Введение
Биохимический метод
В биохимии иммуноокрашивание – это любое использование метода, основанного на антителах, для обнаружения специфического белка в образце. Термин "иммуноокрашивание" изначально использовался для обозначения иммуногистохимического окрашивания срезов тканей, впервые описанного Альбертом Кунсом в 1941 году. Однако в настоящее время иммуноокрашивание охватывает широкий спектр техник, применяемых в гистологии, клеточной биологии и молекулярной биологии, использующих методы окрашивания на основе антител.
Иммуногистохимия
Иммуногистохимия или IHC-окрашивание срезов ткани (или иммуноцитохимия, которая представляет собой окрашивание клеток) – пожалуй, наиболее часто используемая методика иммуноокрашивания. В то время как в первых случаях IHC-окрашивания применялись флуоресцентные красители (см. иммунофлуоресценцию), в настоящее время используются и другие нефлуоресцентные методы с применением ферментов, таких как пероксидаза (см. иммунопероксидазное окрашивание) и щелочная фосфатаза. Эти ферменты способны катализировать реакции, приводящие к образованию окрашенного продукта, который легко обнаруживается при световой микроскопии. В качестве альтернативы, в качестве меток могут использоваться радиоактивные элементы, а иммунореакцию можно визуализировать с помощью авторадиографии. Подготовка или фиксация ткани необходима для сохранения морфологии клеток и архитектуры ткани. Неправильная или чрезмерно длительная фиксация может значительно снизить способность антител к связыванию. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы в срезах ткани, залитых в парафин после фиксации формалином. Однако некоторые антигены не выживают даже при умеренном воздействии альдегидных фиксаторов. В таких случаях ткани следует быстро замораживать в жидком азоте и получать срезы с помощью криостата. Недостатки замороженных срезов включают в себя плохую морфологию, низкое разрешение при больших увеличениях, трудности при получении срезов по сравнению с парафиновыми и необходимость хранения в замороженном состоянии. В качестве альтернативы, срезы, полученные на вибратоме, не требуют обработки ткани органическими растворителями или высокой температурой, которые могут разрушить антигенность или вызвать ее нарушение при замораживании-оттаивании. Недостатком срезов, полученных на вибратоме, является то, что процесс секционирования медленный и затруднен при работе с мягкими и плохо зафиксированными тканями, а также то, что на срезах часто видны следы вибрации или линии от вибратома. Обнаружение многих антигенов может быть значительно улучшено методами восстановления антигенов, которые действуют путем разрыва некоторых белковых поперечных связей, образованных в процессе фиксации, для выявления скрытых эпитопов. Этого можно достичь путем нагревания в течение различного времени (теплоиндуцированное восстановление эпитопа или HIER) или с использованием ферментативного переваривания (протеолитическое восстановление эпитопа или PIER). Одной из основных сложностей при IHC-окрашивании является устранение специфического или неспецифического фона. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител в высокосолевых растворах, а также оптимизация буферов для промывки после инкубации антител и времени промывки – все это важно для получения высококачественного иммуноокрашивания. Кроме того, наличие как положительного, так и отрицательного контроля окрашивания необходимо для определения специфичности.
Потоковая цитометрия
Для прямого анализа клеток, экспрессирующих один или несколько специфических белков, может использоваться проточный цитометр. Клетки иммуноокрашиваются в растворе методами, аналогичными используемым в иммунофлуоресценции, а затем анализируются проточной цитометрией. Проточная цитометрия имеет ряд преимуществ перед иммуногистохимией, включая: возможность выделения отдельных популяций клеток по размеру и гранулярности; возможность исключения мертвых клеток; повышенную чувствительность; и многоцветный анализ для одновременного измерения нескольких антигенов. Однако проточная цитометрия может быть менее эффективна для обнаружения крайне редких популяций клеток, а также теряется информация об архитектурном строении тканей, поскольку отсутствует срезочный материал. Проточная цитометрия также требует значительных капиталовложений для приобретения прибора.
Западный блот
Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать специфические белки в экстрактах, полученных из клеток или тканей, до или после этапов очистки. Белки обычно разделяют по размеру с помощью гелевого электрофореза, прежде чем переносить на синтетическую мембрану с использованием сухих, полусухих или влажных методов блоттинга. Затем мембрану можно исследовать с помощью антител, применяя методы, аналогичные иммуногистохимии, но без необходимости фиксации. Обнаружение обычно проводят с использованием антител, конъюгированных с пероксидазой, для катализа химилюминесцентной реакции. Вестерн-блоттинг – это стандартный метод молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного сравнения уровней белка между экстрактами. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет оценить молекулярную массу белка по сравнению с известными маркерами молекулярной массы.
Энзимно-связанный иммуносорбентный анализ
Энзимный иммуносорбентный анализ, или ELISA, – это диагностический метод количественного или полуколичественного определения концентрации белков в плазме крови, сыворотке или клеточных/тканевых экстрактах, выполняемый в формате многолуночных планшетов (обычно 96 лунок на планшет). В общем случае, белки в растворе адсорбируются на планшетах ELISA. Для выявления белка, представляющего интерес, используются специфичные к нему антитела. Минимизация неспецифического связывания достигается оптимизацией методов блокировки и промывки (аналогично IHC), а специфичность обеспечивается наличием положительного и отрицательного контроля. Методы детекции обычно основаны на колориметрии или хемолюминесценции.
Иммуноэлектронная микроскопия
Для изучения детальной микроархитектуры тканей или клеток можно использовать электронную микроскопию, или ЭМ. Иммуно-ЭМ позволяет обнаруживать специфические белки в ультратонких срезах ткани. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золота), могут быть непосредственно визуализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Хотя иммуно-ЭМ является мощным методом для определения субклеточной локализации белка, он может быть технически сложным, дорогостоящим и требует тщательной оптимизации методов фиксации и обработки тканей. Биотинилирование белков in vivo было предложено для решения проблем, возникающих из-за частой несовместимости окрашивания антителами с протоколами фиксации, обеспечивающими лучшее сохранение морфологии клеток.
Методологический обзор
При методах иммуноокрашивания для обнаружения специфического эпитопа белка используется антитело. Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Обнаружение этого первичного антитела может быть осуществлено различными способами. Первичное антитело можно непосредственно пометить ферментом или флюорофором. Также первичное антитело может быть маркировано небольшой молекулой, которая взаимодействует с высокоаффинным лигандом, который, в свою очередь, может быть связан с ферментом или флюорофором. Биотин-стрептавидин – одно из наиболее часто используемых высокоаффинных взаимодействий. Для выявления первичного антитела можно использовать вторичное антитело, специфичное к виду, которое маркировано ферментом или флюорофором. В случае электронной микроскопии антитела связывают с частицами тяжелого металла (обычно наночастицами золота диаметром 5–15 нм). Как было описано ранее, ферменты, такие как хрен-пероксидаза или щелочная фосфатаза, обычно используются для катализа реакций, приводящих к образованию окрашенного или хемолюминесцентного продукта. Флуоресцентные молекулы можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной микроскопии.
Приложения
Применения иммуноокрашивания многочисленны, но чаще всего используются в клинической диагностике и лабораторных исследованиях. В клинической практике IHC применяется в гистопатологии для диагностики определенных типов рака на основе молекулярных маркеров. В лабораторной науке иммуноокрашивание может использоваться для различных целей, связанных с изучением наличия или отсутствия белка, его распределения в тканях, его субклеточной локализации, а также изменений в экспрессии или деградации белка.