Изоэлектрлік нүкте: молекуланың электрлік заряды тепе-теңдігі

Кіріспе

pH, белгілі бір молекуланың немесе берілген қатты дененің бетінің таза электр заряды жоқ болатын мәні. Изоэлектрлік нүкте (pI, pH(I), IEP) – молекуланың таза электр заряды жоқ немесе статистикалық орташа есеп бойынша электрлік бейтарап күйде болатын pH. Изоэлектрлік нүктені белгілеу үшін стандартты номенклатура pH(I) болып табылады. Дегенмен, pI де қолданылады. Ықшамдылық үшін осы мақалада pI қолданылады. Молекуланың таза зарядына оның айналасындағы ортаның pH әсер етеді және ол протондардың (H+) қосылуы немесе жоғалтуы нәтижесінде оң немесе теріс заряд ала алады. Беттер табиғи түрде зарядталап, екі қабатты құрайды. Көбінесе, беттік зарядты анықтайтын иондар H+/HO− болған жағдайда, таза беттік заряд қатты дененің батырылған сұйығының pH-ына тәуелді болады. pI мәні молекуланың белгілі бір pH-тағы ерігіштігіне әсер ете алады. Мұндай молекулалардың pH-ы олардың pI-ға сәйкес келгенде су немесе тұз ерітінділерінде ең аз ерігіштікке ие болады және көбінесе ерітіндіден түнектеледі. Биологиялық амфотерлік молекулалар, мысалы, белоктар, қышқылдық және негіздік функционалдық топтарды қамтиды. Белок құрамындағы аминқышқылының заряды оң, теріс, бейтарап немесе полярлы болуы мүмкін, олардың жиынтығы белокке оның жалпы зарядын береді. pH, олардың pI-ынан төмен болса, белоктер оң зарядты болады; ал pH, олардың pI-ынан жоғары болса, теріс зарядты болады. Сондықтан, белоктерді полиакриламид гельінде таза заряд бойынша бөлуге болады, бұл үшін тұрақты pH қолданылатын препараттық PAGE немесе pH градиентін пайдаланатын изоэлектрлік фокустау қолданылады. Изоэлектрлік фокустау 2D гельді полиакриламид гель электрофорезінің алғашқы қадамы болып табылады. Биомолекулаларда белоктерді ион алмасу хроматографиясы арқылы бөлуге болады. Биологиялық белоктер звиттериондық аминқышқылынан тұрады; осы белоктердің таза заряды ортаның pH-ына байланысты оң немесе теріс болуы мүмкін. Мақсатты белоктың нақты pI-і процесті модельдеу үшін пайдаланылуы мүмкін, содан кейін қоспаның қалған бөлігінен белок тазартылады. Осы тазарту процесі үшін әртүрлі pH-тағы буферлер қолданылып, ортаның pH-ын өзгертуге болады. Мақсатты белокты қамтитын қоспа ион алмастырғышқа жүктелгенде, стационарлық матрица оң зарядталған (көшпелі аниондар үшін) немесе теріс зарядталған (көшпелі катиондар үшін) болуы мүмкін. Төмен pH мәндерінде қоспадағы көптеген белоктердің таза заряды оң болады – катион алмастырғыштарда бұл оң зарядталған белоктер теріс зарядталған матрицаға байланысады. Жоғары pH мәндерінде көптеген белоктердің таза заряды теріс болады, олар анион алмастырғыштардағы оң зарядталған матрицаға байланысады. Ортаның pH-ы белоктың pI-ына тең болғанда, таза заряд нөлге тең болады және белок ешқандай алмастырғышқа байланыспайды, сондықтан оны элюциялауға болады.

pH at which a particular molecule, or the surface of a given solid, carries no net electrical charge
The isoelectric point (pI, pH(I), IEP), is the pH at which a molecule carries no net electrical charge or is electrically neutral in the statistical mean. The standard nomenclature to represent the isoelectric point is pH(I). However, pI is also used. For brevity, this article uses pI. The net charge on the molecule is affected by pH of its surrounding environment and can become more positively or negatively charged due to the gain or loss, respectively, of protons (H+). Surfaces naturally charge to form a double layer. In the common case when the surface charge determining ions are H+/HO−, the net surface charge is affected by the pH of the liquid in which the solid is submerged. The pI value can affect the solubility of a molecule at a given pH. Such molecules have minimum solubility in water or salt solutions at the pH that corresponds to their pI and often precipitate out of solution. Biological amphoteric molecules such as proteins contain both acidic and basic functional groups. Amino acids that make up proteins may be positive, negative, neutral, or polar in nature, and together give a protein its overall charge. At a pH below their pI, proteins carry a net positive charge; above their pI they carry a net negative charge. Proteins can, thus, be separated by net charge in a polyacrylamide gel using either preparative native PAGE, which uses a constant pH to separate proteins, or isoelectric focusing, which uses a pH gradient to separate proteins. Isoelectric focusing is also the first step in 2 D gel polyacrylamide gel electrophoresis. In biomolecules, proteins can be separated by ion exchange chromatography. Biological proteins are made up of zwitterionic amino acid compounds; the net charge of these proteins can be positive or negative depending on the pH of the environment. The specific pI of the target protein can be used to model the process around and the compound can then be purified from the rest of the mixture. Buffers of various pH can be used for this purification process to change the pH of the environment. When a mixture containing a target protein is loaded into an ion exchanger, the stationary matrix can be either positively charged (for mobile anions) or negatively charged (for mobile cations). At low pH values, the net charge of most proteins in the mixture is positive – in cation exchangers, these positively charged proteins bind to the negatively charged matrix. At high pH values, the net charge of most proteins is negative, where they bind to the positively charged matrix in anion exchangers. When the environment is at a pH value equal to the protein's pI, the net charge is zero, and the protein is not bound to any exchanger, and therefore, can be eluted out.

pI мәндерін есептеу

Тек бір амин және бір карбоксил тобы бар аминқышқылы үшін pI осы молекуланың pKa-ларының орташа мәнінен есептеледі. Электрофоретикалық гельдің pH-ы сол гель үшін қолданылатын буфермен анықталады. Егер буфердің pH-ы жүргізіліп жатқан ақуыздың pI-ынан жоғары болса, ақуыз оң полюске қарай жылжиды (теріс заряд оң полюске тартылады). Егер буфердің pH-ы жүргізіліп жатқан ақуыздың pI-ынан төмен болса, ақуыз гельдің теріс полюсіне қарай жылжиды (оң заряд теріс полюске тартылады). Егер ақуызды буферлік pH pI-ға тең болса, ол мүлдем жылжмайды. Бұл жеке аминқышқылдары үшін де сәйкес келеді.

Пептидтер мен ақуыздар

Пептидтер мен ақуыздардың изоэлектрлік нүктелерін анықтау үшін бірнеше алгоритмдер әзірленді. Олардың көпшілігі әртүрлі pK мәндерімен Хендерсон-Хассельбальх теңдеуін қолданады. Мысалы, Бьелльквист және оның әріптестері ұсынған модельде pK мәндері тығыз байланысты изоэлектрлік нүктелер арасындағы бірдей сынаманы pH градиенттерінде фокустау арқылы анықталды. Әдістемеге енгізілген кейбір жақсартулар (әсіресе модификацияланған аминқышқылдарының pK мәндерін анықтауда) ұсынылды. Күрделірек әдістер зарядталған аспартик немесе глутамин қышқылынан ±3 қалдыққа дейінгі арақашықтықтағы жақын орналасқан аминқышқылдарының әсерін, сондай-ақ бос С-терминалға тигізетін әсерін ескереді, және генетикалық алгоритмді қолдана отырып, тиісті pK мәндеріне түзету енгізеді. Басқа да жақындағы тәсілдер қолдау векторлық машина алгоритміне және белгілі ақуыз/пептид изоэлектрлік нүктелеріне қарсы pKa оптимизациясына негізделген. Сонымен қатар, ақуыздардың эксперименттік өлшенген изоэлектрлік нүктелері дерекқорға жинақталды. Жақында барлық ақуыздар үшін, қолданылатын әдістердің көпшілігімен болжалған изоэлектрлік нүктелердің дерекқоры да әзірленді. Іс жүзінде, негізгі аминқышқылдары (аргинин, лизин және/немесе гистидин) көп мөлшерде болатын ақуыздың изоэлектрлік нүктесі 7-ден жоғары (негіздік) болады, ал қышқыл аминқышқылдары (аспартик қышқылы және/немесе глутамин қышқылы) көп мөлшерде болатын ақуыздың изоэлектрлік нүктесі көбінесе 7-ден төмен (қышқылдық) болады. Полиакриламид гельінде pH градиенті бойынша Ip арқылы электрофоретикалық сызықтық (көлденең) ақуызды бөлу (изоэлектрлік фокустау деп те аталады), одан кейін стандартты молекулалық салмақты сызықтық (тік) бөлу (SDS PAGE) екінші полиакриламид гелінде, екі өлшемді гель электрофорезі немесе PAGE 2D деп аталады. Бұл техника ақуызды ерекше "дақтар" ретінде толық бөлуге мүмкіндік береді, жоғары молекулалық салмағы бар және төмен Ip белгілері екі өлшемді гельдің жоғарғы сол жағына жылжысады, ал төмен молекулалық салмағы бар және жоғары Ip белгілері сол гельдің төменгі оң жағына орналасады.

A number of algorithms for estimating isoelectric points of peptides and proteins have been developed. Most of them use Henderson–Hasselbalch equation with different pK values. For instance, within the model proposed by Bjellqvist and co workers, the pKs were determined between closely related immobilines by focusing the same sample in overlapping pH gradients. Some improvements in the methodology (especially in the determination of the pK values for modified amino acids) have been also proposed. More advanced methods take into account the effect of adjacent amino acids ±3 residues away from a charged aspartic or glutamic acid, the effects on free C terminus, as well as they apply a correction term to the corresponding pK values using genetic algorithm. Other recent approaches are based on a support vector machine algorithm and pKa optimization against experimentally known protein/peptide isoelectric points. Moreover, experimentally measured isoelectric point of proteins were aggregated into the databases. Recently, a database of isoelectric points for all proteins predicted using most of the available methods had been also developed. In practice, a protein with an excess of basic aminoacids (arginine, lysine and/or histidine) will bear an isoelectric point roughly greater than 7 (basic), while a protein with an excess of acidic aminoacids (aspartic acid and/or glutamic acid) will often have an isoelectric point lower than 7 (acidic). The electrophoretic linear (horizontal) separation of proteins by Ip along a pH gradient in a polyacrylamide gel (also known as isoelectric focusing), followed by a standard molecular weight linear (vertical) separation in a second polyacrylamide gel (SDS PAGE), constitutes the so called two dimensional gel electrophoresis or PAGE 2D. This technique allows a thorough separation of proteins as distinct "spots", with proteins of high molecular weight and low Ip migrating to the upper left part of the bidimensional gel, while proteins with low molecular weight and high Ip locate to the bottom right region of the same gel.

Нөлдік зарядтың нүктесіне қарсы

Изоэлектрлік нүкте (IEP) және нөлдік заряд нүктесі (PZC) терминдері көбінесе бір-бірін алмастырып қолданылады, бірақ белгілі бір жағдайларда оларды ажырату пайдалы болуы мүмкін. H+/OH− интерфейстік потенциалды анықтайтын иондар болатын жүйелерде нөлдік заряд нүктесі pH арқылы беріледі. Бетінде нейтральді таза электр зарядының pH-ы – бұл беттегі нөлдік заряд нүктесі. Электрокинетикалық құбылыстар көбінесе зета-потенциалды өлшейді, ал нөлдік зета-потенциалы қима жазықтығындағы нөлдік таза заряд нүктесі ретінде түсіндіріледі. Бұл изоэлектрлік нүкте деп аталады. Осылайша, изоэлектрлік нүкте – коллоидты бөлшектің электр өрісінде қозғалмайтын рН мәні. Изоэлектрлік нүкте бөлшектің бетіндегі нөлдік заряд нүктесінен сәл өзгеше болуы мүмкін, бірақ бұл айырмашылық тәжірибеде «таза» беттерде, яғни нақты адсорбцияланған оң немесе теріс зарядтары жоқ беттерде көбінесе ескерілмейді. Оң немесе теріс зарядтар болмаған жағдайда, бетті нөлдік заряд нүктесі жақсы сипаттайды. Егер оң және теріс зарядтар тең мөлшерде болса, онда бұл изоэлектрлік нүкте. Осылайша, PZC кез келген типті беткі зарядтың болмауын білдіреді, ал IEP – нейтральді таза беткі зарядтың күйін. Сондықтан, екі арасындағы айырмашылық – таза нөлдік заряд нүктесіндегі зарядталған орындардың саны. Жоливе ішкі беттік тепе-теңдік константаларын, pK− және pK+, екі жағдайды зарядталған орындардың салыстырмалы саны тұрғысынан анықтау үшін қолданады:

Үлкен ΔpK үшін (>4 Жоливеге сәйкес), басым түр MOH, ал салыстырмалы түрде аз зарядталған түрлер бар, сондықтан PZC маңызды. ΔpK-ның кіші мәндері үшін шамамен бірдей санда көптеген зарядталған түрлер бар, сондықтан IEP туралы айтамыз.