Қызыл балдырлардан алынатын гетерополисахарид - Агароза

Кіріспе

Қызыл балдырларда кездесетін гетерополисахарид

Агароза – гетерополисахарид, көбінесе белгілі бір қызыл балдырлардан өндіріледі. Ол D-галактоза және 3,6-ангидро-L-галактопиранозадан тұратын дисахарид – агаробиозаның қайталама бірлігінен құралған сызықтық полимер. Агароза – агардың екі негізгі құрамының бірі және агардың басқа құрамы – агаропектинді жою арқылы тазартылады. Агароза молекулалық биологияда, әсіресе ДНҚ-ны электрофорез арқылы ірі молекулаларды бөлу үшін жиі қолданылады. Электрофорезге арналған агароза гельдері (әдетте 0,7–2%) ыстық сұйық ерітіндіні қалыпқа құйып, оңай дайындалады. Бұл мақсат үшін әртүрлі молекулалық салмағы мен қасиеттері бар көптеген агарозалар коммерциялық түрде қолжетімді. Агарозадан бұршақтар жасап, белоктарды тазарту үшін бірнеше хроматографиялық әдістерде де пайдалануға болады.

Құрылымы

Агароза – молекулалық салмағы шамамен 120 000 болатын, α (1→3) және β (1→4) гликозидтік байланыстар арқылы біріктірілген D-галактоза мен 3,6-ангидро-L-галактопиранозадан тұратын сызықтық полимер. 3,6-ангидро-L-галактопираноза – 3-тен 6-ға дейінгі аралықта ангидро көпіршесі бар L-галактоза, бірақ полимердегі кейбір L-галактоза бірліктерінде көпірше болмауы мүмкін. Кейбір D-галактоза және L-галактоза бірліктері метилденген болуы мүмкін, сондай-ақ пируват пен сульфат та аз мөлшерде кездеседі. Әрбір агароза тізбегінде ~800 молекула галактоза бар, ал агароза полимерлік тізбектері спираль тәрізді талшықтар құрайды, олар 20-30 нанометр (нм) радиусы бар суперспиральді құрылымға бірігеді. Талшықтар жартылай қатты болып келеді және агароза концентрациясына байланысты ұзындығы әртүрлі болады. Қаттыланған кезде талшықтар диаметрі 50 нм-ден >200 нм-ге дейінгі каналдардың үш өлшемді торынан құралады, бұл қолданылған агароза концентрациясына байланысты. 3D құрылым сутекті байланыстармен ұсталады, сондықтан оны сұйық күйге қайта қыздыру арқылы бұзуға болады.

Қасиеттері

Агароза ақ ұнтақ түрінде келеді, ол қайнауға жақын суға ерітіледі және салқындағанда гель түзеді. Агароза сұйықтан гельге өту кезінде термиялық гистерезис құбылысын көрсетеді, яғни әртүрлі температурада гельденіп, ериді. Гельдеу және балқу температуралары агарозаның түріне байланысты өзгереді. Gelidium-нан алынған стандартты агарозалардың гельдеу температурасы және балқу температурасы 0, ал Gracilaria-дан алынғандары, оның жоғары метокси тобының болуына байланысты, гельдеу температурасы және балқу температурасы 0 құрайды. Гельдің концентрациясына, әсіресе 1% төмен концентрацияда, байланысты балқу және гельдеу температуралары өзгеруі мүмкін. Сондықтан, гельдеу және балқу температуралары агарозаның белгілі бір концентрациясында көрсетіледі. Табиғи агарозада зарядталмаған метил топтары бар, ал метилирлеу деңгейі гельдеу температурасына тікелей пропорционал. Дегенмен, синтетикалық метилирлеу кері әсер етеді, яғни метилирлеудің артуы гельдеу температурасын төмендетеді. Химиялық модификациялар арқылы әртүрлі балқу және гельдеу температураларына ие әртүрлі химиялық өзгертілген агарозалар қол жетімді. Гельдегі агароза көпіршіктерді қамтитын тор құрайды, ал көпіршіктердің мөлшері қосылған агарозаның концентрациясына байланысты. Агароза гельдері тұрғанда синерезге (гель бетінен судың шығуына) бейім, бірақ бұл процесс гельді пайдалануға кедеріс келтірмейтіндей баяу жүреді. Агароза гелі төмен концентрацияда жоғары гельдік күшке ие болуы мүмкін, сондықтан ол гельдік электрофорез үшін конвекцияға қарсы орта ретінде қолдануға жарамды. 0,15% дейін сұйылтылған агароза гельдері гельдік электрофорезге арналған плиталар жасауға қолданылуы мүмкін. Электроэндосмоз – агарозаның агарға қарағанда артық қолданылу себебі, себебі агарда агоропектин құрамында маңызды мөлшерде теріс зарядталған сульфат және карбоксил топтары бар. Агарозодағы агоропектинді жою ЭЭО-ны айтарлықтай төмендетеді, сондай-ақ биомолекулалардың гель матрицасына бейтарап сіңуін азайтады. Алайда, кейбір қолданыстар үшін, мысалы, сарысу ақуыздарын электрофорездеу үшін, жоғары ЭЭО қажет болуы мүмкін, сондықтан қолданылатын гельге агоропектин қосылуы мүмкін.

Agarose is available as a white powder which dissolves in near boiling water, and forms a gel when it cools. Agarose exhibits the phenomenon of thermal hysteresis in its liquid to gel transition, i. e. it gels and melts at different temperatures. The gelling and melting temperatures vary depending on the type of agarose. Standard agaroses derived from Gelidium has a gelling temperature of and a melting temperature of , while those derived from Gracilaria, due to its higher methoxy substituents, has a gelling temperature of and melting temperature of The melting and gelling temperatures may be dependent on the concentration of the gel, particularly at low gel concentration of less than 1%. The gelling and melting temperatures are therefore given at a specified agarose concentration. Natural agarose contains uncharged methyl groups and the extent of methylation is directly proportional to the gelling temperature. Synthetic methylation however have the reverse effect, whereby increased methylation lowers the gelling temperature. A variety of chemically modified agaroses with different melting and gelling temperatures are available through chemical modifications. The agarose in the gel forms a meshwork that contains pores, and the size of the pores depends on the concentration of agarose added. On standing, the agarose gels are prone to syneresis (extrusion of water through the gel surface), but the process is slow enough to not interfere with the use of the gel. Agarose gel can have high gel strength at low concentration, making it suitable as an anti convection medium for gel electrophoresis. Agarose gels as dilute as 0.15% can form slabs for gel electrophoresis. Electroendosmosis is a reason agarose is used preferentially over agar as agaropectin in agar contains a significant amount of negatively charged sulphate and carboxyl groups. The removal of agaropectin in agarose substantially reduces the EEO, as well as reducing the non specific adsorption of biomolecules to the gel matrix. However, for some applications such as the electrophoresis of serum protein, a high EEO may be desirable, and agaropectin may be added in the gel used.

Төмен балқу және желдеу температурасы бар агарозалар

Агарозаның балқу және гельдеу температурасы химиялық өзгерістер арқылы, ең көп кездесетіні – гидроксиэтилация арқылы өзгертілуі мүмкін, бұл молекула ішіндегі сутекті байланыстардың санын азайтады, нәтижесінде стандартты агарозаларға қарағанда төмен балқу және қатаю температураларына ие болады. Нақты температураның мәні, алмастыру дәрежесімен анықталады, ал көптеген төмен балқу нүктесі бар (LMP) агарозалар белгілі бір диапазонда сұйық күйде қалуы мүмкін. Бұл қасиет, ДНҚ гель электрофорезінен кейін ферменттік манипуляцияларды тікелей жүргізуге мүмкіндік береді, яғни қызығушылық тудыратын ДНҚ фрагментін қамтитын балқытылған гель тілімшелерін реакциялық қоспаға қосу арқылы. LMP агарозасы, кейбір ферменттік реакцияларға әсер ететін сульфаттардың азырақ мөлшерін қамтиды, сондықтан кейбір қолданулар үшін осы агароза артық таңдалады. Гидроксиэтилденген агарозаның қарапайым агарозаларға қарағанда кішірек пор өлшемдері (~90 нм) бар. Гидроксиэтилация, агароза шоғырларының тығыздығын азайту арқылы пор өлшемін кішірейте алады, сондықтан LMP гель электрофорез кезінде уақыт пен бөлінуге де әсер етуі мүмкін. Өте төмен балқу немесе қатаю температурасы бар агарозалар тек қана белгілі бір температурада ғана гельдей алады.

Қолданбалар

Агароза – ақуыздар мен нуклеин қышқылдарымен жұмыс істеуге артықшылықты матрица, себебі оның физикалық, химиялық және термиялық тұрақтылығының кең диапазоны бар, ал химиялық құрамының қарапайымдығы биомолекулалармен өзара әрекеттесу ықтималдығын азайтады. Агароза көбінесе агароза гельдік электрофорездегі аналитикалық деңгейдегі электрофорезиялық бөлісу ортасы ретінде қолданылады. Тазартылған агарозадан жасалған гельдердің тесіктері салыстырмалы түрде ірі болып келеді, бұл оларды ірі молекулаларды, мысалы, 200 килодальтоннан асатын ақуыздар мен ақуыз кешендерін, сондай-ақ 100 негіз жұбынан асатын ДНК фрагменттерін бөлу үшін тиімді етеді. Агароза иммунодиффузия және иммуноэлектрофорез сияқты көптеген басқа да қолдануларда кеңінен қолданылады, себебі агароза талшықтары иммунокомплекстерге бекініш ретінде қызмет ете алады.

Агароза гелі электрофорезі

Агароза гельдік электрофорез – зертханада ДНК-ны ажыратудың қалыпты әдісі. Агароза гельдері акриламид гельдеріне қарағанда ДНК-ны ажырату мүмкіндігі төмен, бірақ олардың ажырату диапазоны кеңірек, сондықтан әдетте 50–20 000 bp (базалық жұптар) ұзындығындағы ДНК фрагменттері үшін қолданылады, бірақ импульстік өріс гельдік электрофорезі (PFGE) арқылы 6 Мб-тан асатын ажырату да мүмкін. Ол ірі ақуыз молекулаларын бөлу үшін де қолданылуы мүмкін, сондай-ақ тиімді радиусы 5 нм-ден үлкен бөлшектердің гельдік электрофорезі үшін қолайлы матрица болып табылады. Гельдің тесік мөлшері ажыратылатын ДНК-ның мөлшеріне әсер етеді. Гельдің концентрациясы неғұрлым төмен болса, тесік мөлшері соғұрлым ірі болады, демек, ірі ДНК-ны ажыратуға болады. Дегенмен, төмен концентрациялы гельдер (0,1–0,2%) нашар және оларды қолдану қиын, ал ірі ДНК молекулаларын электрофорездеуге бірнеше күн уақыт қажет болуы мүмкін. Стандартты агароза гельдік электрофорезі үшін ажырату шегі шамамен 750 кб құрайды. Бұл бөлшектердің құрылымы өте кеуекті болғандықтан, ақуыздар олар арқылы еркін өтіп кетуі мүмкін. Агарозаға негізделген бұл бөлшектер әдетте жұмсақ және оңай ұсатылады, сондықтан оларды гравитациялық ағын, төмен жылдамдықты центрифугалау немесе төмен қысымды процедуралар кезінде қолдану керек. Шаңдардың беріктігін агароза шайырларының көбейтілген байланысы мен химиялық қатаюы арқылы арттыруға болады, бірақ мұндай өзгерістер кейбір ажырату процедураларында, мысалы, аффиниттік хроматографияда ақуызға байланысу қабілетін төмендетуі мүмкін. Агароза хроматография үшін пайдалы материал, себебі ол биомолекулаларды айтарлықтай сіңірмейді, жақсы ағын қасиеттеріне ие және pH және иондық күштің шегіне, сондай-ақ 8M мочевина немесе 6M гуанидин HCl сияқты денатурациялаушы заттардың жоғары концентрациясына төтеп бере алады. Гельдік сүзгілеу хроматографиясы үшін агарозаға негізделген матрицаның мысалдары: Sepharose және WorkBeads 40 SEC (қайшы байланысты бөлшекті агароза), Praesto және Superose (қайшы байланысты бөлшекті агарозалар) және Superdex (агарозаға ковалентті байланысқан декстран). Аффиниттік хроматография үшін ақуызды байланыстыратын лигандтарды бекіту үшін бөлшекті агароза ең көп қолданылатын матрицалық шайыр. Лигандтар аралық байланыс арқылы агароза полимерінің белсендірілген гидроксилдік тобына ковалентті байланыстырылады. Содан кейін қызығушылық тудыратын ақуыздарды лигандтарға таңдап байланыстырып, оларды басқа ақуыздардан бөліп алуға болады, одан кейін оларды элюциялауға болады. Қолданылатын агароза бөлшектері әдетте 4% және 6% тығыздыққа ие және ақуызға жоғары байланысу қабілетіне ие.

Agarose gel electrophoresis is the routine method for resolving DNA in the laboratory. Agarose gels have lower resolving power for DNA than acrylamide gels, but they have greater range of separation, and are therefore usually used for DNA fragments with lengths of 50–20,000 bp (base pairs), although resolution of over 6 Mb is possible with pulsed field gel electrophoresis (PFGE). It can also be used to separate large protein molecules, and it is the preferred matrix for the gel electrophoresis of particles with effective radii larger than 5 10 nm. The pore size of the gel affects the size of the DNA that can be sieved. The lower the concentration of the gel, the larger the pore size, and the larger the DNA that can be sieved. However low concentration gels (0.1 0.2%) are fragile and therefore hard to handle, and the electrophoresis of large DNA molecules can take several days. The limit of resolution for standard agarose gel electrophoresis is around 750 kb. The beads are highly porous so that protein may flow freely through the beads. These agarose based beads are generally soft and easily crushed, so they should be used under gravity flow, low speed centrifugation, or low pressure procedures. The strength of the resins can be improved by increased cross linking and chemical hardening of the agarose resins, however such changes may also result in a lower binding capacity for protein in some separation procedures such as affinity chromatography. Agarose is a useful material for chromatography because it does not absorb biomolecules to any significant extent, has good flow properties, and can tolerate extremes of pH and ionic strength as well as high concentration of denaturants such as 8M urea or 6M guanidine HCl. Examples of agarose based matrix for gel filtration chromatography are Sepharose and WorkBeads 40 SEC (cross linked beaded agarose), Praesto and Superose (highly cross linked beaded agaroses), and Superdex (dextran covalently linked to agarose). For affinity chromatography, beaded agarose is the most commonly used matrix resin for the attachment of the ligands that bind protein. The ligands are linked covalently through a spacer to activated hydroxyl groups of agarose bead polymer. Proteins of interest can then be selectively bound to the ligands to separate them from other proteins, after which it can be eluted. The agarose beads used are typically of 4% and 6% densities with a high binding capacity for protein.

Қатты өсіру ортасы

Кейде агардың орнына агароза қолданылуы мүмкін, себебі агарда организмнің өсуіне немесе полимераза тізбекті реакциясы (ПТР) сияқты кейбір келесі процедураларға әсер ететін қоспалар болуы мүмкін. Агароза агардан берік болады, сондықтан гельдің күші жоғарырақ қажет болған жағдайда оны пайдалану ыңғайлы, ал оның төмен температурада гельдеу қасиеті клеткалар сұйықтықта ілгеленген кезде организмге жылулық стресс түсірмеуге көмектеседі. Оны қатаң аутотрофты бактериялар, өсімдік протопласттары, Caenorhabditis elegans, басқа да организмдер мен түрлі жасуша желілерін өсіру үшін қолдануға болады.

Қозғалыс сынақтары

Микроорганизмдердің қозғалыс белсенділігі мен жылдамдығын өлшеу үшін кейде агардың орнына агароза қолданылады. Белсенді түрлер гельдің кеуекті құрылымы арқылы, болса да баяу, қозғала алады, соның нәтижесінде инфильтрация жылдамдығын бақылауға болады. Гельдің кеуектілігі ортадағы агар немесе агарозаның концентрациясына тікелей байланысты, сондықтан жасушаның жүзу, топтасу, сырғанау және сілкініп қозғалу белсенділігін бағалау үшін әртүрлі концентрациялы гельдер пайдаланылуы мүмкін. Клеткалардың агарозада көшіп кетуінің арқасында химиотаксис пен химиокинезді өлшеуге болады. Клеткалық популяция мен химиоаттрактанттың арасына агароза гель қабаты салынады. Гельге химиоаттрактанттың диффузиясынан концентрация градиенті қалыптасқанда, әртүрлі деңгейдегі стимуляцияны қажет ететін жасуша популяциялары микрофотография арқылы уақыт өте келе градиент бойымен, гравитацияға қарсы гель арқылы жоғары қарай жылжуын көруге болады.