Протеомдық зерттеулер: ақуыздың кең көлемді талдауы

Протеомика – ірі масштабты ақуыз зерттеуі. Ақуыздардың құрылысы, функциялары, ДНК және иммунитеттегі рөлі туралы біліңіз. 🔬🧬

18 мин оқу

100%

Дереккөз: Proteomics — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Протеиндерді ірі көлемде зерттеу. Proteomics журналы

Протеомика – протеиндерді ірі көлемде зерттеу саласы. Протеиндер – тірі организмдердің маңызды құрауы, олардың көптеген функциялары бар, мысалы, бұлшық тіндерінің құрылымдық талшықтарын қалыптастыру, тамақты ферменттік қорыту, ДНК-ның синтезі мен көшірмесін жасау. Сонымен қатар, организмді инфекциядан қорғайтын антиденелер және денеге маңызды сигналдар жіберетін гормондар да протеиндерге жатады. Протеом – организм немесе жүйе өндіретін немесе өзгертетін барлық протеиндердің жиынтығы. Протеомика протеиндердің санының үнемі артуын анықтауға мүмкіндік береді. Бұл уақытқа, нақты талаптарға немесе жасушаның немесе организмнің басынан өткен стресске байланысты өзгереді. Протеомика – түрлі геномдық жобалардан, соның ішінде Адам геномдық жобасынан үлкен пайда көрген салааралық ғылым. Ол протеомдарды протеин құрамының, құрылымының және активтілігінің жалпы деңгейінде зерттеуді қамтиды және функционалды геномиканың маңызды бөлігі болып табылады. Протеомика көбінесе протеиндер мен протеомдардың ірі көлемдегі тәжірибелік талдауын білдіреді, бірақ көбінесе протеин тазарту және массалық спектрометрияға қатысты қолданылады. Шындығында, массалық спектрометрия – миллиондаған жасушалардан тұратын үлкен үлгілерде де, жеке жасушаларда да протеомдарды талдаудың ең қуатты әдісі.

Тарих және этимология

Ақуыздарды зерттеу, оны протеомика деп санауға болатын, 1975 жылы екі өлшемді гель енгізілгеннен кейін және Escherichia coli бактериясының ақуыздарының картасы жасалғаннан кейін басталды. Протеом – «ақуыз» және «геном» сөздерінің қосындысы. Бұл терминді 1994 жылы сол кездегі Ph. D студенті Марк Уилкинс, ал 1995 жылы алғашқы арнайы протеомика зертханасын құрған Маккуарри университетінде ұсынды.

Мәселе күрделілігі

Геномдық және транскриптомикалық зерттеулерден кейін протеомика биологиялық жүйелерді зерттеудің келесі қадамы болып табылады. Ол геномдық зерттеуден қиынрақ, себебі организмнің геномы көбінесе тұрақты болады, ал протеомдар клеткадан клеткаға және уақыт өте келе өзгеріп отырады. Әртүрлі гендер әртүрлі жасуша түрлерінде экспрессияланады, демек жасушада өндірілетін негізгі ақуыздар жиынтығын анықтау қажет. Бұрын осы құбылыс РНК талдауы арқылы бағаланды, бірақ ол ақуыздың мөлшерімен сәйкес келмейтіні анықталды. Қазір мРНК әрқашан ақуызға аударылмайтыны белгілі, және белгілі бір мРНК мөлшеріне шаққанда өндірілетін ақуыз мөлшері, оның қай геннен транскрипцияланғанына және жасушаның физиологиялық күйіне байланысты. Протеомика ақуыздың бар екенін растайды және оның мөлшерін тікелей өлшейді.

Аудармадан кейінгі өзгерістер

МРНК-дан аударма ғана емес, сонымен қатар көптеген белоктар аудармадан кейін кең ауқымды химиялық өзгерістерге ұшырайды. Ең көп таралған және кеңінен зерттелген аудармадан кейінгі модификациялар – фосфорилирлеу және гликозилирлеу. Осы аудармадан кейінгі модификациялардың көптегені белоктың функциясы үшін өте маңызды.

Фосфорилирлеу

Мұндай өзгерістердің бірі – фосфорилдану, ол жасуша сигналдау процесінде көптеген ферменттер мен құрылымдық ақуыздарда жүзеге асады. Белгілі бір аминқышқылдарына – көбінесе серин және треонинге серин-треонин киназалары арқылы, немесе сирек кездесетін жағдайларда тирозинге тирозин киназалары арқылы фосфат тобының қосылуы нәтижесінде ақуыз фосфорилданған доменді танитын басқа ақуыздардың нақты жиынтығымен байланысуға немесе өзара әрекеттесуге бейім болады. Ақуыз фосфорилдану – ең көп зерттелген ақуыз модификацияларының бірі болғандықтан, көптеген "протеомикалық" зерттеулер нақты жасуша немесе тіндердегі, нақты жағдайларда фосфорилданған ақуыздар жиынтығын анықтауға бағытталған. Бұл ғалымға сол сәтте белсенді болуы мүмкін сигналдық жолдар туралы ақпарат береді.

Убиквитинация

Убиквитин – бұл кішкентай ақуыз, ол E3 убиквитин лигазалары деп аталатын ферменттер арқылы белгілі бір ақуыз субстраттарына қосылуы мүмкін. Қай ақуыздардың полиубиквитинацияланғанын анықтау, ақуыз жолдарының қалай реттелетінін түсінуге көмектеседі. Сондықтан, бұл қосымша "протеомдық" зерттеудің бір түрі. Сол сияқты, зерттеуші әрбір лигазаның қай субстраттарды убиквитиндейтінін анықтағаннан кейін, нақты бір жасуша түрінде экспрессияланатын лигазалар жиынтығын анықтау да пайдалы.

Қосымша өзгерістер

Фосфорилдану мен убиквитинациядан басқа, ақуыздар (басқаларының ішінде) метилирлеуге, ацетилдеуге, гликозилдеуге, тотығуға және нитрозилдеуге түсуі мүмкін. Кейбір ақуыздар осы модификациялардың бәрінен де өтеді, көбінесе уақытқа байланысты комбинацияларда. Бұл ақуыз құрылымын және функциясын зерттеудегі мүмкін болатын күрделілікті көрсетеді.

Әр түрлі белоктар әр түрлі жағдайда жасалады

Жасуша әр түрлі уақытта немесе әр түрлі жағдайларда, мысалы, даму кезінде, жасушалық дифференциацияда, жасушалық циклда немесе канцерогенезде әртүрлі ақуыздар жиынтығын өндіре алады. Бұған қоса, протеомның күрделілігін арттыратындай, көптеген ақуыздар кең ауқымды пост-аудармалық модификацияларға ұшырай алады. Сондықтан, "протеомика" зерттеуі, тіпті зерттеу тақырыбы шектеулі болса да, өте тез күрделі болуы мүмкін. Егер белгілі бір қатерлі ісік түрі үшін биомаркер ізделіп жатса, протеомика ғалымы шатасушы факторларды азайту және эксперименталдық қателіктерді ескеру үшін көптеген қатерлі ісік науқастарынан алынған қан сарысуының бірнеше үлгісін зерттеуге көшуі мүмкін. Осылайша, протеомның динамикалық күрделілігін ескеру үшін кейде күрделі эксперименталдық жобалар қажет болады.

Белоктарды зерттеу әдістері

Протеомикада ақуыздарды зерттеудің әр түрлі әдістері бар. Жалпы алғанда, ақуыздар антиденелер (иммуноанализдер), электрофоретикалық бөлу немесе массалық спектрометрия қолдану арқылы анықталады. Егер күрделі биологиялық үлгі талданып жатса, мөлшерлік нүктелі дақ талдауында (QDB) өте нақты антидене қолданылуы керек, немесе анықтау кезеңінен бұрын биохимиялық бөлу жасалуы керек, себебі үлгіде дәл анықтау және сандық бағалау үшін тым көп аналиттер бар.

Противоденелермен ақуызды анықтау (иммуноталдау)

Белгілі бір белоктарға немесе олардың өзгертілген түрлеріне қарсы антиденелер биохимия және жасуша биологиясы саласындағы зерттеулерде қолданылып келеді. Бұл – қазіргі молекулалық биологтар ең көп пайдаланатын құралдардың бірі. Белоктарды анықтау үшін антиденелерді қолданатын бірнеше арнайы техникалар мен протоколдар бар. Ферменттік иммуносорбенттік талдау (ELISA) ондаған жылдар бойы үлгілердегі белоктарды анықтау және оларды сандық өлшеу үшін пайдаланылып келеді. Вестерн-блот жеке белоктарды анықтау және оларды сандық түрде бағалау үшін қолданылуы мүмкін, онда алдымен SDS-PAGE арқылы күрделі белок қоспасы бөлінеді, содан кейін антидене көмегімен қажетті белок анықталады. Өзгертілген белоктарды сол өзгеріске арналған антиденені жасау арқылы зерттеуге болады. Мысалы, кейбір антиденелер тек тирозин фосфорилданған белоктарды ғана таниды, олар фосфоспецификалық антиденелер деп аталады. Сондай-ақ, басқа да өзгерістерге арналған антиденелер де бар. Оларды қызығушылық тудыратын өзгеріске ұшыраған белоктар жиынтығын анықтау үшін пайдалануға болады. Иммуноталдауды рекомбинанттық иммуноглобулин туындыларын немесе жоғары антигендік белгілілігі үшін таңдалған синтетикалық белок мүсіндерін қолдана отырып жүргізуге болады. Мұндай байланыстырғыштарға бір доменді антидене фрагменттері (наноденелер), жобаланған анкирин қайталамалы белоктар (DARPins) және аптамерлер жатады. Ауруды молекулалық деңгейде анықтау ерте диагностика мен емдеудегі жаңа революцияны қозғап отыр. Бұл саладағы қиындық – ерте диагностика үшін белок биомаркерлері өте аз мөлшерде болуы мүмкін. Дәстүрлі иммуноталдау технологиясымен анықтаудың төменгі шегі – фемтомолярдың жоғарғы диапазоны (10−13 M). Цифрлық иммуноталдау технологиясы анықтау сезімталдығын үш есеге арттырып, атомолярлық диапазонға (10−16 M) жеткізді. Бұл мүмкіндік диагностика және терапия саласында жаңа жетістіктерге жол аша алады, бірақ мұндай технологиялар тиімді күнделікті қолдануға ыңғайсыз, қолмен орындалатын процедураларға тоғыстырылған.

Antibodies to particular proteins, or their modified forms, have been used in biochemistry and cell biology studies. These are among the most common tools used by molecular biologists today. There are several specific techniques and protocols that use antibodies for protein detection. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) has been used for decades to detect and quantitatively measure proteins in samples. The western blot may be used for detection and quantification of individual proteins, where in an initial step, a complex protein mixture is separated using SDS PAGE and then the protein of interest is identified using an antibody. Modified proteins may be studied by developing an antibody specific to that modification. For example, some antibodies only recognize certain proteins when they are tyrosine phosphorylated, they are known as phospho specific antibodies. Also, there are antibodies specific to other modifications. These may be used to determine the set of proteins that have undergone the modification of interest. Immunoassays can also be carried out using recombinantly generated immunoglobulin derivatives or synthetically designed protein scaffolds that are selected for high antigen specificity. Such binders include single domain antibody fragments (Nanobodies), designed ankyrin repeat proteins (DARPins) and aptamers. Disease detection at the molecular level is driving the emerging revolution of early diagnosis and treatment. A challenge facing the field is that protein biomarkers for early diagnosis may be present in very low abundance. The lower limit of detection with conventional immunoassay technology is the upper femtomolar range (10−13 M). Digital immunoassay technology has improved detection sensitivity three logs, to the attomolar range (10−16 M). This capability has the potential to open new advances in diagnostics and therapeutics, but such technologies have been relegated to manual procedures that are not well suited for efficient routine use.

Антителосыз белоктарды анықтау

Молекулалық биологияда антиденелер арқылы ақуызды анықтау әлі де жиі қолданылатын болса, антиденеге тәуелсіз басқа да әдістер де жасалған. Бұл әдістер түрлі артықшылықтар береді, мысалы, олар көбінесе ақуыз немесе пептидтің тізбегін анықтай алады, антиденелік әдістерге қарағанда жоғары өнімділікке ие болуы мүмкін, сондай-ақ кейде антиденесі жоқ ақуыздарды анықтап, мөлшерлей алады.

Анықтау әдістері

Белоктарды талдаудың ең ерте әдістерінің бірі – Эдман ыдырауы (1967 жылы енгізілген), онда бір пептидтің тізбегін анықтау үшін химиялық ыдыраудың бірнеше кезеңдеріне табиғи түрде ұшырату. Бұл ерте әдістердің көпшілігі қазір жоғары өнімділік ұсынатын технологиялармен алмастырылды. Жақында қолданыла бастаған әдістер массалық спектрометрия негізіндегі техникаларды пайдаланады, бұл 1980-ші жылдарда дамыған "жұмсақ иондау" әдістерін, мысалы, матрицалық көмекпен лазерлік десорбция/иондау (MALDI) және электроспрей иондау (ESI) ашу арқасында мүмкін болды. Осы әдістер "жоғарыдан төменге" және "төменнен жоғарыға" протеомика жұмыс ағындарын құрады, онда талдау жүргізер алдында көбінесе қосымша бөліп алу жүзеге асырылады (төменде қараңыз).

Бөлу әдістері

Күрделі биологиялық үлгілерді талдау үшін үлгінің күрделілігін азайту қажет. Бұл бір өлшемді немесе екі өлшемді бөлу арқылы желіден тыс жүзеге асырылуы мүмкін. Жақында ғана желілік әдістер әзірленді, онда жеке пептидтер (төменнен жоғары протеомикалық тәсілдерде) кері фазалық хроматография арқылы бөлініп, содан кейін тікелей иондалады; бөлу және талдаудың тікелей байланысы "желілік" талдау терминін түсіндіреді.

Гибридтік технологиялар

Бірнеше гибридтік технологиялар жеке аналиттерді антиденеге негізделген тазарту арқылы бөліп алып, содан кейін оларды анықтау және сандық бағалау үшін массалық спектрометриялық талдау жүргізеді. Осы әдістердің мысалдары – 1995 жылы Рэндалл Нельсон жасаған MSIA (массалық спектрометриялық иммуноәдістеме) және 2004 жылы Ли Андерсон ұсынған SISCAPA (Антипептидтік антиденелермен тұрақты изотоптық стандартты ұстау) әдісі.

Жоғары өнімділіктегі протеомиялық технологиялар

Протеомика соңғы он жылда бірнеше тәсілдердің қалыптасуымен бірқадамды дамып келеді. Олардың азасы жаңа, ал қалғандары дәстүрлі әдістерді жетілдіру арқылы құрылған. Массалық спектрометрияға негізделген әдістер, туыстық протеомика және микромассивтер – ақуыздарды ірі көлемде зерттеуге қолданылатын ең көп таралған технологиялар.

Массалық спектрометрия және белок профилін анықтау

Қазіргі кезде ақуызды профильдеу үшін массалық спектрометрияға негізделген екі әдіс қолданылады. Көбірек қалыптасқан және кең таралған әдіс жоғары ажыратымды, екі өлшемді электрофорезді пайдаланады, ол әртүрлі сынамалардан ақуыздарды параллельді түрде бөліп алады, содан кейін массалық спектрометрия арқылы сәйкес келетін экспрессиясы өзгешеленген ақуыздарды таңдап, бояуға болады. 2DE-нің жетілуіне және дамуына қарамастан, оның да шектеулері бар. Басты мәселе – үлгідегі барлық ақуыздарды олардың экспрессия деңгейінің және қасиеттерінің үлкен диапазоны ескеріліп, ажырату мүмкін болмауы. Кеуектің мөлшері, ақуыз заряды, мөлшері және пішінінің үйлесімі миграция жылдамдығын анықтайды, бұл басқа да қиындықтарға әкеледі. Екінші сандық тәсіл тұрақты изотоптарды пайдаланып екі әртүрлі күрделі қоспадан алынған ақуыздарды әртүрлі таңбалау үшін қолданылады. Бұл жағдайда, күрделі қоспадағы ақуыздар алдымен изотоптық түрде таңбаланады, содан кейін таңбаланған пептидтер алу үшін қорытылады. Таңбаланған қоспалар біріктіріледі, пептидтер көп өлшемді сұйық хроматография арқылы бөлінеді және тандемді массалық спектрометриямен талданады. Изотоптық кодталған аффинитеттік таңба (ICAT) реагенттері кеңінен қолданылатын изотоптық таңбалар болып табылады. Бұл әдісте ақуыздардың цистеин қалдықтары ICAT реагентіне ковалентті байланысады, бұл қоспаның күрделілігін азайтады және цистеин еместерді жояды. Тұрақты изотоптық таңбалауды қолданатын сандық протеомика – қазіргі заманғы зерттеулерде маңызды құрал. Біріншіден, химиялық реакциялар белгілі бір ақуыз функцияларын зерттеу үшін нақты ақуыздарға немесе олардың бөліктеріне таңбалар енгізу үшін қолданылды. Изотоптық таңбалау және таңдамалы химиялық әдістерді пайдалана отырып, фосфорилденген пептидтерді бөліп алып, күрделі қоспадан ақуыздың үлесін алуға қол жеткізілді. Екіншіден, ICAT технологиясы ішінара тазартылған немесе тазартылған макромолекулалық кешендерді, мысалы, ірі РНК полимераза II преинициялық кешенін және ашытқы транскрипциялық факторымен байланысқан ақуыздарды ажырату үшін қолданылды. Үшіншіден, ICAT таңбалауы жақында хроматинмен байланысқан ақуыздарды анықтау және сандық бағалау үшін хроматинның оқшаулануымен біріктірілді. Соңында, ICAT реагенттері жасушалық органеллалардың және жасушалық фракциялардың протеомиялық профилін жасау үшін пайдалы. Қазіргі уақытта бұл әдіс бірнеше мың ақуызды, әдетте плазма, сарысу немесе мидың цереброспиналдық сұйықтығы (CSF) сияқты биосұйықтықтардан анықтай алады. Бұл технологияның ерекшелігі – ақылға қонымды мерзімде (бірнеше күн немесе апта) жүздеген немесе мыңдаған сынамаларды талдау мүмкіндігі. Массалық спектрометрияға негізделген әдістер протеомикалық талдаулар үшін осы деңгейде үлгілерді өңдеуге қабілетсіз.

There are two mass spectrometry based methods currently used for protein profiling. The more established and widespread method uses high resolution, two dimensional electrophoresis to separate proteins from different samples in parallel, followed by selection and staining of differentially expressed proteins to be identified by mass spectrometry. Despite the advances in 2 DE and its maturity, it has its limits as well. The central concern is the inability to resolve all the proteins within a sample, given their dramatic range in expression level and differing properties. The combination of pore size, and protein charge, size and shape can greatly determine migration rate which leads to other complications. The second quantitative approach uses stable isotope tags to differentially label proteins from two different complex mixtures. Here, the proteins within a complex mixture are labeled isotopically first, and then digested to yield labeled peptides. The labeled mixtures are then combined, the peptides separated by multidimensional liquid chromatography and analyzed by tandem mass spectrometry. Isotope coded affinity tag (ICAT) reagents are the widely used isotope tags. In this method, the cysteine residues of proteins get covalently attached to the ICAT reagent, thereby reducing the complexity of the mixtures omitting the non cysteine residues. Quantitative proteomics using stable isotopic tagging is an increasingly useful tool in modern development. Firstly, chemical reactions have been used to introduce tags into specific sites or proteins for the purpose of probing specific protein functionalities. The isolation of phosphorylated peptides has been achieved using isotopic labeling and selective chemistries to capture the fraction of protein among the complex mixture. Secondly, the ICAT technology was used to differentiate between partially purified or purified macromolecular complexes such as large RNA polymerase II pre initiation complex and the proteins complexed with yeast transcription factor. Thirdly, ICAT labeling was recently combined with chromatin isolation to identify and quantify chromatin associated proteins. Finally ICAT reagents are useful for proteomic profiling of cellular organelles and specific cellular fractions. Currently this method can interrogate several thousand proteins, typically from biofluids such as plasma, serum or cerebrospinal fluid (CSF). A key differentiator for this technology is the ability to analyze hundreds or thousands of samples in a reasonable timeframe (a matter of days or weeks); mass spectrometry based methods are not scalable to this level of sample throughput for proteomics analyses.

Протеин шикізаты

Протеомика мен медицинада массалық спектрометрлерді қолдануды теңестіретін құрал – ақуыз микромассивтері. Ақуыз микромассивтерінің мақсаты – биологиялық үлгілерді зерттеу үшін мыңдаған ақуызды анықтау мүмкіндіктерін басып шығару. Антидене массиві – адам қан үлгісінен тиісті антигендерді анықтау үшін әртүрлі антиденелердің жиынтығын қолданудың бір мысалы. Тағы бір тәсіл – ақуыз-ДНК, ақуыз-ақуыз және ақуыз-лиганд өзара әрекеттесуі сияқты қасиеттерін зерттеу үшін бірнеше ақуыз түрлерін жинақтау. Идеал жағдайда, функционалды протеомикалық массивтер белгілі бір организмнің барлық ақуыздарын қамтуы керек. Мұндай массивтердің алғашқы нұсқасы – шыны микроскоптық слайдтарға жатқызылған ашытқыдан тазартылған 5000 ақуыз. Бірінші чиптің табысқа ие болғанына қарамастан, ақуыз массивінің енгізілуі үлкен қиындық тудырды. Ақуыздармен жұмыс істеу ДНК-ға қарағанда күрделірек. Олардың кең динамикалық диапазоны бар, ДНК-дан кем тұрақты және олардың құрылымын шыны слайдтарда сақтау қиын, бірақ көптеген талдаулар үшін олар маңызды. Жаһандық ICAT технологиясы ақуыз чипі технологияларынан айқын артықшылықтарға ие. Кетон және альдегид конденсациясын қолданатын соңғы зерттеулер олардың in vitro немесе жасуша бетін белгілеу үшін ең қолайлы екенін көрсетті. Дегенмен, кетон және альдегидтерді биоортогоналды репортерлер ретінде пайдалану баяу кинетиканы көрсетті, яғни тиімді таңбалау үшін концентрация жоғары болуы керек. Кейбір ақуыздарды азид тобына реакциялық қабілеті арқылы анықтауға болады. Протеиногенді емес аминқышқылдары Стаудингер лигацияларында фосфиндермен реакцияға түсетін азид тобын алып жүреді. Бұл реакция тірі жасушалар мен жануарлардағы басқа биомолекулаларды белгілеу үшін қолданылған. Биоортогоналды сала кеңейіп, протеомикадағы қосымша қолданыстарды дамытуда. Оның шектеулерін және артықшылықтарын атап өту маңызды. Жылдам реакциялар биоконъюгацияларды жасауға және реактивтердің аз мөлшерімен жоғары концентрацияларды құруға мүмкіндік береді. Керісінше, альдегид және кетон конденсациясы сияқты баяу кинетикалық реакциялар тиімді болғанымен, жоғары концентрацияны қажет етеді, бұл оларды экономикалық тұрғыдан тиімсіз етеді.

Balancing the use of mass spectrometers in proteomics and in medicine is the use of protein micro arrays. The aim behind protein micro arrays is to print thousands of protein detecting features for the interrogation of biological samples. Antibody arrays are an example in which a host of different antibodies are arrayed to detect their respective antigens from a sample of human blood. Another approach is the arraying of multiple protein types for the study of properties like protein DNA, protein protein and protein ligand interactions. Ideally, the functional proteomic arrays would contain the entire complement of the proteins of a given organism. The first version of such arrays consisted of 5000 purified proteins from yeast deposited onto glass microscopic slides. Despite the success of first chip, it was a greater challenge for protein arrays to be implemented. Proteins are inherently much more difficult to work with than DNA. They have a broad dynamic range, are less stable than DNA and their structure is difficult to preserve on glass slides, though they are essential for most assays. The global ICAT technology has striking advantages over protein chip technologies. Recent studies using ketones and aldehydes condensations show that they are best suited for in vitro or cell surface labeling. However, using ketones and aldehydes as bioorthogonal reporters revealed slow kinetics indicating that while effective for labeling, the concentration must be high. Certain proteins can be detected via their reactivity to azide groups. Non proteinogenic amino acids can bear azide groups which react with phosphines in Staudinger ligations. This reaction has already been used to label other biomolecules in living cells and animals. The bioorthoganal field is expanding and is driving further applications within proteomics. It is worthwhile noting the limitations and benefits. Rapid reactions can create bioconjuctions and create high concentrations with low amounts of reactants. Contrarily slow kinetic reactions like aldehyde and ketone condensation while effective require a high concentration making it cost inefficient.

Жаңа дәрі-дәрмектер

Адам гендері мен ақуыздарын зерттеудің маңызды нәтижелерінің бірі – ауруларды емдеуге арналған жаңа дәрілерді анықтау болып табылады. Бұл геном және протеом ақпаратына сүйене отырып, аурумен байланысты белоктарды анықтауға мүмкіндік береді, ал компьютерлік бағдарламалар оларды жаңа дәрілер үшін нысана ретінде пайдалана алады. Мысалы, егер белгілі бір белок ауруға қатысты болса, оның үш өлшемді құрылымы сол белоктың қызметін бұзатын дәрілерді жасау үшін қажетті ақпаратты ұсынады. Ферменттің белсенді орынына сай келіп, бірақ фермент оны босата алмайтын молекула ферменттің белсенділігін тоқтатып, оны жарамсыз етеді. Бұл жаңа дәрілерді табу құралдарының негізі болып табылады, олардың мақсаты – ауруға қатысқан белоктарды тежеуге арналған жаңа препараттарды іздеу. Адамдар арасындағы генетикалық айырмашылықтар анықталған сайын, ғалымдар осы техникаларды жеке адамға тиімдірек болатын жекелендірілген дәрілерді жасау үшін пайдалануды күтеді. Протеомика сондай-ақ өсімдіктердің жәндіктермен күрделі өзара әрекеттесуін анықтау үшін қолданылады, бұл өсімдіктердің жәндіктерден қорғануына қатысқан гендерді анықтауға көмектеседі. Протеомиканың химиялық протеомика деп аталатын саласы дәрілердің белок нысаналарын анықтау үшін көптеген құралдар мен әдістерді ұсынады.

Өзара әрекеттесу протеомикасы және ақуыздық желілер

Өзара әрекеттесу протеомикасы – ақуыздың өзара әрекеттесуін екілік өзара әрекеттесу деңгейінен бастап, протеомға немесе толық желіге дейін талдау. Көптеген ақуыздар ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесу арқылы қызмет етеді, ал өзара әрекеттесу протеомикасының мақсаты – екілік ақуыз өзара әрекеттесуін, ақуыз кешендерін және интерактомдарды анықтау. Ақуыздың өзара әрекеттесуін зерттеу үшін бірнеше әдіс қолданылады. Ең дәстүрлі әдіс – ашытқының екі гибридтік талдауы, ал қуатты жаңа әдіс – таңбаланған ақуыз «жемі» арқылы аффиниттік тазалау, содан кейін ақуыз массалық спектрометриясы. Басқа әдістерге беттік плазмондық резонанс (SPR), ақуыз микромассивтері, қос поляризациялық интерферометрия, микромасштабты термофорез, кинетикалық мұқтаждықты жою әдісі, сондай-ақ фаг дисплейі және компьютерлік модельдеу сияқты тәжірибелік әдістер кіреді. Ақуыздың өзара әрекеттесуі туралы білім биологиялық желілер мен жүйелік биология үшін, мысалы, жасушалық сигналдық каскадтар мен гендік реттеу желілерінде (GRN, онда ақуыз-ДНК өзара әрекеттесуі туралы мәліметтер де маңызды) аса пайдалы. Протеомдық деңгейде ақуыздың өзара әрекеттесуін талдау және осы өзара әрекеттесу үлгілерін кеңірек биологиялық желілерге интеграциялау жүйелік биологияны түсіну үшін маңызды.

Экспрессиялық протеомика

Экспрессиялық протеомика – бұл белок экспрессиясын кең ауқымда талдауды қамтиды. Ол нақты бір сынамадағы негізгі белоктарды және аурулы және сау тіндер сияқты байланысты сынамалардағы айырмашылықпен экспрессияланатын белоктарды анықтауға көмектеседі. Егер белок тек аурулы сынамада ғана табылса, ол тиімді дәрілік мақсат немесе диагностикалық маркер бола алады. Бірдей немесе ұқсас экспрессия профиліне ие белоктар функционалды түрде байланысты болуы мүмкін. Экспрессиялық протеомикада 2D PAGE және массалық спектрометрия сияқты технологиялар қолданылады. Протеоманы, әр белоктың құрылымын және функциясын, сондай-ақ белок-белок өзара әрекеттесуінің күрделілігін түсіну болашақта ең тиімді диагностикалық техникаларды және ауруларды емдеуді әзірлеу үшін маңызды. Мысалы, протеомика кандидаттық биомаркерлерді (диагностика үшін дене сұйықтықтарындағы құнды белоктарды), иммундық жауаптың нысанасы болып табылатын бактериялық антигендерді және жұқпалы немесе неопластикалық аурулардың иммуногистохимиялық маркерлерін анықтау үшін өте пайдалы. Протеомиканың бір қызықты қолданылуы – ауруды диагностикалау үшін нақты белок биомаркерлерін пайдалану. Белгілі бір ауру кезінде өндірілетін белоктарды тексеруге мүмкіндік беретін бірнеше техникалар бар, бұл ауруды жылдам диагностикалауға көмектеседі. Бұл техникаларға вестерн блот, иммуногистохимиялық бояу, ферменттің иммундық адсорбциялық талдауы (ELISA) немесе массалық спектрометрия жатады. Секретомика – протеомиканың бір саласы, ол протеомикалық тәсілдерді қолдана отырып, секрецияланатын белоктар мен секреция жолдарын зерттейді және ауру биомаркерлерін анықтау үшін маңызды құрал ретінде пайда болып келеді.

Протеогеномия

Протеогеномикада гендік аннотацияларды жақсарту үшін массалық спектрометрия сияқты протеомикалық технологиялар пайдаланылады. Геном және протеомды параллель талдау, әсіресе бірнеше түрлерді салыстырғанда, посттрансляциялық модификациялар мен протеолитикалық оқиғаларды анықтауға мүмкіндік береді (салыстырмалы протеогеномика).

Құрылымдық протеомика

Құрылымдық протеомика – бұл үлкен масштабта ақуыз құрылымдарын талдауды қамтиды. Ол ақуыз құрылымдарын салыстырып, жаңадан ашылған гендердің функцияларын анықтауға көмектеседі. Құрылымдық талдау сондай-ақ дәрілердің ақуыздарға қайда байланысатынын түсінуге және ақуыздардың бір-бірімен қалай өзара әрекеттесетінін көрсетуге мүмкіндік береді. Бұл түсінік рентгендік кристаллография және ЯМР спектроскопиясы сияқты әртүрлі технологиялардың көмегімен қол жеткізіледі.

Протеомия үшін биоинформатика (протеомдық информатика)

Көптеген протеомика деректері массалық спектрометрия және микромассив сияқты жоғары өнімділік технологиялардың көмегімен жиналады. Деректерді талдау және қолмен салыстыру үшін көбінесе апталар немесе айлар қажет болады. Осы себепті биологтар мен химиктер компьютерлік ғалымдар мен математиктермен бірлесіп, ақуыз деректерін есептеу арқылы талдауға арналған бағдарламалар мен құбыржолдарды жасауда. Биоинформатикалық әдістерді пайдалану арқылы зерттеушілер деректерді жылдам талдауға және сақтауға қол жеткізеді. Ағымдағы бағдарламалар мен деректер базаларының тізімін табуға ExPASy биоинформатика ресурстық порталы қолайлы орын. Биоинформатикаға негізделген протеомиканың қолданылу салалары медицина, ауруларды диагностикалау, биомаркерлерді анықтау және тағы да көптеген мүмкіндіктерді қамтиды.

Белоктарды анықтау

Массалық спектрометрия және микроаррейлер пептидтердің фрагментация туралы ақпарат береді, бірақ бастапқы үлгіде қандай нақты ақуыздар бар екенін анықтамайды. Нақты ақуызды анықтау мүмкін болмағандықтан, бұрынғы зерттеушілер пептид фрагменттерін өздері анықтауға мәжбүр болды. Дегенмен, қазіргі таңда ақуызды анықтауға арналған бағдарламалар бар. Бұл бағдарламалар массалық спектрометрия мен микроаррейлерден алынған пептидтік тізбектерді пайдаланып, сәйкес немесе ұқсас ақуыздар туралы ақпаратты қайтарады. Бұл, бағдарламаға енгізілген алгоритмдер арқылы іске асырылады, олар UniProt және PROSITE сияқты белгілі дерекқорлардағы ақуыздармен салыстырып, үлгіде қандай ақуыздар бар екенін белгілі бір деңгейде сенімділікпен болжайды.

Белоктың құрылымы

Биомолекулалық құрылым ақуыздың 3D конфигурациясын қалыптастырады. Ақуыздың құрылымын түсіну оның өзара әрекеттесуін және қызметін анықтауға көмектеседі. Бұрын ақуыздардың 3D құрылымын анықтау тек рентгендік кристаллография және ЯМР спектроскопиясы арқылы ғана мүмкін болатын. 2017 жылға қарай криоэлектрондық микроскопия кристалдану қиындықтарын (рентгендік кристаллографияда) және конформациялық белгісіздікті (ЯМР-де) шешіп, басты техникаға айналды; 2015 жылға қарай ажыратымдылығы 2.2Å құрады. Қазір биоинформатиканың арқасында кейбір жағдайларда ақуыздардың құрылымын болжауға және модельдеуге мүмкіндік беретін компьютерлік бағдарламалар бар. Бұл бағдарламалар аминқышқылдарының химиялық қасиеттерін және белгілі ақуыздардың құрылымдық ерекшеліктерін пайдаланып, сынама ақуыздың 3D моделін болжайды. Бұл ғалымдарға ақуыздың өзара әрекеттесуін ірі масштабта модельдеуге де мүмкіндік береді. Сонымен қатар, биомедициналық инженерлер ақуыз құрылымдарының икемділігін ескере отырып, салыстырулар мен болжамдар жасау үшін әдістерді әзірлеп жатыр.

Аудармадан кейінгі өзгерістер

Белоктарды талдауға арналған көптеген бағдарламалар посттрансляциялық модификацияларға ұшыраған белоктар үшін жазылмаған. Кейбір бағдарламалар белоктарды анықтауға көмектесу үшін посттрансляциялық модификацияларды қабылдайды, бірақ одан кейін белокты талдау кезінде осы модификацияны ескермейді. Бұл модификацияларды есепке алу маңызды, себебі олар белоктың құрылысына әсер етуі мүмкін. Осыған байланысты, посттрансляциялық модификациялардың есептеулік талдауы ғылыми қоғамдастықтың назарына ілікті. Қазіргі посттрансляциялық модификация бағдарламалары тек болжамдық сипатта. Химиктер, биологтар және компьютерлік ғалымдар бірлесіп, белоктың құрылымы мен функциясына әсері эксперименттік жолмен анықталған посттрансляциялық модификацияларды талдауға мүмкіндік беретін жаңа әдістерді жасау және енгізу жұмыстарын жүргізіп жатыр.

Белок биомаркерлерін зерттеудегі есептеу әдістері

Биоинформатиканы және есептеу әдістерін қолданудың бір мысалы – ақуыз биомаркерлерін зерттеу. Есептеулік болжамдық модельдер жүктілік кезінде аналық-ұрықтық ақуыз алмасудың кең және әртүрлі болатынын, оны жүкті әйелдің қаннан инвазивті емес түрде оңай анықтауға болатынын көрсетті. Бұл есептеулік тәсіл аналық қанның ұрықтық протеомикалық талдауындағы үлкен шектеуді – аналық ақуыздардың көптігінің ұрықтық ақуыздарды анықтауға кедергі келтіруін жоңарды. Есептеулік модельдер аналық қанда бұрын анықталған ұрықтық гендердің транскриптерін пайдаланып, жаңа туған сәбидің толыққанды протеомикалық желісін құруға мүмкіндік береді. Мұндай зерттеулер жүкті әйелдің қанында табылатын ұрықтық ақуыздардың дамитын ұрықтың әртүрлі тіндері мен мүшелерінен шығатынын көрсетеді. Протеомикалық желілерде дамудың көрсеткіштері болып табылатын көптеген биомаркерлер бар, бұл технологияның қалыпты және бұзылған ұрықтық дамуды бақылау құралы ретінде клиникалық қолданылуының мүмкіндігін көрсетеді. Биомаркерлерді анықтау үшін ақпараттық-теориялық аспектілер енгізілді, биосұйықтықтар мен тіндер туралы ақпаратты біріктіреді. Бұл жаңа тәсіл белгілі бір биосұйықтықтар мен тіндер арасындағы функционалдық синергияны пайдаланады, егер тіндер мен биосұйықтықтар жеке қарастырылса, клиникалық маңызды нәтижелерге қол жеткізу мүмкін емес. Тіндік биосұйықтықты ақпаратты тарату арнасы ретінде қарастыру арқылы маңызды биосұйықтық көрсеткіштерін анықтап, оларды клиникалық диагностиканы дамыту үшін пайдалануға болады. Ұсынылатын биомаркерлер тіндік-биосұйықтық арналары арқылы ақпарат беру критерийлеріне сүйене отырып таңдалады. Биомаркерлерді клиникалық жарамдылығын растау үшін маңызды биосұйықтық-тіндік қатынастарды пайдалануға болады. Сондай-ақ, жеке жасушалардағы ақуыздың өзгеруі, ақуыздық кешендердің қалыптасуы, иммундық функциялар, жасуша циклі және қатерлі жасушаларды дәріге қарсы тұруға дайындау сияқты биологиялық процестерді көрсетеді. Биологиялық жүйелер түрлі өзгерістерге ұшырайды (жасуша циклі, жасушалық дифференциация, канцерогенез, қоршаған орта (биофизикалық) және т.б.). Бұл өзгерістерге жауап ретінде транскрипциялық және трансляциялық жауаптар протеомның функционалдық өзгерістеріне әкеледі. Сондықтан, протеомдағы ақуыз мөлшерінің кең ауқымды өзгерістерін сипаттау және сандық бағалау, биологиялық құбылыстарды жүйе деңгейінде толық түсіну үшін маңызды. Осылайша, протеомика геномика, транскриптомика, эпигеномика, метаболомика және басқа да «омика» тәсілдерімен салыстырылады, биологиялық фенотиптерді толық анықтауға бағытталған интегративтік талдауларда қолданылады. Мысалы, "Рак протеомы атласы" 4000-нан астам ісік үлгілеріндегі ~200 ақуыздың сандық экспрессиялық деректерін, "Рак геномы атласынан" алынған транскриптомдық және геномдық деректермен салыстырады. Басқа жасушалар, тіндер және түрлердегі ұқсас деректер жиынтығы, әсіресе терең шутинг массалық спектрометрияны қолдану арқылы, қатерлі ісік биологиясы, даму және дің жасушалары биологиясы, медицина және эволюциялық биология сияқты салалардағы зерттеулер үшін өте құнды ресурс болады.

One example of the use of bioinformatics and the use of computational methods is the study of protein biomarkers. Computational predictive models have shown that extensive and diverse feto maternal protein trafficking occurs during pregnancy and can be readily detected non invasively in maternal whole blood. This computational approach circumvented a major limitation, the abundance of maternal proteins interfering with the detection of fetal proteins, to fetal proteomic analysis of maternal blood. Computational models can use fetal gene transcripts previously identified in maternal whole blood to create a comprehensive proteomic network of the term neonate. Such work shows that the fetal proteins detected in pregnant woman's blood originate from a diverse group of tissues and organs from the developing fetus. The proteomic networks contain many biomarkers that are proxies for development and illustrate the potential clinical application of this technology as a way to monitor normal and abnormal fetal development. An information theoretic framework has also been introduced for biomarker discovery, integrating biofluid and tissue information. This new approach takes advantage of functional synergy between certain biofluids and tissues with the potential for clinically significant findings not possible if tissues and biofluids were considered individually. By conceptualizing tissue biofluid as information channels, significant biofluid proxies can be identified and then used for the guided development of clinical diagnostics. Candidate biomarkers are then predicted based on information transfer criteria across the tissue biofluid channels. Significant biofluid tissue relationships can be used to prioritize clinical validation of biomarkers. and protein covariation across single cells which reflects biological processes such as protein complex formation, immune functions, as well as cell cycle and priming of cancer cells for drug resistance Biological systems are subject to a variety of perturbations (cell cycle, cellular differentiation, carcinogenesis, environment (biophysical), etc.). Transcriptional and translational responses to these perturbations results in functional changes to the proteome implicated in response to the stimulus. Therefore, describing and quantifying proteome wide changes in protein abundance is crucial towards understanding biological phenomenon more holistically, on the level of the entire system. In this way, proteomics can be seen as complementary to genomics, transcriptomics, epigenomics, metabolomics, and other omics approaches in integrative analyses attempting to define biological phenotypes more comprehensively. As an example, The Cancer Proteome Atlas provides quantitative protein expression data for ~200 proteins in over 4,000 tumor samples with matched transcriptomic and genomic data from The Cancer Genome Atlas. Similar datasets in other cell types, tissue types, and species, particularly using deep shotgun mass spectrometry, will be an immensely important resource for research in fields like cancer biology, developmental and stem cell biology, medicine, and evolutionary biology.

Адамның плазмалық протеомы

Адам плазмасының протеомын сипаттау протеомика саласындағы маңызды мақсатқа айналды, бірақ ол барлық адам тіндерінің арасындағы ең күрделі протеом болып табылады. Оған иммуноглобулиндер, цитокиндер, белок гормондары және инфекцияны көрсететін секрецияланған белоктар кіреді. Бұған қоса, денедегі әртүрлі тіндер арқылы қан айналымы нәтижесінде тіндерден шыққан белоктар да бар. Осылайша, қан барлық тіндердің физиологиялық күйі туралы ақпаратты қамтиды және оның қолжетімділігімен бірге қан протеомын медициналық мақсаттар үшін құнды етеді. Плазма протеомын сипаттау өте қиын міндет саналады. Плазма протеомының тереңдігі ең көп кездесетін белоктан (альбумин) ең сирек кездесетінге (кейбір цитокиндер) дейін 1010-нан астам динамикалық диапазонды қамтиды және протеомикадағы басты қиындықтардың бірі болып есептеледі. Уақыт және кеңістік динамикасы адам плазма протеомын зерттеуді одан әрі күрделендіреді. Кейбір белоктардың жаңаруы басқаларына қарағанда тез жүреді, ал артериядағы белок мөлшері тамырдағыдан айтарлықтай өзгеше болуы мүмкін. Бұл айырмашылықтар тіпті протеомды тізімдеу сияқты ең қарапайым протеомдық міндетті де қол жеткізбейтіндей етеді. Бұл мәселені шешу үшін басымдықтарды анықтау қажет. Диагностикалық құралды жасау үшін барлық протеомның ең маңызды белоктар жиынтығын анықтау – осындай басымдықтардың бірі. Екіншіден, қатерлі ісік белоктардың гликозильдеуінің күшеюімен байланысты болғандықтан, белоктардың осы бөлігіне назар аударатын әдістер де пайдалы болады. Қайтадан айтамын, көп параметрлі талдау патологиялық жағдайды ең жақсы ашады. Бұл технологиялардың жетілуіне байланысты ауру профильдері тиісті ген экспрессиясының өзгерістерімен үнемі салыстырылуы керек. Осындай технологиялардың арқасында ғалымдар егешқұйрықтардағы қабыну процестерін, плазма протеомының тұқым қуалаушылығын зерттеді, сондай-ақ салмақ жоғалту сияқты өмір салтын өзгертудің плазма протеомына тигізетін әсерін көрсетті.