Флуоресцентная спектроскопия: принципы и методы

Введение

Тип электромагнитной спектроскопии

Флуоресцентная спектроскопия (также известная как флюориметрия или спектрофлюорометрия) — это тип электромагнитной спектроскопии, который анализирует флуоресценцию образца. Она основана на использовании пучка света, как правило ультрафиолетового, для возбуждения электронов в молекулах определенных соединений, что приводит к испусканию света, обычно, но не обязательно, видимого. Дополнительным методом является абсорбционная спектроскопия. В частности, при одномолекулярной флуоресцентной спектроскопии измеряются колебания интенсивности испускаемого света от отдельных флуорофоров или пар флуорофоров. Приборы для измерения флуоресценции называются флюорометрами.

Теория

Молекулы имеют различные состояния, называемые энергетическими уровнями. Флуоресцентная спектроскопия в основном изучает электронные и колебательные состояния. Обычно исследуемый объект представляет интерес в своем основном электронном состоянии (состояние с низкой энергией) и возбужденном электронном состоянии с более высокой энергией. В каждом из этих электронных состояний существует ряд колебательных состояний. При флуоресценции объект сначала возбуждается, поглощая фотон, из основного электронного состояния в одно из колебательных состояний возбужденного электронного состояния. Столкновения с другими молекулами приводят к потере возбужденной молекулой колебательной энергии до достижения самого нижнего колебательного состояния возбужденного электронного состояния. Этот процесс часто визуализируется с помощью диаграммы Яблонского. При типичном флуоресцентном (эмиссионном) измерении фиксируется длина волны возбуждения, а длина волны детектирования изменяется, в то время как при измерении флуоресцентного возбуждения фиксируется длина волны детектирования, а длина волны возбуждения изменяется в интересующем диапазоне. Карта эмиссии измеряется путем записи спектров эмиссии, полученных при различных длинах волн возбуждения, и их объединения. Это трехмерный набор данных, представляющий интенсивность эмиссии как функцию длин волн возбуждения и эмиссии, и обычно отображается в виде контурной карты.

Инструментовка

Существует два основных типа приборов: фильтрофлюорометры, использующие фильтры для выделения падающего и флуоресцентного света, и спектрофлюорометры, использующие дифракционные решетчатые монохроматоры для выделения падающего и флуоресцентного света. Оба типа используют следующую схему: свет от источника возбуждения проходит через фильтр или монохроматор и воздействует на образец. Определенная часть падающего света поглощается образцом, а некоторые молекулы в образце флуоресцируют. Флуоресцентный свет излучается во всех направлениях. Часть этого флуоресцентного света проходит через второй фильтр или монохроматор и достигает детектора, который обычно располагается под углом 90° к падающему лучу света, чтобы минимизировать риск попадания проходящего или отраженного падающего света на детектор. В качестве источников возбуждения могут использоваться различные источники света, включая лазеры, светодиоды и лампы; в частности, ксеноновые дуги и ртутные лампы. Лазер излучает свет высокой интенсивности только в очень узком интервале длин волн, обычно менее 0,01 нм, что делает монохроматор или фильтр возбуждения ненужными. Недостатком этого метода является то, что длину волны лазера сложно существенно изменить. Ртутная лампа является линейным источником, то есть излучает свет вблизи пиковых длин волн. В отличие от нее, ксеноновая дуга имеет непрерывный спектр излучения с почти постоянной интенсивностью в диапазоне от 300 до 800 нм и достаточной интенсивностью для измерений до чуть выше 200 нм. В флюорометрах могут использоваться фильтры и/или монохроматоры. Монохроматор пропускает свет с регулируемой длиной волны с регулируемой шириной полосы пропускания. Наиболее распространенный тип монохроматора использует дифракционную решетку, то есть коллимированный свет освещает решетку и выходит под другим углом в зависимости от длины волны. Монохроматор можно настроить для выбора пропускаемых длин волн. Для измерения анизотропии необходимо добавление двух поляризационных фильтров: один после монохроматора или фильтра возбуждения, а другой перед монохроматором или фильтром излучения. Как упоминалось ранее, флуоресценция чаще всего измеряется под углом 90° относительно возбуждающего света. Эта геометрия используется вместо размещения детектора на линии возбуждающего света под углом 180°, чтобы избежать интерференции проходящего возбуждающего света. Ни один монохроматор не идеален и пропускает некоторое количество паразитного света, то есть света с другими длинами волн, чем целевая. Идеальный монохроматор пропускал бы свет только в заданном диапазоне и имел бы высокую, не зависящую от длины волны, пропускную способность. При измерении под углом 90° паразитный свет вызывается только светом, рассеянным образцом. Это приводит к улучшению отношения сигнал/шум и снижает предел обнаружения примерно в 10000 раз по сравнению с геометрией 180°. Кроме того, флуоресценцию можно измерять и фронтально, что часто делается для мутных или непрозрачных образцов. Детектор может быть одноканальным или многоканальным. Одноканальный детектор может определять интенсивность только одной длины волны за раз, в то время как многоканальный детектор определяет интенсивность всех длин волн одновременно, что делает монохроматор или фильтр излучения ненужными. Наиболее универсальные флюорометры с двумя монохроматорами и источником света непрерывного возбуждения могут регистрировать как спектр возбуждения, так и спектр флуоресценции. При измерении спектров флуоресценции длина волны возбуждающего света поддерживается постоянной, предпочтительно на длине волны с высоким поглощением, и монохроматор излучения сканирует спектр. Для измерения спектров возбуждения длина волны, проходящая через фильтр или монохроматор излучения, поддерживается постоянной, а монохроматор возбуждения сканирует. Спектр возбуждения обычно идентичен спектру поглощения, поскольку интенсивность флуоресценции пропорциональна поглощению.

Two general types of instruments exist: filter fluorometers that use filters to isolate the incident light and fluorescent light and spectrofluorometers that use diffraction grating monochromators to isolate the incident light and fluorescent light. Both types use the following scheme: the light from an excitation source passes through a filter or monochromator, and strikes the sample. A proportion of the incident light is absorbed by the sample, and some of the molecules in the sample fluoresce. The fluorescent light is emitted in all directions. Some of this fluorescent light passes through a second filter or monochromator and reaches a detector, which is usually placed at 90° to the incident light beam to minimize the risk of transmitted or reflected incident light reaching the detector. Various light sources may be used as excitation sources, including lasers, LED, and lamps; xenon arcs and mercury vapor lamps in particular. A laser only emits light of high irradiance at a very narrow wavelength interval, typically under 0.01 nm, which makes an excitation monochromator or filter unnecessary. The disadvantage of this method is that the wavelength of a laser cannot be changed by much. A mercury vapor lamp is a line lamp, meaning it emits light near peak wavelengths. By contrast, a xenon arc has a continuous emission spectrum with nearly constant intensity in the range from 300 800 nm and a sufficient irradiance for measurements down to just above 200 nm. Filters and/or monochromators may be used in fluorimeters. A monochromator transmits light of an adjustable wavelength with an adjustable tolerance. The most common type of monochromator utilizes a diffraction grating, that is, collimated light illuminates a grating and exits with a different angle depending on the wavelength. The monochromator can then be adjusted to select which wavelengths to transmit. For allowing anisotropy measurements, the addition of two polarization filters is necessary: One after the excitation monochromator or filter, and one before the emission monochromator or filter. As mentioned before, the fluorescence is most often measured at a 90° angle relative to the excitation light. This geometry is used instead of placing the sensor at the line of the excitation light at a 180° angle in order to avoid interference of the transmitted excitation light. No monochromator is perfect and it will transmit some stray light, that is, light with other wavelengths than the targeted. An ideal monochromator would only transmit light in the specified range and have a high wavelength independent transmission. When measuring at a 90° angle, only the light scattered by the sample causes stray light. This results in a better signal to noise ratio, and lowers the detection limit by approximately a factor 10000, when compared to the 180° geometry. Furthermore, the fluorescence can also be measured from the front, which is often done for turbid or opaque samples
The detector can either be single channeled or multichanneled. The single channeled detector can only detect the intensity of one wavelength at a time, while the multichanneled one detects the intensity of all wavelengths simultaneously, making the emission monochromator or filter unnecessary. The most versatile fluorimeters with dual monochromators and a continuous excitation light source can record both an excitation spectrum and a fluorescence spectrum. When measuring fluorescence spectra, the wavelength of the excitation light is kept constant, preferably at a wavelength of high absorption, and the emission monochromator scans the spectrum. For measuring excitation spectra, the wavelength passing through the emission filter or monochromator is kept constant and the excitation monochromator is scanning. The excitation spectrum generally is identical to the absorption spectrum as the fluorescence intensity is proportional to the absorption.

Анализ данных

При низких концентрациях интенсивность флуоресценции обычно пропорциональна концентрации флуорофора. В отличие от УФ/видимой спектроскопии, получение «стандартных» спектров, не зависящих от прибора, затруднено. На спектры влияют и искажают несколько факторов, и для получения «истинных», то есть независимых от прибора, спектров необходимы корректировки. Различные типы искажений будут классифицироваться как связанные с прибором или с образцом. Прежде всего, рассмотрим искажения, возникающие из-за прибора. Для начала, интенсивность и спектральные характеристики источника света меняются со временем в течение каждого эксперимента и между экспериментами. Кроме того, ни одна лампа не имеет постоянной интенсивности на всех длинах волн. Для коррекции этого после возбуждающего монохроматора или фильтра можно применить разделитель луча, чтобы направить часть света на опорный детектор. Кроме того, необходимо учитывать эффективность пропускания монохроматоров и фильтров. Она также может меняться со временем. Эффективность пропускания монохроматора также зависит от длины волны. Именно поэтому после возбуждающего монохроматора или фильтра следует разместить дополнительный опорный детектор. Доля флуоресценции, регистрируемая детектором, также зависит от системы. Кроме того, квантовая эффективность детектора, то есть процент обнаруженных фотонов, варьируется между разными детекторами, в зависимости от длины волны и со временем, поскольку детектор неизбежно деградирует. Другими двумя важными аспектами являются оптика, используемая для направления излучения, и средства для удержания или размещения образца (называемые кюветой или ячейкой). Для большинства измерений в УФ-, видимом и ближнем ИК-диапазонах необходимо использовать прецизионные кварцевые кюветы. В обоих случаях важно выбирать материалы с относительно небольшим поглощением в интересующем диапазоне длин волн. Кварц идеален, поскольку он прозрачен в диапазоне от 200 нм до 2500 нм; кварц более высокого качества может быть прозрачным даже до 3500 нм, в то время как поглотительные свойства других материалов могут маскировать флуоресценцию образца. Коррекция всех этих инструментальных факторов для получения «стандартного» спектра — трудоемкий процесс, который применяется на практике только при строгой необходимости. Это происходит, например, при измерении квантового выхода или при определении длины волны с максимальной интенсивностью излучения. Как упоминалось ранее, искажения возникают и из-за самого образца. Поэтому необходимо учитывать и некоторые аспекты образца. Во-первых, фотодекомпозиция может со временем снижать интенсивность флуоресценции. Также необходимо учитывать рассеяние света. Наиболее значимыми типами рассеяния в данном контексте являются рассеяние Рэлея и рассеяние Рамана. Свет, рассеянный рассеянием Рэлея, имеет ту же длину волны, что и падающий свет, в то время как в рассеянии Рамана рассеянный свет меняет длину волны, обычно увеличивая ее. Рамановское рассеяние является результатом виртуального электронного состояния, индуцированного возбуждающим светом. Из этого виртуального состояния молекулы могут релаксировать обратно на вибрационный уровень, отличный от основного вибрационного состояния. В спектрах флуоресценции оно всегда наблюдается при постоянной разнице волновых чисел относительно волнового числа возбуждения, например, пик появляется при волновом числе на 3600 см-1 ниже, чем волновое число возбуждающего света в воде. Другие аспекты, которые следует учитывать, — это эффекты внутреннего фильтра. К ним относится реабсорбция. Реабсорбция происходит, потому что другая молекула или часть макромолекулы поглощает на длинах волн, на которых флуорофор излучает. В этом случае некоторые или все фотоны, излучаемые флуорофором, могут быть поглощены повторно. Другой эффект внутреннего фильтра возникает из-за высокой концентрации поглощающих молекул, включая сам флуорофор. В результате интенсивность возбуждающего света не является постоянной по всему раствору. Следовательно, только небольшой процент возбуждающего света достигает флуорофоров, видимых для системы обнаружения. Эффекты внутреннего фильтра изменяют спектр и интенсивность излучаемого света, поэтому их необходимо учитывать при анализе спектра флуоресцентного излучения.

At low concentrations the fluorescence intensity will generally be proportional to the concentration of the fluorophore. Unlike in UV/visible spectroscopy, ‘standard’, device independent spectra are not easily attained. Several factors influence and distort the spectra, and corrections are necessary to attain ‘true’, i. e. machine independent, spectra. The different types of distortions will here be classified as being either instrument or sample related. Firstly, the distortion arising from the instrument is discussed. As a start, the light source intensity and wavelength characteristics varies over time during each experiment and between each experiment. Furthermore, no lamp has a constant intensity at all wavelengths. To correct this, a beam splitter can be applied after the excitation monochromator or filter to direct a portion of the light to a reference detector. Additionally, the transmission efficiency of monochromators and filters must be taken into account. These may also change over time. The transmission efficiency of the monochromator also varies depending on wavelength. This is the reason that an optional reference detector should be placed after the excitation monochromator or filter. The percentage of the fluorescence picked up by the detector is also dependent upon the system. Furthermore, the detector quantum efficiency, that is, the percentage of photons detected, varies between different detectors, with wavelength and with time, as the detector inevitably deteriorates. Two other topics that must be considered include the optics used to direct the radiation and the means of holding or containing the sample material (called a cuvette or cell). For most UV, visible, and NIR measurements the use of precision quartz cuvettes is necessary. In both cases, it is important to select materials that have relatively little absorption in the wavelength range of interest. Quartz is ideal because it transmits from 200 nm 2500 nm; higher grade quartz can even transmit up to 3500 nm, whereas the absorption properties of other materials can mask the fluorescence from the sample. Correction of all these instrumental factors for getting a ‘standard’ spectrum is a tedious process, which is only applied in practice when it is strictly necessary. This is the case when measuring the quantum yield or when finding the wavelength with the highest emission intensity for instance. As mentioned earlier, distortions arise from the sample as well. Therefore, some aspects of the sample must be taken into account too. Firstly, photodecomposition may decrease the intensity of fluorescence over time. Scattering of light must also be taken into account. The most significant types of scattering in this context are Rayleigh and Raman scattering. Light scattered by Rayleigh scattering has the same wavelength as the incident light, whereas in Raman scattering the scattered light changes wavelength usually to longer wavelengths. Raman scattering is the result of a virtual electronic state induced by the excitation light. From this virtual state, the molecules may relax back to a vibrational level other than the vibrational ground state. In fluorescence spectra, it is always seen at a constant wavenumber difference relative to the excitation wavenumber e. g. the peak appears at a wavenumber 3600 cm−1 lower than the excitation light in water. Other aspects to consider are the inner filter effects. These include reabsorption. Reabsorption happens because another molecule or part of a macromolecule absorbs at the wavelengths at which the fluorophore emits radiation. If this is the case, some or all of the photons emitted by the fluorophore may be absorbed again. Another inner filter effect occurs because of high concentrations of absorbing molecules, including the fluorophore. The result is that the intensity of the excitation light is not constant throughout the solution. Resultingly, only a small percentage of the excitation light reaches the fluorophores that are visible for the detection system. The inner filter effects change the spectrum and intensity of the emitted light and they must therefore be considered when analysing the emission spectrum of fluorescent light.

Флуоресценция триптофана

Флуоресценция сложенного белка представляет собой смесь флуоресценции отдельных ароматических остатков. Большинство собственных флуоресцентных эмиссий сложенного белка обусловлены возбуждением остатков триптофана, с некоторыми эмиссиями, возникающими от тирозина и фенилаланина; однако дисульфидные связи также обладают значительным поглощением в этом диапазоне длин волн. Обычно триптофан имеет длину волны максимального поглощения 280 нм и пик эмиссии, который является сольватохромным, изменяясь примерно от 300 до 350 нм в зависимости от полярности локальной среды. Следовательно, флуоресценцию белка можно использовать для диагностики конформационного состояния белка. Кроме того, на флуоресценцию триптофана сильно влияет близость других остатков (например, находящиеся поблизости протонированные группы, такие как Asp или Glu, могут вызывать гашение флуоресценции Trp). Также возможен перенос энергии между триптофаном и другими флуоресцентными аминокислотами, что повлияет на анализ, особенно при использовании кислотного подхода Форстера. Триптофан является относительно редкой аминокислотой; многие белки содержат только один или несколько остатков триптофана. Поэтому флуоресценция триптофана может быть очень чувствительным измерением конформационного состояния отдельных остатков триптофана. Преимущество перед внешними зондами заключается в том, что сам белок не изменяется. Практическое применение внутренней флуоресценции для изучения конформации белка ограничено случаями с небольшим количеством (или, возможно, только одним) остатком триптофана, поскольку каждый находится в различной локальной среде, что приводит к различным спектрам эмиссии. Триптофан является важным собственным флуоресцентным (аминокислотой), который можно использовать для оценки природы микроокружения триптофана. При проведении экспериментов с денатурирующими веществами, поверхностно-активными веществами или другими амфифильными молекулами микроокружение триптофана может изменяться. Например, если белок, содержащий один триптофан в своем "гидрофобном" ядре, денатурируется при повышении температуры, появится спектр эмиссии со сдвигом в красную область. Это связано с тем, что триптофан подвергается воздействию водной среды, в отличие от гидрофобного внутреннего пространства белка. Напротив, добавление поверхностно-активного вещества к белку, содержащему триптофан, экспонированный в водном растворителе, вызовет спектр эмиссии со сдвигом в синюю область, если триптофан встроен в везикулу или мицеллу поверхностно-активного вещества. Белки, не содержащие триптофан, могут быть конъюгированы с флуорофором. При возбуждении флуоресценции на 295 нм спектр эмиссии триптофана доминирует над более слабой флуоресценцией тирозина и фенилаланина.

The fluorescence of a folded protein is a mixture of the fluorescence from individual aromatic residues. Most of the intrinsic fluorescence emissions of a folded protein are due to excitation of tryptophan residues, with some emissions due to tyrosine and phenylalanine; but disulfide bonds also have appreciable absorption in this wavelength range. Typically, tryptophan has a wavelength of maximum absorption of 280 nm and an emission peak that is solvatochromic, ranging from ca. 300 to 350 nm depending in the polarity of the local environment Hence, protein fluorescence may be used as a diagnostic of the conformational state of a protein. Furthermore, tryptophan fluorescence is strongly influenced by the proximity of other residues (i. e., nearby protonated groups such as Asp or Glu can cause quenching of Trp fluorescence). Also, energy transfer between tryptophan and the other fluorescent amino acids is possible, which would affect the analysis, especially in cases where the Förster acidic approach is taken. In addition, tryptophan is a relatively rare amino acid; many proteins contain only one or a few tryptophan residues. Therefore, tryptophan fluorescence can be a very sensitive measurement of the conformational state of individual tryptophan residues. The advantage compared to extrinsic probes is that the protein itself is not changed. The use of intrinsic fluorescence for the study of protein conformation is in practice limited to cases with few (or perhaps only one) tryptophan residues, since each experiences a different local environment, which gives rise to different emission spectra. Tryptophan is an important intrinsic fluorescent (amino acid), which can be used to estimate the nature of microenvironment of the tryptophan. When performing experiments with denaturants, surfactants or other amphiphilic molecules, the microenvironment of the tryptophan might change. For example, if a protein containing a single tryptophan in its 'hydrophobic' core is denatured with increasing temperature, a red shifted emission spectrum will appear. This is due to the exposure of the tryptophan to an aqueous environment as opposed to a hydrophobic protein interior. In contrast, the addition of a surfactant to a protein which contains a tryptophan which is exposed to the aqueous solvent will cause a blue shifted emission spectrum if the tryptophan is embedded in the surfactant vesicle or micelle. Proteins that lack tryptophan may be coupled to a fluorophore. With fluorescence excitation at 295 nm, the tryptophan emission spectrum is dominant over the weaker tyrosine and phenylalanine fluorescence.