Флуоресценциялық спектроскопия: қағидалары мен қолданылуы

Кіріспе

Электромагниттік спектроскопияның түрі

Флуоресценттік спектроскопия (флюориметрия немесе спектрофлюорометрия деп те аталады) – үлгіден флуоресценцияны талдайтын электромагниттік спектроскопияның бір түрі. Ол, әдетте ультракүлгін сәуле болатын, жарық сәулесін пайдалануды қамтиды, ол белгілі бір қосылыстардың молекулаларындағы электрондарды қоздырып, оларды жарық шығаруға итермелейді; көбінесе, бірақ міндетті емес, көрінетін жарық. Толықтыратын әдіс – сіңіру спектроскопиясы. Жеке молекулалық флуоресценциялық спектроскопияның ерекше жағдайында, шығарылатын жарықтың қарқындылығының өзгеруі жеке флуорофорлардан немесе флуорофорлар жұбынан өлшенеді. Флуоресценцияны өлшейтін құрылғылар флюорометрлер деп аталады.

Теория

Молекулалардың әртүрлі энергия деңгейлері деп аталатын күйлері бар. Флуоресценциялық спектроскопия негізінен электрондық және тербеліс күйлерін зерттейді. Әдетте, зерттелетін нысанның негізгі электрондық күйі (төмен энергиялы күй) және жоғары энергиялы қозған электрондық күйі болады. Осы электрондық күйлердің әрқайсысында әртүрлі тербеліс күйлері кездеседі. Флуоресценция кезінде нысан фотон сіңіру арқылы негізгі электрондық күйінен қозған электрондық күйдегі әртүрлі тербеліс күйлерінің біріне өтеді. Басқа молекулалармен соқтығысу қозған молекуланың тербеліс энергиясын жоғалтуына алып келеді, осылайша ол қозған электрондық күйден ең төменгі тербеліс күйіне жетеді. Бұл процесс көбінесе Яблонски диаграммасымен көрсетіледі. Типик флуоресценттік (эмиссиялық) өлшеулерде қозу толқынының ұзындығы тұрақты болып, анықтау толқынының ұзындығы өзгертіледі, ал флуоресценттік қозу өлшеуінде анықтау толқынының ұзындығы тұрақты болып, қозу толқынының ұзындығы қызығушылық тудыратын аймақта өзгертіледі. Эмиссия картасы әртүрлі қозу толқын ұзындықтарында алынған эмиссия спектрлерін тіркеу және оларды біріктіру арқылы өлшенеді. Бұл үш өлшемді беттік деректер жиынтығы болып табылады: эмиссия қарқындылығы қозу және эмиссия толқын ұзындықтарының функциясы ретінде, және әдетте контурлық карта түрінде бейнеленеді.

Аспаптар

Құралдардың екі негізгі түрі бар: түсірілген жарық пен флуоресценттік жарықты бөліп көрсету үшін сүзгілерді пайдаланатын сүзгі флюорометрлері және түсірілген жарық пен флуоресценттік жарықты бөліп көрсету үшін дифракциялық торлы монохроматорларды пайдаланатын спектрофлюорометрлер. Екі түрде де келесі схема қолданылады: қоздыру көзінен шыққан жарық сүзгіден немесе монохроматордан өтіп, сынамаға түседі. Сынама жарықтың бір бөлігін сіңіреді, ал кейбір молекулалар флуоресценция жасайды. Флуоресценттік жарық барлық бағытта таралады. Бұл флуоресценттік жарықтың бір бөлігі екінші сүзгіден немесе монохроматордан өтіп, детекторға жетеді, ол әдетте түсетін жарық сәулесіне 90° бұрышпен орналастырылады, бұл детекторға жетуі мүмкін жіберілген немесе шағылысқан түсетін жарық тәуекелін азайтады. Қоздыру көздері ретінде әртүрлі жарық көздерін пайдалануға болады, соның ішінде лазерлер, жарықдиодтар (LED) және шамдар; әсіресе ксенон доғалары мен сынап буы шамдары. Лазер тек өте тар толқын ұзындығы диапазонында, әдетте 0,01 нм-ден төмен, жоғары сәулеленудің жарығын шығарады, бұл қоздыру монохроматорын немесе сүзгісін қажетсіз етеді. Бұл әдістің кемшілігі – лазердің толқын ұзындығын көп өзгерте алмайсыз. Сынап буы шамдары – желілік шамдар, яғни олар максималды толқын ұзындықтарына жақын жарық шығарады. Керісінше, ксенон доғасы 300–800 нм диапазонында шамамен тұрақты қарқындылығы бар үздіксіз эмиссиялық спектрге ие және 200 нм-ден жоғары өлшеулер үшін жеткілікті сәулелену қуатын қамтамасыз етеді. Флюорометрлерде сүзгілер және/немесе монохроматорлар қолданылуы мүмкін. Монохроматор реттелетін толқын ұзындығында және толеранттылықта жарық береді. Монохроматордың ең көп таралған түрі дифракциялық торды пайдаланады, яғни коллимацияланған жарық торға түседі және толқын ұзындығына байланысты әртүрлі бұрыштарда шығады. Монохроматорды қандай толқын ұзындығын өткізу керектігін таңдауға болады. Анизотропияны өлшеу үшін екі поляризациялық сүзгіні қосу қажет: біреуін қоздыру монохроматорынан немесе сүзгісінен кейін, екіншісін эмиссия монохроматорынан немесе сүзгісінен бұрын орналастырыңыз. Бұрын айтқанымыздай, флуоресценция көбінесе қоздыру жарығына қатысты 90° бұрышта өлшенеді. Бұл геометрия сенсорды 180° бұрыштағы қоздыру жарығының бағытында орналастырудың орнына, жіберілген қоздыру жарығының араласуын болдырмау үшін қолданылады. Монохроматордың ешқайсысы да идеалды емес және ол мақсатталғаннан басқа толқын ұзындығындағы жарықты, яғни шашыраған жарықты жібереді. Идеалды монохроматор тек белгіленген диапазондағы жарықты өткізеді және жоғары толқын ұзындығына тәуелсіз өткізуге ие болады. 90° бұрышта өлшеу кезінде тек сынамадан шашыраған жарық ғана шашыраған жарықтың себебі болады. Бұл сигнал мен шудың арақатынасын жақсартады және 180° геометриямен салыстырғанда анықтау шегін шамамен 10000 есе төмендетеді. Сонымен қатар, флуоресценцияны алдыңғы жағынан да өлшеуге болады, бұл көбінесе бұлыңғыр немесе мөлдір емес сынамалар үшін жасалады. Детектор бір арналы немесе көп арналы болуы мүмкін. Бір арналы детектор бір уақытта бір ғана толқын ұзындығының қарқындылығын анықтай алады, ал көп арналы детектор бір мезгілде барлық толқын ұзындықтарының қарқындылығын анықтайды, бұл эмиссиялық монохроматорды немесе сүзгіні қажетсіз етеді. Екі монохроматорлы және үздіксіз қоздыру жарық көзі бар әмбебап флюорометрлер қоздыру спектрін де, флуоресценция спектрін де тіркеуге мүмкіндік береді. Флуоресценция спектрлерін өлшеу кезінде қоздыру жарығының толқын ұзындығы тұрақты сақталады, әсіресе жоғары сіңіру толқын ұзындығында, ал эмиссиялық монохроматор спектрді сканерлейді. Қоздыру спектрлерін өлшеу үшін эмиссиялық сүзгі немесе монохроматор арқылы өтетін толқын ұзындығы тұрақты сақталады және қоздыру монохроматоры сканерленеді. Қоздыру спектрі әдетте сіңіру спектрімен сәйкес келеді, өйткені флуоресценция қарқындылығы сіңіруге пропорционалды.

Two general types of instruments exist: filter fluorometers that use filters to isolate the incident light and fluorescent light and spectrofluorometers that use diffraction grating monochromators to isolate the incident light and fluorescent light. Both types use the following scheme: the light from an excitation source passes through a filter or monochromator, and strikes the sample. A proportion of the incident light is absorbed by the sample, and some of the molecules in the sample fluoresce. The fluorescent light is emitted in all directions. Some of this fluorescent light passes through a second filter or monochromator and reaches a detector, which is usually placed at 90° to the incident light beam to minimize the risk of transmitted or reflected incident light reaching the detector. Various light sources may be used as excitation sources, including lasers, LED, and lamps; xenon arcs and mercury vapor lamps in particular. A laser only emits light of high irradiance at a very narrow wavelength interval, typically under 0.01 nm, which makes an excitation monochromator or filter unnecessary. The disadvantage of this method is that the wavelength of a laser cannot be changed by much. A mercury vapor lamp is a line lamp, meaning it emits light near peak wavelengths. By contrast, a xenon arc has a continuous emission spectrum with nearly constant intensity in the range from 300 800 nm and a sufficient irradiance for measurements down to just above 200 nm. Filters and/or monochromators may be used in fluorimeters. A monochromator transmits light of an adjustable wavelength with an adjustable tolerance. The most common type of monochromator utilizes a diffraction grating, that is, collimated light illuminates a grating and exits with a different angle depending on the wavelength. The monochromator can then be adjusted to select which wavelengths to transmit. For allowing anisotropy measurements, the addition of two polarization filters is necessary: One after the excitation monochromator or filter, and one before the emission monochromator or filter. As mentioned before, the fluorescence is most often measured at a 90° angle relative to the excitation light. This geometry is used instead of placing the sensor at the line of the excitation light at a 180° angle in order to avoid interference of the transmitted excitation light. No monochromator is perfect and it will transmit some stray light, that is, light with other wavelengths than the targeted. An ideal monochromator would only transmit light in the specified range and have a high wavelength independent transmission. When measuring at a 90° angle, only the light scattered by the sample causes stray light. This results in a better signal to noise ratio, and lowers the detection limit by approximately a factor 10000, when compared to the 180° geometry. Furthermore, the fluorescence can also be measured from the front, which is often done for turbid or opaque samples
The detector can either be single channeled or multichanneled. The single channeled detector can only detect the intensity of one wavelength at a time, while the multichanneled one detects the intensity of all wavelengths simultaneously, making the emission monochromator or filter unnecessary. The most versatile fluorimeters with dual monochromators and a continuous excitation light source can record both an excitation spectrum and a fluorescence spectrum. When measuring fluorescence spectra, the wavelength of the excitation light is kept constant, preferably at a wavelength of high absorption, and the emission monochromator scans the spectrum. For measuring excitation spectra, the wavelength passing through the emission filter or monochromator is kept constant and the excitation monochromator is scanning. The excitation spectrum generally is identical to the absorption spectrum as the fluorescence intensity is proportional to the absorption.

Деректерді талдау

Төмен концентрацияларда флуоресценция қарқындылығы, әдетте, флюорофордың концентрациясына пропорционалды болады. УФ/көрінетін спектроскопиядан өзгеше, стандартты, құрылғыға тәуелсіз спектрлерге оңай жете алмайсыз. Бірнеше факторлар спектрлерге әсер етеді және оларды бұрмалайды, ал «нағыз», яғни құрылғыдан тәуелсіз спектрлерге жету үшін түзетулер қажет. Бұрмалаудың әртүрлі түрлері құралға немесе сынамаға байланысты болып жіктеледі. Біріншіден, құралдан туындайтын бұрмалау қарастырылады. Бастапқыда, жарық көзінің қарқындылығы және толқын ұзындығының сипаттамалары әр тәжірибе кезінде және тәжірибелер арасында уақыт өте келе өзгереді. Сонымен қатар, ешбір шамның барлық толқын ұзындығында тұрақты қарқындылығы болмайды. Бұны түзету үшін, қоздыру монохроматизаторынан немесе сүзгіден кейін сәуле бөлігішті қолданып, жарықтың бір бөлігін анықтамалық детекторға бағыттауға болады. Сонымен қатар, монохроматизаторлар мен сүзгілердің берілу тиімділігін ескеру қажет, олар уақыт өте келе өзгеруі мүмкін. Монохроматизатордың берілу тиімділігі де толқын ұзындығына байланысты өзгереді. Сондықтан, қоздыру монохроматизаторынан немесе сүзгіден кейін қосымша анықтамалық детектор орнату керек. Детектордың флуоресценцияны қабылдауының пайыздық үлесі де жүйеге байланысты. Сонымен қатар, детектордың кванттық тиімділігі, яғни анықталатын фотондардың пайыздық үлесі, әртүрлі детекторларда, толқын ұзындығымен және уақытпен өзгереді, себебі детектор сөзсіз нашарлайды. Тағы екі мәселені қарастыру қажет: сәулеленуді бағыттауға қолданылатын оптика және сынама материалды ұстап тұру немесе сақтау құралы (куветка немесе кювет деп аталады). Көптеген УФ, көрінетін және ЖЖС өлшемдері үшін дәл кварц куветтерін пайдалану қажет. Екі жағдайда да, қызығушылық тудыратын толқын ұзындығы диапазонында салыстырмалы түрде аз сіңіретін материалдарды таңдау маңызды. Кварц өте қолайлы, себебі ол 200 нм-ден 2500 нм-ге дейін сәуле өткізеді; жоғары сапалы кварц тіпті 3500 нм-ге дейін сәуле өткізе алады, ал басқа материалдардың сіңіру қасиеттері сынамадағы флуоресценцияны жасыра алады. «Стандартты» спектр алу үшін осы құралдық факторлардың барлығын түзету – қиын процесс, ол тек қатаң қажет болған жағдайда ғана тәжірибеде қолданылады. Мұндай жағдайлар кванттық шығымды өлшеу кезінде немесе, мысалы, ең жоғары сәуле шығару қарқындылығына ие толқын ұзындығын анықтау кезінде туындауы мүмкін. Бұрын айтқанымыздай, бұрмалаулар сынамадан да пайда болады. Сондықтан, сынаманың кейбір аспектілерін де ескеру қажет. Біріншіден, фотодекомпозиция уақыт өте флуоресценция қарқындылығын төмендетуі мүмкін. Жарықтың шашырауы да ескерілуі тиіс. Бұл жағдайда шашыраудың ең маңызды түрлері – Рейли және Раман шашырауы. Рейли шашырауында шашыраған жарық түсуші жарықпен бірдей толқын ұзындығына ие, ал Раман шашырауында шашыраған жарық толқын ұзындығын әдетте ұзарту арқылы өзгертеді. Раман шашырауы – қоздырушы жарық тудырған виртуалды электрондық күйдің нәтижесі. Осы виртуалды күйден молекулалар тербеліс деңгейіне, негізгі тербеліс деңгейінен өзгеше тербеліс деңгейіне қайта оралуы мүмкін. Флуоресценция спектрлерінде ол әрқашан қоздыру толқын санына қатысты тұрақты толқын саны айырмасында көрінеді, мысалы, шыңы суда қоздыру жарығынан 3600 см-1 төмен толқын санында пайда болады. Еске алу керек басқа да аспектілер – ішкі сүзгі әсерлері. Бұған қайта сіңіру жатады. Қайта сіңірудің себебі – флюорофор сәуле шығаратын толқын ұзындығында басқа молекула немесе макромолекуланың бөлігі сіңіреді. Егер осылай болса, флюорофордың бір бөлігі немесе барлық фотондары қайтадан сіңірілуі мүмкін. Ішкі сүзгі әсерінің тағы бір түрі сіңіретін молекулалардың, флюорофорды қоса алғанда, жоғары концентрациясына байланысты пайда болады. Нәтижесінде, қоздыру жарығының қарқындылығы ерітіндіде тұрақты болмайды. Сәйкесінше, қоздыру жарығының аз ғана пайызы анықтамалық жүйеге жететін флюорофорларға жетеді. Ішкі сүзгі әсерлері сәулеленуші жарықтың спектрін және қарқындылығын өзгертеді, сондықтан оларды флуоресценттік жарықтың сәулелену спектрін талдағанда ескеру қажет.

At low concentrations the fluorescence intensity will generally be proportional to the concentration of the fluorophore. Unlike in UV/visible spectroscopy, ‘standard’, device independent spectra are not easily attained. Several factors influence and distort the spectra, and corrections are necessary to attain ‘true’, i. e. machine independent, spectra. The different types of distortions will here be classified as being either instrument or sample related. Firstly, the distortion arising from the instrument is discussed. As a start, the light source intensity and wavelength characteristics varies over time during each experiment and between each experiment. Furthermore, no lamp has a constant intensity at all wavelengths. To correct this, a beam splitter can be applied after the excitation monochromator or filter to direct a portion of the light to a reference detector. Additionally, the transmission efficiency of monochromators and filters must be taken into account. These may also change over time. The transmission efficiency of the monochromator also varies depending on wavelength. This is the reason that an optional reference detector should be placed after the excitation monochromator or filter. The percentage of the fluorescence picked up by the detector is also dependent upon the system. Furthermore, the detector quantum efficiency, that is, the percentage of photons detected, varies between different detectors, with wavelength and with time, as the detector inevitably deteriorates. Two other topics that must be considered include the optics used to direct the radiation and the means of holding or containing the sample material (called a cuvette or cell). For most UV, visible, and NIR measurements the use of precision quartz cuvettes is necessary. In both cases, it is important to select materials that have relatively little absorption in the wavelength range of interest. Quartz is ideal because it transmits from 200 nm 2500 nm; higher grade quartz can even transmit up to 3500 nm, whereas the absorption properties of other materials can mask the fluorescence from the sample. Correction of all these instrumental factors for getting a ‘standard’ spectrum is a tedious process, which is only applied in practice when it is strictly necessary. This is the case when measuring the quantum yield or when finding the wavelength with the highest emission intensity for instance. As mentioned earlier, distortions arise from the sample as well. Therefore, some aspects of the sample must be taken into account too. Firstly, photodecomposition may decrease the intensity of fluorescence over time. Scattering of light must also be taken into account. The most significant types of scattering in this context are Rayleigh and Raman scattering. Light scattered by Rayleigh scattering has the same wavelength as the incident light, whereas in Raman scattering the scattered light changes wavelength usually to longer wavelengths. Raman scattering is the result of a virtual electronic state induced by the excitation light. From this virtual state, the molecules may relax back to a vibrational level other than the vibrational ground state. In fluorescence spectra, it is always seen at a constant wavenumber difference relative to the excitation wavenumber e. g. the peak appears at a wavenumber 3600 cm−1 lower than the excitation light in water. Other aspects to consider are the inner filter effects. These include reabsorption. Reabsorption happens because another molecule or part of a macromolecule absorbs at the wavelengths at which the fluorophore emits radiation. If this is the case, some or all of the photons emitted by the fluorophore may be absorbed again. Another inner filter effect occurs because of high concentrations of absorbing molecules, including the fluorophore. The result is that the intensity of the excitation light is not constant throughout the solution. Resultingly, only a small percentage of the excitation light reaches the fluorophores that are visible for the detection system. The inner filter effects change the spectrum and intensity of the emitted light and they must therefore be considered when analysing the emission spectrum of fluorescent light.

Триптофан флуоресценциясы

Қиылған белоктың флуоресценциясы – жеке ароматты қалдықтардың флуоресценциясының қосындысы болып табылады. Қиылған белоктың ішкі флуоресценциялық эмиссиясының көп бөлігі триптофан қалдықтарының қоздырылуынан туындайды, сондай-ақ тирозин мен фенилаланиннің де эмиссиясы бар; бірақ дисульфидтік байланыстар да осы толқын ұзындығы диапазонында айқын сіңірілуге ие. Әдетте, триптофанның максималды сіңірілу толқын ұзындығы 280 нм-ге тең, ал эмиссия шыңы жергілікті ортаның полярлығына байланысты шамамен 300-ден 350 нм-ге дейін өзгеретін солватохромдық қасиетке ие. Сондықтан, белоктың флуоресценциясын белоктың конформациялық күйін диагностикалау үшін пайдалануға болады. Бұдан әрі, триптофан флуоресценциясына басқа қалдықтардың жақындығы күшті әсер етеді (мысалы, Asp немесе Glu сияқты жақын орналасқан протонды топтар Trp флуоресценциясын сөндіруі мүмкін). Сонымен қатар, триптофан мен басқа флуоресцентті аминқышқылдары арасында энергияның берілуі мүмкін, бұл талдауға әсер етеді, әсіресе Форстерлік қышқылдық тәсіл қолданылған жағдайларда. Триптофан салыстырмалы түрде сирек кездесетін аминқышқыл; көптеген белоктарда тек бір немесе бірнеше триптофан қалдықтары болады. Сондықтан триптофан флуоресценциясы триптофан қалдықтарының конформациялық күйін өте сезімтал өлшеуге мүмкіндік береді. Сыртқы зондтармен салыстырғандағы артықшылығы – белоктың өзі өзгеретін жоқ. Ішкі флуоресценцияны белок конформациясын зерттеу үшін қолдану, практикада триптофан қалдықтарының саны аз (немесе тек біреу ғана) болатын жағдайлармен шектеледі, себебі әрқайсысы әртүрлі жергілікті ортаға тап болады, бұл әртүрлі эмиссия спектрлерін тудырады. Триптофан – триптофанның микроортасының сипатын бағалау үшін қолданылатын маңызды ішкі флуоресцентті (аминқышқыл). Денатураторлар, беттік белсенді заттар немесе басқа амфифильді молекулалармен тәжірибелер жүргізген кезде триптофанның микроортасы өзгеруі мүмкін. Мысалы, егер "гидрофобтық" ядросында бір триптофан бар белок температураның жоғарылауымен денатурацияланса, қызылға қарай ығысқан эмиссия спектрі пайда болады. Бұл триптофанның сулы ортаға, гидрофобты белок ішкі ортасына емес, ашылуына байланысты. Керісінше, сулы еріткішке ұшыраған триптофанды қамтитын белокқа беттік белсенді зат қосылса, егер триптофан беттік белсенді заттың везикуласына немесе мицелласына енген болса, көкке қарай ығысқан эмиссия спектрі пайда болады. Триптофан жоқ белоктар флуороформен байланыстырылуы мүмкін. 295 нм толқын ұзындығында флуоресценциялық қоздыру кезінде триптофан эмиссиялық спектрі әлсіз тирозин мен фенилаланин флуоресценциясынан басым болады.

The fluorescence of a folded protein is a mixture of the fluorescence from individual aromatic residues. Most of the intrinsic fluorescence emissions of a folded protein are due to excitation of tryptophan residues, with some emissions due to tyrosine and phenylalanine; but disulfide bonds also have appreciable absorption in this wavelength range. Typically, tryptophan has a wavelength of maximum absorption of 280 nm and an emission peak that is solvatochromic, ranging from ca. 300 to 350 nm depending in the polarity of the local environment Hence, protein fluorescence may be used as a diagnostic of the conformational state of a protein. Furthermore, tryptophan fluorescence is strongly influenced by the proximity of other residues (i. e., nearby protonated groups such as Asp or Glu can cause quenching of Trp fluorescence). Also, energy transfer between tryptophan and the other fluorescent amino acids is possible, which would affect the analysis, especially in cases where the Förster acidic approach is taken. In addition, tryptophan is a relatively rare amino acid; many proteins contain only one or a few tryptophan residues. Therefore, tryptophan fluorescence can be a very sensitive measurement of the conformational state of individual tryptophan residues. The advantage compared to extrinsic probes is that the protein itself is not changed. The use of intrinsic fluorescence for the study of protein conformation is in practice limited to cases with few (or perhaps only one) tryptophan residues, since each experiences a different local environment, which gives rise to different emission spectra. Tryptophan is an important intrinsic fluorescent (amino acid), which can be used to estimate the nature of microenvironment of the tryptophan. When performing experiments with denaturants, surfactants or other amphiphilic molecules, the microenvironment of the tryptophan might change. For example, if a protein containing a single tryptophan in its 'hydrophobic' core is denatured with increasing temperature, a red shifted emission spectrum will appear. This is due to the exposure of the tryptophan to an aqueous environment as opposed to a hydrophobic protein interior. In contrast, the addition of a surfactant to a protein which contains a tryptophan which is exposed to the aqueous solvent will cause a blue shifted emission spectrum if the tryptophan is embedded in the surfactant vesicle or micelle. Proteins that lack tryptophan may be coupled to a fluorophore. With fluorescence excitation at 295 nm, the tryptophan emission spectrum is dominant over the weaker tyrosine and phenylalanine fluorescence.