Протеомика: Крупномасштабное изучение белков

Протеомика: масштабное изучение белков, их функций (структура, ферменты, гормоны, антитела) и роли в организме. Анализ протеома для новых открытий.

20 мин чтения

100%

Источник: Proteomics — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Крупномасштабное изучение белков
журнал "Протеомика"

Протеомика – это крупномасштабное исследование белков. Белки являются важнейшими компонентами живых организмов, выполняющими множество функций, таких как формирование структурных волокон мышечной ткани, ферментативное переваривание пищи, синтез и репликация ДНК. Кроме того, к другим видам белков относятся антитела, защищающие организм от инфекций, и гормоны, передающие важные сигналы по всему организму. Протеом – это совокупность всех белков, производимых или модифицируемых организмом или системой. Протеомика позволяет идентифицировать всё возрастающее число белков, которое меняется со временем и в зависимости от различных потребностей или стрессовых факторов, испытываемых клеткой или организмом. Протеомика – это междисциплинарная область, которая значительно выиграла от генетической информации, полученной в ходе различных геномных проектов, включая Проект генома человека. Она охватывает изучение протеомов на уровне состава, структуры и активности белков и является важной составляющей функциональной геномики. Протеомика обычно подразумевает крупномасштабный экспериментальный анализ белков и протеомов, но часто относится конкретно к очистке белков и масс-спектрометрии. Действительно, масс-спектрометрия является наиболее мощным методом анализа протеомов как в больших образцах, состоящих из миллионов клеток, так и в отдельных клетках.

История и этимология

Первые исследования белков, которые можно отнести к протеомике, начались в 1975 году после появления двухмерного электрофореза и картирования белков бактерии Escherichia coli. Термин "протеом" является сочетанием слов "протеин" и "геном". Он был предложен в 1994 году аспирантом Марком Уилкинсом из Университета Маккуори, который в 1995 году основал первую специализированную лабораторию протеомики.

Сложность проблемы

После геномики и транскриптомики, протеомика – следующий этап в изучении биологических систем. Она сложнее геномики, поскольку геном организма более или менее постоянен, в то время как протеомы различаются от клетки к клетке и в разные моменты времени. Разные гены экспрессируются в различных типах клеток, что означает, что даже основной набор белков, производимых в клетке, необходимо идентифицировать. Ранее это явление оценивалось анализом РНК, который оказался недостаточно коррелирующим с содержанием белка. Сейчас известно, что мРНК не всегда транслируется в белок, а количество белка, производимого из определенного количества мРНК, зависит от гена, с которого она транскрибируется, и от физиологического состояния клетки. Протеомика подтверждает присутствие белка и предоставляет непосредственное измерение его количества.

Постпереводные изменения

Не только трансляция с мРНК приводит к различиям, но и многие белки подвергаются широкому спектру химических модификаций после трансляции. Наиболее распространенными и широко изученными посттрансляционными модификациями являются фосфорилирование и гликозилирование. Многие из этих посттрансляционных модификаций критически важны для функционирования белка.

Фосфорилирование

Одной из таких модификаций является фосфорилирование, которое происходит со многими ферментами и структурными белками в процессе клеточной сигнализации. Присоединение фосфатной группы к определенным аминокислотам – чаще всего серину и треонину, опосредованное серин-треонинкиназами, или реже к тирозину, опосредованное тирозинкиназами – делает белок мишенью для связывания или взаимодействия с определенным набором других белков, распознающих фосфорилированный участок. Поскольку фосфорилирование белков является одной из наиболее изученных модификаций белков, многие "протеомические" исследования направлены на определение набора фосфорилированных белков в конкретном типе клеток или ткани в определенных условиях. Это позволяет исследователю выявить сигнальные пути, которые могут быть активны в данном случае.

Убиквитинация

Убиквитин – это небольшой белок, который может присоединяться к определенным белковым субстратам с помощью ферментов, называемых E3 убиквитин-лигазами. Определение того, какие белки подвергаются полиубиквитинированию, помогает понять, как регулируются белковые пути. Следовательно, это еще одно обоснованное "протеомическое" исследование. Аналогично, после того как исследователь определит, какие субстраты убиквитинируются каждой лигазой, будет полезно определить набор лигаз, экспрессируемых в конкретном типе клеток.

Дополнительные изменения

В дополнение к фосфорилированию и убиквитинированию, белки могут подвергаться (в частности) метилированию, ацетилированию, гликозилированию, окислению и нитрозилированию. Некоторые белки претерпевают все эти модификации, часто в комбинациях, зависящих от времени. Это демонстрирует потенциальную сложность изучения структуры и функции белков.

Различные белки образуются в разных условиях

Клетка может синтезировать различные наборы белков в разное время или при разных условиях, например, в ходе развития, клеточной дифференциации, клеточного цикла или канцерогенеза. Как уже упоминалось, дальнейшее увеличение сложности протеома связано с тем, что большинство белков способны подвергаться широкому спектру посттрансляционных модификаций. Поэтому исследование в области "протеомики" может быстро стать сложным, даже если тема исследования ограничена. В более масштабных исследованиях, например, при поиске биомаркера для конкретного подтипа рака, ученый-протеомик может выбрать изучение нескольких образцов сыворотки крови от разных пациентов с раком, чтобы минимизировать влияние искажающих факторов и учесть экспериментальный шум. Таким образом, сложные экспериментальные схемы иногда необходимы для учета динамической сложности протеома.

Методы изучения белков

В протеомике существует несколько методов изучения белков. Как правило, белки могут быть обнаружены с использованием антител (иммуноанализов), электрофоретического разделения или масс-спектрометрии. При анализе сложного биологического образца требуется либо использование высокоспецифичного антитела в количественном точечном блоте (QDB), либо предварительное биохимическое разделение перед этапом детекции, поскольку образец содержит слишком много аналитов для точного обнаружения и количественного определения.

Обнаружение белков с помощью антител (иммуноанализы)

Антитела к определенным белкам или их модифицированным формам использовались в биохимических и клеточных биологических исследованиях. Это одни из наиболее распространенных инструментов, используемых молекулярными биологами сегодня. Существует несколько специфических методов и протоколов, использующих антитела для детекции белков. Энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) применяется на протяжении десятилетий для детекции и количественного измерения белков в образцах. Вестерн-блоттинг может использоваться для детекции и количественного определения отдельных белков, при котором на начальном этапе сложная смесь белков разделяется с помощью SDS-PAGE, а затем белок, представляющий интерес, идентифицируется с помощью антитела. Модифицированные белки могут изучаться путем разработки антитела, специфичного к данной модификации. Например, некоторые антитела распознают определенные белки только при тирозиновом фосфорилировании; они известны как фосфоспецифические антитела. Также существуют антитела, специфичные к другим модификациям, которые могут быть использованы для определения набора белков, подвергшихся интересующей модификации. Иммуноанализы также могут проводиться с использованием рекомбинантных производных иммуноглобулина или синтетически разработанных белковых каркасов, отобранных для высокой антигенной специфичности. К таким связывающим агентам относятся фрагменты антител с одним доменом (нанотела), сконструированные анкириновые повторные белки (DARPins) и аптамеры. Детекция заболеваний на молекулярном уровне стимулирует новую революцию в ранней диагностике и лечении. Сложность, с которой сталкивается эта область, заключается в том, что белковые биомаркеры для ранней диагностики могут присутствовать в очень низкой концентрации. Предел обнаружения при использовании традиционной иммуноаналитической технологии составляет верхний фемотомолярный диапазон (10−13 М). Цифровая иммуноаналитическая технология улучшила чувствительность детекции на три порядка, достигнув атомолярного диапазона (10−16 М). Эта возможность может открыть новые перспективы в диагностике и терапии, однако такие технологии были ограничены ручными процедурами, которые не подходят для эффективного рутинного использования.

Antibodies to particular proteins, or their modified forms, have been used in biochemistry and cell biology studies. These are among the most common tools used by molecular biologists today. There are several specific techniques and protocols that use antibodies for protein detection. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) has been used for decades to detect and quantitatively measure proteins in samples. The western blot may be used for detection and quantification of individual proteins, where in an initial step, a complex protein mixture is separated using SDS PAGE and then the protein of interest is identified using an antibody. Modified proteins may be studied by developing an antibody specific to that modification. For example, some antibodies only recognize certain proteins when they are tyrosine phosphorylated, they are known as phospho specific antibodies. Also, there are antibodies specific to other modifications. These may be used to determine the set of proteins that have undergone the modification of interest. Immunoassays can also be carried out using recombinantly generated immunoglobulin derivatives or synthetically designed protein scaffolds that are selected for high antigen specificity. Such binders include single domain antibody fragments (Nanobodies), designed ankyrin repeat proteins (DARPins) and aptamers. Disease detection at the molecular level is driving the emerging revolution of early diagnosis and treatment. A challenge facing the field is that protein biomarkers for early diagnosis may be present in very low abundance. The lower limit of detection with conventional immunoassay technology is the upper femtomolar range (10−13 M). Digital immunoassay technology has improved detection sensitivity three logs, to the attomolar range (10−16 M). This capability has the potential to open new advances in diagnostics and therapeutics, but such technologies have been relegated to manual procedures that are not well suited for efficient routine use.

Обнаружение белков без антител

В то время как детекция белков с помощью антител по-прежнему широко распространена в молекулярной биологии, были разработаны и другие методы, не использующие антитела. Эти методы обладают рядом преимуществ, например, они часто позволяют определить последовательность белка или пептида, могут обладать большей пропускной способностью по сравнению с методами, основанными на антителах, и иногда способны идентифицировать и количественно оценивать белки, для которых антитела не существуют.

Методы обнаружения

Одним из самых ранних методов анализа белков является деградация Эдмана (введённая в 1967 году), при которой один пептид подвергается многократным этапам химического расщепления для определения его последовательности аминокислот. Эти ранние методы в основном уступили место технологиям с более высокой производительностью. Более современные методы основаны на масс-спектрометрии, что стало возможным благодаря открытию методов "мягкой ионизации", разработанных в 1980-х годах, таких как матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) и электрораспылительная ионизация (ESI). Эти методы привели к появлению протеомных подходов "сверху вниз" и "снизу вверх", где часто перед анализом проводится дополнительное разделение (см. ниже).

Методы разделения

Для анализа сложных биологических образцов необходимо снизить сложность пробы. Это может быть выполнено вне системы посредством одномерного или двумерного разделения. В последнее время были разработаны методы онлайн-анализа, при которых отдельные пептиды (в протеомических подходах "снизу вверх") разделяются с помощью обращенно-фазовой хроматографии, а затем непосредственно ионизируются с использованием ESI; прямое сочетание разделения и анализа объясняет термин "онлайн-анализ".

Гибридные технологии

Несколько гибридных технологий используют очистку отдельных аналитов с помощью антител, а затем проводят масс-спектрометрический анализ для их идентификации и количественного определения. Примерами этих методов являются MSIA (масс-спектрометрический иммуноанализ), разработанный Рэндаллом Нельсоном в 1995 году, и метод SISCAPA (захват стабильных изотопных стандартов с использованием антипептидных антител), предложенный Ли Андерсон в 2004 году.

Высокопроизводительные протеомические технологии

Протеомика неуклонно набирала обороты в течение последнего десятилетия благодаря развитию различных подходов. Мало какие из них являются совершенно новыми, а большинство развивают традиционные методы. Наиболее распространенными технологиями для масштабного изучения белков являются методы, основанные на масс-спектрометрии, аффинной протеомике и микрочипы.

Массовая спектрометрия и профилирование белков

В настоящее время для профилирования белков используются два метода, основанных на масс-спектрометрии. Более устоявшийся и широко распространенный метод использует высокоразрешающий двумерный электрофорез для разделения белков из различных образцов параллельно, за которым следует отбор и окрашивание дифференциально экспрессируемых белков для идентификации с помощью масс-спектрометрии. Несмотря на прогресс в 2D-электрофорезе и его зрелость, он также имеет свои ограничения. Основная проблема заключается в неспособности разрешить все белки в образце, учитывая их значительный диапазон уровней экспрессии и различные свойства. Сочетание размера пор, заряда, размера и формы белка может существенно влиять на скорость миграции, что приводит к дополнительным осложнениям. Второй количественный подход использует стабильные изотопные метки для дифференциальной маркировки белков из двух различных сложных смесей. В этом методе белки в сложной смеси сначала изотопно маркируются, а затем подвергаются расщеплению для получения меченых пептидов. Затем меченые смеси объединяются, пептиды разделяются с помощью многомерной жидкостной хроматографии и анализируются тандемной масс-спектрометрией. Широко используемыми изотопными метками являются реагенты ICAT (изотопно-кодированные аффинные метки). В этом методе цистеиновые остатки белков ковалентно присоединяются к реагенту ICAT, тем самым снижая сложность смеси за счет исключения нецистеиновых остатков. Количественная протеомика с использованием стабильной изотопной маркировки является все более полезным инструментом в современной разработке. Во-первых, химические реакции использовались для введения меток в определенные участки или белки с целью изучения специфических функций белка. Выделение фосфорилированных пептидов было достигнуто с использованием изотопной маркировки и селективной химии для захвата фракции белка из сложной смеси. Во-вторых, технология ICAT была использована для дифференциации частично очищенных или очищенных макромолекулярных комплексов, таких как крупный комплекс преинициации РНК-полимеразы II и белки, комплексированные с дрожжевым фактором транскрипции. В-третьих, маркировка ICAT недавно была объединена с изоляцией хроматина для идентификации и количественной оценки белков, связанных с хроматином. Наконец, реагенты ICAT полезны для протеомного профилирования клеточных органелл и специфических клеточных фракций. В настоящее время этот метод позволяет исследовать несколько тысяч белков, обычно из биологических жидкостей, таких как плазма, сыворотка или спинномозговая жидкость (СМЖ). Ключевым преимуществом этой технологии является возможность анализа сотен или тысяч образцов за разумное время (в течение нескольких дней или недель); методы, основанные на масс-спектрометрии, не масштабируются до такого уровня пропускной способности образцов для протеомных анализов.

There are two mass spectrometry based methods currently used for protein profiling. The more established and widespread method uses high resolution, two dimensional electrophoresis to separate proteins from different samples in parallel, followed by selection and staining of differentially expressed proteins to be identified by mass spectrometry. Despite the advances in 2 DE and its maturity, it has its limits as well. The central concern is the inability to resolve all the proteins within a sample, given their dramatic range in expression level and differing properties. The combination of pore size, and protein charge, size and shape can greatly determine migration rate which leads to other complications. The second quantitative approach uses stable isotope tags to differentially label proteins from two different complex mixtures. Here, the proteins within a complex mixture are labeled isotopically first, and then digested to yield labeled peptides. The labeled mixtures are then combined, the peptides separated by multidimensional liquid chromatography and analyzed by tandem mass spectrometry. Isotope coded affinity tag (ICAT) reagents are the widely used isotope tags. In this method, the cysteine residues of proteins get covalently attached to the ICAT reagent, thereby reducing the complexity of the mixtures omitting the non cysteine residues. Quantitative proteomics using stable isotopic tagging is an increasingly useful tool in modern development. Firstly, chemical reactions have been used to introduce tags into specific sites or proteins for the purpose of probing specific protein functionalities. The isolation of phosphorylated peptides has been achieved using isotopic labeling and selective chemistries to capture the fraction of protein among the complex mixture. Secondly, the ICAT technology was used to differentiate between partially purified or purified macromolecular complexes such as large RNA polymerase II pre initiation complex and the proteins complexed with yeast transcription factor. Thirdly, ICAT labeling was recently combined with chromatin isolation to identify and quantify chromatin associated proteins. Finally ICAT reagents are useful for proteomic profiling of cellular organelles and specific cellular fractions. Currently this method can interrogate several thousand proteins, typically from biofluids such as plasma, serum or cerebrospinal fluid (CSF). A key differentiator for this technology is the ability to analyze hundreds or thousands of samples in a reasonable timeframe (a matter of days or weeks); mass spectrometry based methods are not scalable to this level of sample throughput for proteomics analyses.

Белокочанные чипсы

Балансирование использования масс-спектрометров в протеомике и медицине достигается применением белковых микромассивов. Цель белковых микромассивов – нанесение тысяч функциональных элементов для детекции белков с целью анализа биологических образцов. Примером является использование антительных массивов, в которых множество различных антител нанесено для обнаружения соответствующих антигенов в образце человеческой крови. Другой подход заключается в нанесении нескольких типов белков для изучения свойств, таких как белок-ДНК, белок-белок и белок-лиганд взаимодействия. В идеале, функциональные протеомические массивы должны содержать полный набор белков данного организма. Первая версия таких массивов состояла из 5000 очищенных белков дрожжей, нанесенных на стеклянные микроскопические слайды. Несмотря на успех первого чипа, внедрение белковых массивов оказалось более сложной задачей. С белками по своей природе работать значительно сложнее, чем с ДНК. Они обладают широким динамическим диапазоном, менее стабильны, чем ДНК, и их структуру сложно сохранить на стеклянных слайдах, хотя она необходима для большинства анализов. Глобальная технология ICAT имеет значительные преимущества перед технологиями протеиновых чипов. Недавние исследования, использующие конденсации кетонов и альдегидов, показали, что они наиболее подходят для маркировки in vitro или на поверхности клеток. Однако использование кетонов и альдегидов в качестве биоортогональных репортеров выявило медленную кинетику, указывающую на то, что, несмотря на эффективность маркировки, требуется высокая концентрация. Определенные белки могут быть обнаружены по их реактивности к азидным группам. Непротеиногенные аминокислоты могут нести азидные группы, которые реагируют с фосфинами в реакциях Штаудингера. Эта реакция уже использовалась для маркировки других биомолекул в живых клетках и животных. Область биоортогональных реакций расширяется и стимулирует дальнейшие применения в протеомике. Важно отметить ограничения и преимущества. Быстрые реакции могут создавать биоконъюгаты и обеспечивать высокие концентрации при небольшом количестве реагентов. Напротив, медленные кинетические реакции, такие как конденсация альдегидов и кетонов, хотя и эффективны, требуют высокой концентрации, что делает их экономически невыгодными.

Balancing the use of mass spectrometers in proteomics and in medicine is the use of protein micro arrays. The aim behind protein micro arrays is to print thousands of protein detecting features for the interrogation of biological samples. Antibody arrays are an example in which a host of different antibodies are arrayed to detect their respective antigens from a sample of human blood. Another approach is the arraying of multiple protein types for the study of properties like protein DNA, protein protein and protein ligand interactions. Ideally, the functional proteomic arrays would contain the entire complement of the proteins of a given organism. The first version of such arrays consisted of 5000 purified proteins from yeast deposited onto glass microscopic slides. Despite the success of first chip, it was a greater challenge for protein arrays to be implemented. Proteins are inherently much more difficult to work with than DNA. They have a broad dynamic range, are less stable than DNA and their structure is difficult to preserve on glass slides, though they are essential for most assays. The global ICAT technology has striking advantages over protein chip technologies. Recent studies using ketones and aldehydes condensations show that they are best suited for in vitro or cell surface labeling. However, using ketones and aldehydes as bioorthogonal reporters revealed slow kinetics indicating that while effective for labeling, the concentration must be high. Certain proteins can be detected via their reactivity to azide groups. Non proteinogenic amino acids can bear azide groups which react with phosphines in Staudinger ligations. This reaction has already been used to label other biomolecules in living cells and animals. The bioorthoganal field is expanding and is driving further applications within proteomics. It is worthwhile noting the limitations and benefits. Rapid reactions can create bioconjuctions and create high concentrations with low amounts of reactants. Contrarily slow kinetic reactions like aldehyde and ketone condensation while effective require a high concentration making it cost inefficient.

Открытие нового лекарства

Одним из важнейших достижений, полученных в результате изучения генов и белков человека, стало выявление потенциальных новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний. Это основано на информации о геноме и протеоме для идентификации белков, связанных с заболеванием, которые затем могут быть использованы компьютерным программным обеспечением в качестве мишеней для разработки новых лекарств. Например, если определенный белок вовлечен в развитие заболевания, его трехмерная структура предоставляет информацию, необходимую для создания препаратов, способных нарушать его функцию. Молекула, которая связывается с активным центром фермента, но не может быть высвобождена, приводит к инактивации фермента. Это лежит в основе новых инструментов для поиска лекарств, направленных на разработку препаратов для инактивации белков, участвующих в патологических процессах. По мере выявления генетических различий между индивидуумами, исследователи ожидают использовать эти методы для создания персонализированных лекарств, обладающих большей эффективностью для конкретного пациента. Протеомика также применяется для изучения сложных взаимодействий между растениями и насекомыми, что помогает выявить гены-кандидаты, участвующие в защитной реакции растений на поедание травоядными. Раздел протеомики, называемый химиопротеомикой, предоставляет широкий спектр инструментов и методов для определения белковых мишеней лекарственных препаратов.

Протеомика взаимодействия и белковые сети

Протеомика взаимодействия – это анализ белковых взаимодействий в масштабах от бинарных взаимодействий до протеома или сети в целом. Большинство белков функционируют посредством белок-белковых взаимодействий, и одной из целей протеомики взаимодействия является идентификация бинарных белковых взаимодействий, белковых комплексов и интерактомов. Существует несколько методов для изучения белок-белковых взаимодействий. Наиболее традиционным методом является анализ двух гибридов, а мощным современным методом – аффинная очистка с последующей протеомной масс-спектрометрией, использующей меченые белковые приманки. К другим методам относятся поверхностный плазмонный резонанс (SPR), белковые микромассивы, интерферометрия двойной поляризации, микромасштабный термофорез, анализ кинетического исключения, а также экспериментальные методы, такие как дисплей фагов, и вычислительные методы in silico. Знание белок-белковых взаимодействий особенно полезно при изучении биологических сетей и системной биологии, например, каскадов клеточной сигнализации и сетей регуляции генов (GRN, где знание взаимодействий белков с ДНК также является важным). Полнопротеомный анализ белковых взаимодействий и интеграция этих паттернов взаимодействия в более крупные биологические сети имеют решающее значение для понимания биологии на системном уровне.

Протеомика экспрессии

Протеомика экспрессии включает в себя анализ экспрессии белков в большем масштабе. Она помогает идентифицировать основные белки в конкретном образце, а также белки, дифференциально экспрессируемые в связанных образцах, например, в больных и здоровых тканях. Если белок обнаруживается только в образце, пораженном заболеванием, он может служить перспективной мишенью для разработки лекарств или диагностическим маркером. Белки с одинаковыми или схожими профилями экспрессии также могут быть функционально связаны между собой. Для проведения протеомики экспрессии используются такие технологии, как 2D PAGE и масс-спектрометрия. Понимание протеома, структуры и функции каждого белка, а также сложности белок-белковых взаимодействий, имеет решающее значение для разработки наиболее эффективных методов диагностики и лечения заболеваний в будущем. Например, протеомика широко используется для идентификации потенциальных биомаркеров (белков в биологических жидкостях, имеющих диагностическую ценность), идентификации бактериальных антигенов, являющихся мишенями иммунного ответа, и выявления возможных иммуногистохимических маркеров инфекционных или новообразований. Интересным применением протеомики является использование специфических белковых биомаркеров для диагностики заболеваний. Существует ряд методов, позволяющих выявлять белки, продуцируемые при конкретном заболевании, что способствует быстрой диагностике. К таким методам относятся вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание, ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) и масс-спектрометрия. Секретомика – это область протеомики, изучающая секретируемые белки и пути их секреции с использованием протеомических подходов, и она недавно стала важным инструментом для обнаружения биомаркеров заболеваний.

Протеогеномика

В протеогеномике протеомические технологии, такие как масс-спектрометрия, применяются для улучшения аннотаций генов. Параллельный анализ генома и протеома способствует выявлению посттрансляционных модификаций и протеолитических событий, особенно при сравнении различных видов (сравнительная протеогеномика).

Структурная протеомика

Структурная протеомика включает в себя масштабный анализ белковых структур. Она сравнивает структуры белков и помогает в определении функций вновь открытых генов. Структурный анализ также позволяет понять, к каким участкам белков связываются лекарственные препараты, и выявить места взаимодействия белков между собой. Это понимание достигается с помощью различных технологий, таких как рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия.

Биоинформатика для протеомики (протеомная информатика)

Большая часть данных протеомики собирается с помощью высокопроизводительных технологий, таких как масс-спектрометрия и микрочипы. Анализ этих данных и проведение сравнений вручную зачастую занимали недели или месяцы. По этой причине биологи и химики сотрудничают с учеными в области компьютерных наук и математиками для разработки программ и конвейеров для вычислительного анализа белковых данных. Используя методы биоинформатики, исследователи могут быстрее анализировать данные и осуществлять их хранение. Хорошим источником списков актуальных программ и баз данных является биоинформатический ресурс ExPASy. Области применения протеомики, основанной на биоинформатике, включают медицину, диагностику заболеваний, идентификацию биомаркеров и многое другое.

Идентификация белка

Масс-спектрометрия и микрочипы генерируют информацию о фрагментации пептидов, но не позволяют идентифицировать конкретные белки, присутствующие в исходной пробе. Из-за отсутствия идентификации отдельных белков, исследователям ранее приходилось самостоятельно расшифровывать пептидные фрагменты. Однако в настоящее время доступны программы для идентификации белков. Эти программы принимают последовательности пептидов, полученные в результате масс-спектрометрии и микрочипов, и выдают информацию о соответствующих или сходных белках. Это достигается за счет алгоритмов, реализованных в программе, которые выполняют сопоставление с белками из известных баз данных, таких как UniProt и PROSITE, для прогнозирования состава белковой фракции образца с определенной степенью достоверности.

Структура белка

Биомолекулярная структура формирует трехмерную конформацию белка. Понимание структуры белка способствует выявлению его взаимодействий и функций. Ранее трехмерную структуру белков можно было определить только методами рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии. Начиная с 2017 года, криоэлектронная микроскопия стала ведущим методом, решающим проблемы, связанные с кристаллизацией (в рентгеновской кристаллографии) и конформационной неопределенностью (в ЯМР); разрешение достигало 2,2 Å по состоянию на 2015 год. В настоящее время, благодаря биоинформатике, существуют компьютерные программы, способные в некоторых случаях предсказывать и моделировать структуру белков. Эти программы используют химические свойства аминокислот и структурные особенности известных белков для прогнозирования трехмерной модели исследуемых белков. Это также позволяет ученым моделировать белковые взаимодействия в большем масштабе. Помимо этого, биомедицинские инженеры разрабатывают методы, учитывающие гибкость белковых структур для проведения сравнений и прогнозов.

Постпереводные изменения

Большинство программ, доступных для анализа белков, не предназначены для работы с белками, подвергшимися посттрансляционным модификациям. Некоторые программы допускают внесение посттрансляционных модификаций для облегчения идентификации белка, но затем игнорируют эти модификации при дальнейшем анализе. Учет этих модификаций важен, поскольку они могут влиять на структуру белка. В свою очередь, вычислительный анализ посттрансляционных модификаций привлек внимание научного сообщества. Существующие программы для анализа посттрансляционных модификаций носят исключительно предсказательный характер. Химики, биологи и специалисты в области компьютерных наук совместно работают над созданием и внедрением новых подходов, позволяющих анализировать посттрансляционные модификации, эффект которых на структуру и функцию белка был экспериментально установлен.

Вычислительные методы изучения белковых биомаркеров

Одним из примеров использования биоинформатики и вычислительных методов является изучение белковых биомаркеров. Компьютерные прогностические модели показали, что во время беременности происходит интенсивный и разнообразный транспорт белков между матерью и плодом, который можно легко обнаружить неинвазивно в цельной материнской крови. Этот вычислительный подход позволил преодолеть основное ограничение – высокое содержание материнских белков, затрудняющее обнаружение белков плода, при проведении протеомного анализа крови матери. Компьютерные модели могут использовать ранее идентифицированные в цельной материнской крови транскрипты генов плода для создания комплексной протеомной сети новорожденного. Эти исследования показывают, что белки плода, обнаруженные в крови беременной женщины, происходят из различных тканей и органов развивающегося плода. Протеомные сети содержат множество биомаркеров, являющихся индикаторами развития, и демонстрируют потенциальное клиническое применение этой технологии для мониторинга нормального и аномального развития плода. Также была предложена информационно-теоретическая основа для поиска биомаркеров, интегрирующая информацию о биожидкостях и тканях. Этот новый подход использует функциональную синергию между определенными биожидкостями и тканями, что открывает возможности для клинически значимых результатов, недостижимых при рассмотрении тканей и биожидкостей по отдельности. Рассматривая тканевую биожидкость как информационный канал, можно выявить значимые прокси-сигналы биожидкостей и использовать их для целенаправленной разработки клинических диагностических средств. Кандидаты в биомаркеры затем прогнозируются на основе критериев передачи информации по тканево-жидкостным каналам. Значимые взаимосвязи между биожидкостями и тканями могут быть использованы для приоритизации клинической валидации биомаркеров, а также для анализа ковариации белков в отдельных клетках, отражающей биологические процессы, такие как формирование белковых комплексов, иммунные функции, клеточный цикл и подготовка раковых клеток к лекарственной устойчивости. Биологические системы подвержены различным возмущениям (клеточный цикл, дифференцировка клеток, канцерогенез, окружающая среда (биофизические факторы) и т.д.). Транскрипционные и трансляционные ответы на эти возмущения приводят к функциональным изменениям протеома, связанным с реакцией на стимул. Поэтому описание и количественная оценка масштабных изменений в протеоме, касающихся обилия белков, имеет решающее значение для более целостного понимания биологических явлений на уровне всей системы. Таким образом, протеомика может рассматриваться как дополнение к геномике, транскриптомике, эпигеномике, метаболомике и другим "омиксным" подходам в интегративных анализах, направленных на более полное определение биологических фенотипов. Например, "Атлас протеомов рака" предоставляет количественные данные об экспрессии примерно 200 белков в более чем 4000 образцах опухолей, сопоставленные с транскриптомными и геномными данными из "Атласа генома рака". Аналогичные наборы данных для других типов клеток, тканей и видов, особенно полученные с использованием глубокой тандемной масс-спектрометрии, станут бесценным ресурсом для исследований в таких областях, как биология рака, биология развития и стволовых клеток, медицина и эволюционная биология.

One example of the use of bioinformatics and the use of computational methods is the study of protein biomarkers. Computational predictive models have shown that extensive and diverse feto maternal protein trafficking occurs during pregnancy and can be readily detected non invasively in maternal whole blood. This computational approach circumvented a major limitation, the abundance of maternal proteins interfering with the detection of fetal proteins, to fetal proteomic analysis of maternal blood. Computational models can use fetal gene transcripts previously identified in maternal whole blood to create a comprehensive proteomic network of the term neonate. Such work shows that the fetal proteins detected in pregnant woman's blood originate from a diverse group of tissues and organs from the developing fetus. The proteomic networks contain many biomarkers that are proxies for development and illustrate the potential clinical application of this technology as a way to monitor normal and abnormal fetal development. An information theoretic framework has also been introduced for biomarker discovery, integrating biofluid and tissue information. This new approach takes advantage of functional synergy between certain biofluids and tissues with the potential for clinically significant findings not possible if tissues and biofluids were considered individually. By conceptualizing tissue biofluid as information channels, significant biofluid proxies can be identified and then used for the guided development of clinical diagnostics. Candidate biomarkers are then predicted based on information transfer criteria across the tissue biofluid channels. Significant biofluid tissue relationships can be used to prioritize clinical validation of biomarkers. and protein covariation across single cells which reflects biological processes such as protein complex formation, immune functions, as well as cell cycle and priming of cancer cells for drug resistance Biological systems are subject to a variety of perturbations (cell cycle, cellular differentiation, carcinogenesis, environment (biophysical), etc.). Transcriptional and translational responses to these perturbations results in functional changes to the proteome implicated in response to the stimulus. Therefore, describing and quantifying proteome wide changes in protein abundance is crucial towards understanding biological phenomenon more holistically, on the level of the entire system. In this way, proteomics can be seen as complementary to genomics, transcriptomics, epigenomics, metabolomics, and other omics approaches in integrative analyses attempting to define biological phenotypes more comprehensively. As an example, The Cancer Proteome Atlas provides quantitative protein expression data for ~200 proteins in over 4,000 tumor samples with matched transcriptomic and genomic data from The Cancer Genome Atlas. Similar datasets in other cell types, tissue types, and species, particularly using deep shotgun mass spectrometry, will be an immensely important resource for research in fields like cancer biology, developmental and stem cell biology, medicine, and evolutionary biology.

Протеома плазмы человека

Характеризация человеческой плазменной протеомы стала одной из главных целей в протеомике, но она также является наиболее сложной протеомой среди всех человеческих тканей. Помимо резидентных гемостатических белков, она содержит иммуноглобулины, цитокины, белковые гормоны и секретируемые белки, указывающие на инфекцию. Также в ней присутствуют белки, проникающие из тканей в результате циркуляции крови по различным органам. Таким образом, кровь содержит информацию о физиологическом состоянии всех тканей, а в сочетании с её доступностью делает протеом крови неоценимым для медицинских целей. Считается, что определение характеристик протеома плазмы крови – сложная задача. Глубина плазменной протеомы охватывает динамический диапазон более чем в 1010 между наиболее распространенным белком (альбумином) и наименее распространенным (некоторые цитокины) и считается одной из основных проблем протеомики. Временная и пространственная динамика дополнительно усложняет изучение человеческой плазменной протеомы. Скорость обновления некоторых белков значительно выше, чем у других, а белковый состав артерии может существенно отличаться от венозного. Все эти различия делают даже простейшую задачу – каталогизацию протеома – практически невыполнимой. Для решения этой проблемы необходимо расставить приоритеты. Одним из них является выделение наиболее значимого подмножества белков из всего протеома для создания диагностического инструмента. Кроме того, поскольку рак связан с усиленным гликозилированием белков, методы, ориентированные на эту часть молекул, также будут полезны. Подчеркнем: многопараметрический анализ лучше всего выявляет патологическое состояние. По мере развития этих технологий профили заболеваний должны постоянно сопоставляться с соответствующими изменениями экспрессии генов. Благодаря этим технологиям исследователи смогли изучать воспалительные процессы у мышей, наследуемость плазменных протеомов, а также влияние такого распространенного изменения образа жизни, как снижение веса, на плазменные протеомы.