліктеріне нашар морфология, жоғары ұлғаюда нашар ажыратымдылық, парафинмен кесудің қиындығы және мұздатылған сақтау қажеттілігі жатады. Балама ретінде, вибратомдық кесінділерге тінді органикалық еріткіштермен немесе жоғары температурамен өңдеу қажет болмайды, бұл антигендікті жоюға немесе мұздату-еріту кезінде бұзуға әкелуі мүмкін. Вибратомдық кесінділердің кемшілігі – кесу процесі жұмсақ және нашар бекітілген тіндерде баяу және қиын, сондай-ақ кесінділерде жиі шабық белгілері немесе вибратомдық сызықтар байқалады. Көптеген антигендерді анықтауды антигенді қайтару әдістері арқылы айтарлықтай жақсартуға болады, олар бекіту кезінде пайда болатын белоктық байланыстардың бір бөлігін бұзу арқылы жасырын антигендік ошақтарды ашады. Бұл әртүрлі уақыт аралығында қыздыру арқылы (жылумен шақырылған эпитоптық алу немесе HIER) немесе ферменттік қорытуды қолдану арқылы (протеолитикалық шақырылған эпитоптық алу немесе PIER) жүзеге асырылуы мүмкін. IHC бояуымен күресудің негізгі қиындықтарының бірі – нақты емес немесе жалпы фонды жеңу. Бекіту әдістері мен уақытын оңтайландыру, блокадалық заттармен алдын ала өңдеу, антиденелерді жоғары концентрациялы тұзбен инкубациялау және антиденелерді жуғаннан кейінгі буферлерді және жуу уақытын оңтайландыру – жоғары сапалы иммунобойау алу үшін маңызды. Сонымен қатар, бояудың нақтылығын анықтау үшін оң және теріс бақылаулардың болуы қажет.
Immunohistochemistry or IHC staining of tissue sections (or immunocytochemistry, which is the staining of cells), is perhaps the most commonly applied immunostaining technique. While the first cases of IHC staining used fluorescent dyes (see immunofluorescence), other non fluorescent methods using enzymes such as peroxidase (see immunoperoxidase staining) and alkaline phosphatase are now used. These enzymes are capable of catalysing reactions that give a coloured product that is easily detectable by light microscopy. Alternatively, radioactive elements can be used as labels, and the immunoreaction can be visualized by autoradiography. Tissue preparation or fixation is essential for the preservation of cell morphology and tissue architecture. Inappropriate or prolonged fixation may significantly diminish the antibody binding capability. Many antigens can be successfully demonstrated in formalin fixed paraffin embedded tissue sections. However, some antigens will not survive even moderate amounts of aldehyde fixation. Under these conditions, tissues should be rapidly fresh frozen in liquid nitrogen and cut with a cryostat. The disadvantages of frozen sections include poor morphology, poor resolution at higher magnifications, difficulty in cutting over paraffin sections, and the need for frozen storage. Alternatively, vibratome sections do not require the tissue to be processed through organic solvents or high heat, which can destroy the antigenicity, or disrupted by freeze thawing. The disadvantage of vibratome sections is that the sectioning process is slow and difficult with soft and poorly fixed tissues, and that chatter marks or vibratome lines are often apparent in the sections. The detection of many antigens can be dramatically improved by antigen retrieval methods that act by breaking some of the protein cross links formed by fixation to uncover hidden antigenic sites. This can be accomplished by heating for varying lengths of times (heat induced epitope retrieval or HIER) or using enzyme digestion (proteolytic induced epitope retrieval or PIER). One of the main difficulties with IHC staining is overcoming specific or non specific background. Optimisation of fixation methods and times, pre treatment with blocking agents, incubating antibodies with high salt, and optimising post antibody wash buffers and wash times are all important for obtaining high quality immunostaining. In addition, the presence of both positive and negative controls for staining are essential for determining specificity.
Ағын цитометриясы
Бір немесе бірнеше белгілі бір белоктарды өндіретін жасушаларды тікелей талдау үшін ағын цитометрін қолдануға болады. Жасушалар иммунофлюоресценцияда қолданылатын әдістерге ұқсас әдістермен ерітіндіде иммунобелгіленеді, содан кейін ағын цитометриясымен талданады. Ағын цитометриясының IHC-ге қарағанда бірнеше артықшылықтары бар: жасушалардың мөлшері мен құрылымы бойынша нақты жасуша популяцияларын анықтау мүмкіндігі; өлген жасушаларды сүзу мүмкіндігі; жоғары сезімталдық; және бірнеше антигенді бір уақытта өлшеуге мүмкіндік беретін көп түсті талдау. Дегенмен, ағын цитометриясы өте сирек кездесетін жасуша популяцияларын анықтауда тиімділігі төмен болуы мүмкін, сондай-ақ тіндік кесімнің болмауынан архитектуралық байланыстар жоғалады. Ағын цитометрын сатып алумен байланысты жоғары бастапқы шығындар да бар.
A flow cytometer can be used for the direct analysis of cells expressing one or more specific proteins. Cells are immunostained in solution using methods similar to those used for immunofluorescence, and then analysed by flow cytometry. Flow cytometry has several advantages over IHC including: the ability to define distinct cell populations by their size and granularity; the capacity to gate out dead cells; improved sensitivity; and multi colour analysis to measure several antigens simultaneously. However, flow cytometry can be less effective at detecting extremely rare cell populations, and there is a loss of architectural relationships in the absence of a tissue section. Flow cytometry also has a high capital cost associated with the purchase of a flow cytometer.
Батыс блот
Вестерн блоттинг әдісі жасушалар немесе тіндерден алынған экстракттердегі белгілі бір белоктарды, кез келген тазалау кезеңдерінен бұрын немесе кейін анықтауға мүмкіндік береді. Белоктар әдетте құрғақ, жартылай құрғақ немесе ылғал блоттинг әдістері арқылы синтетикалық мембранаға көшірілгенге дейін гельдік электрофорез арқылы мөлшері бойынша бөлінеді. Мембрананы антиденелерді пайдаланып, иммуногистохимияға ұқсас әдістермен, бірақ бекіту қажеттілігі болмай, тексеруге болады. Анықтау әдетте пероксидазаға байланысты антиденелерді қолдану арқылы, химилюминесценттік реакцияны катализдеу үшін жүзеге асырылады. Вестерн блоттинг – экстракттер арасындағы белок деңгейін жартылай сандық түрде салыстыруға қолданылатын молекулалық биологияның стандартты әдісі. Блоттаудан бұрынғы мөлшерлік бөлу, белгілі молекулалық салмақ маркерлерімен салыстырғанда белоктың молекулалық салмағын анықтауға мүмкіндік береді.
Western blotting allows the detection of specific proteins from extracts made from cells or tissues, before or after any purification steps. Proteins are generally separated by size using gel electrophoresis before being transferred to a synthetic membrane via dry, semi dry, or wet blotting methods. The membrane can then be probed using antibodies using methods similar to immunohistochemistry, but without a need for fixation. Detection is typically performed using peroxidase linked antibodies to catalyse a chemiluminescent reaction. Western blotting is a routine molecular biology method that can be used to semi quantitatively compare protein levels between extracts. The size separation prior to blotting allows the protein molecular weight to be gauged as compared with known molecular weight markers.
Ферментпен байланысты иммуносорбентті талдау
Энзимдік иммуносорбенттік талдау немесе ELISA – қан плазмасы, сарысу немесе жасушалық/тіндік экстракттерден алынған белоктардың концентрациясын сандық немесе жартылай сандық түрде анықтауға арналған диагностикалық әдіс. Бұл әдіс көп ұңғымалы тақта форматында (әдетте бір тақтаға 96 ұңғыма) жүзеге асырылады. Ерітіндідегі белоктар ELISA тақташаларына адсорбцияланады. Зерттелетін белокқа специфичті антиденелер тақташаны тексеру үшін қолданылады. Блокалдау және жуу әдістерін оңтайландыру арқылы фондық сигнал азайтылады (IHC сияқты), ал позитивті және негативті бақылаулардың болуы арқылы нәтижелердің дұрыстығы қамтамасыз етіледі. Анықтау әдістері көбінесе колориметриялық немесе химилюминесценциялық принциптерге негізделген.
The enzyme linked immunosorbent assay or ELISA is a diagnostic method for quantitatively or semi quantitatively determining protein concentrations from blood plasma, serum or cell/tissue extracts in a multi well plate format (usually 96 wells per plate). Broadly, proteins in solution are absorbed to ELISA plates. Antibodies specific for the protein of interest are used to probe the plate. Background is minimised by optimising blocking and washing methods (as for IHC), and specificity is ensured via the presence of positive and negative controls. Detection methods are usually colorimetric or chemiluminescence based.
Иммуноэлектрондық микроскопия
Электрондық микроскопия немесе ЭМ тіндер мен жасушалардың егжей-тегжейлі микроархитектурасын зерттеу үшін қолданылуы мүмкін. Иммуно-ЭМ ультражіңішке тіндердегі нақты белсенділерді анықтауға мүмкіндік береді. Ауыр металл бөлшектерімен (мысалы, алтынмен) белгіленген антиденелерді беріліс электрондық микроскопиясы арқылы тікелей көруге болады. Иммуно-ЭМ белсендің жасуша ішіндегі орналасуын анықтауда қуатты болғанымен, техникалық тұрғыдан қиын, қымбатқа соғып, тіндерді бекіту және өңдеу әдістерін мұқият оңтайландыруды қажет етеді. Белсенділерді in vivo биотинилдеу, жасуша морфологиясын жақсы сақтайтын бекіту протоколдарымен антидене бояуының жиі үйлеспеуінен туындайтын мәселелерді жеңілдету үшін ұсынылды.
Electron microscopy or EM can be used to study the detailed microarchitecture of tissues or cells. Immuno EM allows the detection of specific proteins in ultrathin tissue sections. Antibodies labelled with heavy metal particles (e. g. gold) can be directly visualised using transmission electron microscopy. While powerful in detecting the sub cellular localisation of a protein, immuno EM can be technically challenging, expensive, and require rigorous optimisation of tissue fixation and processing methods. Protein biotinylation in vivo was proposed to alleviate the problems caused by frequent incompatibility of antibody staining with fixation protocols that better preserve cell morphology.
Әдістемелік шолу
Иммуноокраскалау әдістерінде белгілі бір белок эпитобын анықтау үшін антидене қолданылады. Бұл антиденелер моноклоналдық немесе поликлоналдық болуы мүмкін. Бұл бірінші немесе негізгі антиденені анықтау әртүрлі жолдармен жүзеге асырылуы мүмкін. Негізгі антидене фермент немесе флюорофор арқылы тікелей белгіленуі мүмкін. Бастапқы антидене ферментпен немесе флюороформен байланысатын жоғары туыстық байланыс серіктесімен өзара әрекеттесетін кішкентай молекула арқылы белгіленуі мүмкін. Биотин-стрептавидин – жиі қолданылатын жоғары туыстық өзара әрекеттесудің бір түрі. Бастапқы антиденені фермент немесе флюорофор арқылы белгіленген, кең түрге тән екіншілік антиденені қолдану арқылы анықтауға болады. Электрондық микроскопияда антиденелер ауыр металл бөлшегіне (әдетте 5-15 нм диаметрлі алтын нанобөлшектері) байланыстырылады. Бұрын айтылғандай, қарақұмық пероксидазасы немесе сілтілік фосфатаза сияқты ферменттер түсті немесе химилюминесценттік өнім беретін реакцияларды катализдеу үшін жиі қолданылады. Флуоресцентті молекулаларды флуоресценттік микроскопия немесе конфокалды микроскопия арқылы көруге болады.
In immunostaining methods, an antibody is used to detect a specific protein epitope. These antibodies can be monoclonal or polyclonal. Detection of this first or primary antibody can be accomplished in multiple ways. The primary antibody can be directly labeled using an enzyme or fluorophore. The primary antibody can be labeled using a small molecule which interacts with a high affinity binding partner that can be linked to an enzyme or fluorophore. The biotin streptavidin is one commonly used high affinity interaction. The primary antibody can be probed for using a broader species specific secondary antibody that is labeled using an enzyme, or fluorophore. In the case of electron microscopy, antibodies are linked to a heavy metal particle (typically gold nanoparticles in the range 5 15nm diameter). As previously described, enzymes such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase are commonly used to catalyse reactions that give a coloured or chemiluminescent product. Fluorescent molecules can be visualised using fluorescence microscopy or confocal microscopy.
Қолданбалар
Иммунотақылаудың қолданылу аясы кең, бірақ көбінесе клиникалық диагностикада және зертханалық зерттеулерде қолданылады. Клиникалық жағдайда, IHC гистопатологияда молекулалық маркерлерге сүйене отырып, нақты қатерлі ісіктерді диагностикалау үшін пайдаланылады. Зертханалық ғылымда иммунотақылауды әртүрлі мақсаттарда қолдануға болады, мысалы, ақуыздың болуын немесе болмауын, тіндердегі таралуын, жасуша ішіндегі орналасуын, сондай-ақ ақуыздың экспрессиясы немесе ыдырауындағы өзгерістерді зерттеу үшін.
The applications of immunostaining are numerous, but are most typically used in clinical diagnostics and laboratory research. Clinically, IHC is used in histopathology for the diagnosis of specific types of cancers based on molecular markers. In laboratory science, immunostaining can be used for a variety of applications based on investigating the presence or absence of a protein, its tissue distribution, its sub cellular localisation, and of changes in protein expression or degradation.