Солтүстік блоттеу: ген экспрессиясын зерттеу әдісі
Northern blot
Солтүстік блоттинг (RNA блоттинг) – гендік экспрессияны зерттеуге арналған молекулалық биология әдісі. РНК анықтау, гель электрофорезі, гибридизация қарастырылады.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Молекулалық биология техникасы
Molecular biology technique
Солтүстік блот немесе РНК блоты – молекулалық биология зерттеулерінде ген экспрессиясын зерттеу үшін қолданылатын техника, ол үлгідегі РНК (немесе оқшауланған мРНК) анықтау арқылы жүзеге асырылады. Солтүстік блоттинг арқылы дифференциация және морфогенез кезінде, сондай-ақ аномальды немесе ауру жағдайларында ген экспрессиясының нақты деңгейін анықтау мүмкіндігі арқылы клетканың құрылымы мен функциясын қадағалауға болады. Солтүстік блоттинг РНК үлгілерін мөлшері бойынша бөлу үшін электрофорезді пайдалануды және нысаналық тізбектің бір бөлігімен немесе толығымен сәйкес келетін гибридтеу зондымен анықтауды қамтиды. Қатаң айтқанда, "солтүстік блот" термині РНК-ның электрофорездік гельден блот мембранасына капиллярлық көшірілуіне қатысты. Дегенмен, бүкіл процеске жиі солтүстік блоттинг деп аталады. Солтүстік блот техникасын 1977 жылы Стэнфорд университетінде Джеймс Алвайн, Дэвид Кемп және Джордж Старк әзірлеген. Солтүстік блоттинг өзінің атын биолог Эдвин Саузерннің атымен аталған алғашқы блоттинг техникасы – Оңтүстік блотқа ұқсастығынан алған. Басты айырмашылық – солтүстік блотта ДНК емес, РНК талданады.
The northern blot, or RNA blot, is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA (or isolated mRNA) in a sample. With northern blotting it is possible to observe cellular control over structure and function by determining the particular gene expression rates during differentiation and morphogenesis, as well as in abnormal or diseased conditions. Northern blotting involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size, and detection with a hybridization probe complementary to part of or the entire target sequence. Strictly speaking, the term 'northern blot' refers specifically to the capillary transfer of RNA from the electrophoresis gel to the blotting membrane. However, the entire process is commonly referred to as northern blotting. The northern blot technique was developed in 1977 by James Alwine, David Kemp, and George Stark at Stanford University. Northern blotting takes its name from its similarity to the first blotting technique, the Southern blot, named for biologist Edwin Southern. The major difference is that RNA, rather than DNA, is analyzed in the northern blot.
Процедура
Жалпы блоттинг әдісі РНК үлгілері гельдік электрофорез арқылы бөлінеді. Гельдердің нәзік болуы және зондтардың матрицаға енуге қабілетсіздігіне байланысты, өлшемдері бойынша бөлінген РНК үлгілері капиллярлық немесе вакуумдық блоттинг жүйесі арқылы нейлон мембранаға көшіріледі. Теріс зарядталған нуклеин қышқылдары үшін жоғары туыстыққа ие болғандықтан, оң зарядты нейлон мембранасы солтүстік блоттинг үшін ең тиімді болып табылады. Блоттингке қолданылатын трансфер буфері әдетте формамидті қамтиды, себебі ол зонд пен РНК арасындағы байланысу температурасын төмендетеді, соның салдарынан РНК ыдырауын тудыруы мүмкін жоғары температураның қажеттілігін жояды. РНК мембранаға көшірілгеннен кейін, ол UV сәулесі немесе жылу арқылы мембранамен ковалентті байланыс арқылы бекітіледі. Зонд белгіленгеннен кейін, ол мембранадағы РНК-мен гибридтеледі. Гибридтелудің тиімділігі мен ерекшелігіне иондық күш, тұтқырлық, дуплекс ұзындығы, сәйкес келмейтін негіз жұптары және негіз құрамы сияқты эксперименталдық жағдайлар әсер етеді. Зондтың нақты байланысқа түскенін және фондық сигналдардың пайда болуын болдырмау үшін мембрана жуылады. Гибридтік сигналдар рентген пленкасы арқылы анықталады және денситометрия арқылы мөлшерленеді. Солтүстік блотпен салыстыру үшін бақылау үшін микромассивтер немесе RT ПТР арқылы анықталғаннан кейін, қызығушылық тудыратын геннің өнімін көрсетпейтін үлгілерді пайдалануға болады. Гельдер этидий бромид (EtBr) арқылы боялып, БТҚ сапасы мен мөлшерін бақылау үшін ультракүлгін сәулесінде қарастырылады. Алынған фрагменттердің мөлшерін бақылау үшін РНК сатысы көбінесе үлгілермен бірге электрофорез гелінде жүргізіледі, бірақ жалпы РНК үлгілерінде рибосомалық суббірліктер өлшемдік маркерлер ретінде әрекет ете алады.
A general blotting procedure RNA samples are then separated by gel electrophoresis. Since the gels are fragile and the probes are unable to enter the matrix, the RNA samples, now separated by size, are transferred to a nylon membrane through a capillary or vacuum blotting system. A nylon membrane with a positive charge is the most effective for use in northern blotting since the negatively charged nucleic acids have a high affinity for them. The transfer buffer used for the blotting usually contains formamide because it lowers the annealing temperature of the probe RNA interaction, thus eliminating the need for high temperatures, which could cause RNA degradation. Once the RNA has been transferred to the membrane, it is immobilized through covalent linkage to the membrane by UV light or heat. After a probe has been labeled, it is hybridized to the RNA on the membrane. Experimental conditions that can affect the efficiency and specificity of hybridization include ionic strength, viscosity, duplex length, mismatched base pairs, and base composition. The membrane is washed to ensure that the probe has bound specifically and to prevent background signals from arising. The hybrid signals are then detected by X ray film and can be quantified by densitometry. To create controls for comparison in a northern blot, samples not displaying the gene product of interest can be used after determination by microarrays or RT PCR. The gels can be stained with ethidium bromide (EtBr) and viewed under UV light to observe the quality and quantity of RNA before blotting. An RNA ladder is often run alongside the samples on an electrophoresis gel to observe the size of fragments obtained but in total RNA samples the ribosomal subunits can act as size markers.
Зондтар
Солтүстік блоттингі үшін зондтар қызығушылық тудыратын РНК-ның толық немесе бір бөлігіне толықтырылатын нуклеин қышқылдарынан құралады. Олар ДНК, РНК немесе мақсатты тізбекке кемінде 25 толықтырылатын негіз бар олигонуклеотидтер болуы мүмкін. Зондтар радиоактивті изотоптармен (32P) немесе химилюминесценция арқылы таңбалануы керек, онда сілтілік фосфатаза немесе қызылқұмырсқа пероксидазасы (HRP) химиялық люминесцентті субстраттарды ыдыратып, анықтамалы жарық шығарады. Химилюминесцентті таңбалау екі тәсілмен жүзеге асырылуы мүмкін: зонд ферментке тіркеледі немесе зонд лигандпен (мысалы, биотин) таңбаланады, ал лиганд (мысалы, авидин немесе стрептавидин) ферментке (мысалы, HRP) тіркеледі. Бұл техника қатерлі жасушалардағы онкогендердің артық экспрессиялануын және ісікке қарсы гендердің төмендеуін «қалыпты» тіндермен салыстырғанда көрсету үшін қолданылады. Егер солтүстік блотта mRNA мөлшері артық болса, геннің зерттеушілерге белгілі екенін немесе жаңалық ашу үшін үлгінің тізбегін анықтауға болады. Микромассивтердің солтүстік блоттарға қарағанда артықшылығы – солтүстік блот әдетте бір немесе аздаған гендерді қарастырса, мыңдаған гендерді бір уақытта қарауға мүмкіндік береді.
Probes for northern blotting are composed of nucleic acids with a complementary sequence to all or part of the RNA of interest. They can be DNA, RNA, or oligonucleotides with a minimum of 25 complementary bases to the target sequence. The probes must be labelled either with radioactive isotopes (32P) or with chemiluminescence in which alkaline phosphatase or horseradish peroxidase (HRP) break down chemiluminescent substrates producing a detectable emission of light. The chemiluminescent labelling can occur in two ways: either the probe is attached to the enzyme, or the probe is labelled with a ligand (e. g. biotin) for which the ligand (e. g., avidin or streptavidin) is attached to the enzyme (e. g. HRP). The technique has been used to show overexpression of oncogenes and downregulation of tumor suppressor genes in cancerous cells when compared to 'normal' tissue, If an upregulated gene is observed by an abundance of mRNA on the northern blot the sample can then be sequenced to determine if the gene is known to researchers or if it is a novel finding. The advantage that microarrays have over northern blots is that thousands of genes can be visualized at a time, while northern blotting is usually looking at one or a small number of genes.
Кері солтүстік blot
Кейде зерттеушілер кері солтүстік блот деп аталатын процедураның бір түрін қолданады. Осы процедурада мембранаға бекітілген субстрат нуклеин қышқылы – оқшауланған ДНК фрагменттерінің жиынтығы, ал зонд – тінден алынып, радиоактивті белгіленген РНК болады. 1990 жылдардың соңы мен 2000 жылдардың басында кеңінен қолданысқа енген ДНК микромассивтерін пайдалану кері процедураға көбірек ұқсайды, себебі олар субстратқа бекітілген оқшауланған ДНК фрагменттерін және жасушалық РНК-дан жасалған зондпен гибридтеуді қамтиды. Осылайша, бастапқыда сирек болғанымен, кері процедура солтүстік талдаудың гендік экспрессияны анықтауға қалыптасуына мүмкіндік берді, онда организмдегі көптеген (немесе барлық) гендердің экспрессиясы қадағалануы мүмкін.
Researchers occasionally use a variant of the procedure known as the reverse northern blot. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored.