Нанопорлы секвендеу: ДНҚ/РНҚ талдауы, жылдам нәтижелер, төмен құн. Вирустарды анықтау, геномдық зерттеулер, антибиотикке төзімділікті бақылау үшін қолданылады.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ДНҚ / РНК тізбектеу техникасы
DNA / RNA sequencing technique
Нанопоралық тізбектеу – биополимерлерді, әсіресе ДНҚ немесе РНК түріндегі полинуклеотидтерді тізбектеу үшін қолданылатын үшінші буын технологиясы. Нанопоралық тізбектеуді пайдаланып, ДНҚ немесе РНК-ның бір молекуласын ПТР көбейтуді немесе үлгіні химиялық түрде белгілеуді қажет етпей тізбектеуге болады. Нанопоралық тізбектеу салыстырмалы түрде төмен құнмен генотиптеу, тестілеуге жоғары жылдамдық және нәтижелерді нақты уақыт режимінде көрсету мүмкіндігімен үлгілерді жылдам өңдеуге мүмкіндік береді. Бұл әдіс туралы жарияланымдарда вирустық патогендерді жылдам анықтау, Эбола ауруын қадағалау, қоршаған ортаны мониторингтеу, азық-түлік қауіпсіздігін бақылау, адам геномын тізбектеу, өсімдік геномын тізбектеу, антибиотиктерге қарсы тұруды бақылау, гаплотипілеу және басқа да қолданыстар туралы мәліметтер келтірілген.
Nanopore sequencing is a third generation approach used in the sequencing of biopolymers — specifically, polynucleotides in the form of DNA or RNA. Using nanopore sequencing, a single molecule of DNA or RNA can be sequenced without the need for PCR amplification or chemical labeling of the sample. Nanopore sequencing has the potential to offer relatively low cost genotyping, high mobility for testing, and rapid processing of samples with the ability to display results in real time. Publications on the method outline its use in rapid identification of viral pathogens, monitoring ebola, environmental monitoring, food safety monitoring, human genome sequencing, plant genome sequencing, monitoring of antibiotic resistance, haplotyping and other applications.
Даму
Нанопоралық секвенирлеуді толыққанды жүзеге асыруға 25 жыл кетті. Бұл академиялық және индустриялық салалардың тығыз ынтымақтастығының нәтижесі болды. Нанопоралық секвенирлеу идеясын алғаш ұсынғандардың бірі Дэвид Димер еді. 1989 жылы ол РНК-ны бастапқы материалдан синтездеу жұмысының аясында, жұқа мембранаға енгізілген ақуыздық нанопора арқылы ДНК-ның бір тізбегін өткізу жоспарын жасады. Димер және оның командасы осы тәсіл ДНК секвенирлеуді жақсартуға әлеуетті екенін түсінген соң, келесі он жыл бойы оны сынап көрді. 1999 жылы Димер мен оның әріптестері «нанопоралық секвенирлеу» терминін қолданып, алғашқы мақала жариялады, ал екі жылдан кейін нанопора арқылы өтетін ДНК шаштығының суретін нақты уақытта түсірді. Нанопоралық секвенирлеудің тағы бір негізін 1990 жылдардан бастап тәуелсіз түрде стохастикалық сезімділікті – нанопора арқылы өтетін иондық токтың өзгеруін өлшеу арқылы заттың концентрациясы мен идентификациясын анықтайтын әдісті дамытқан Хаган Бейли басқарған команданың жұмысы құрады. 2005 жылға қарай Бейли ДНК-ны секвенирлеу әдісінде маңызды прогресс жасады және технологияны одан әрі дамытуға көмектесу үшін Oxford Nanopore компаниясын бірлесіп құрды. 2014 жылы компания өзінің алғашқы портативті нанопоралық секвенирлеу құрылғысын шығарды. Бұл ДНК секвенирлеуді кез келген жерде, тіпті шектеулі ресурстарға ие қашық аймақтарда жүргізуге мүмкіндік берді. Ол COVID-19 пандемиясында қолданылды. Әлемдегі SARS-CoV-2 вирусының геномдарының төрттен бірі қазір нанопоралық құрылғылармен секвенирлендірілген. Бұл технология сонымен қатар, халық денсаулығына қауіп төндіретін антимикробтық резистенттікпен күресу үшін маңызды құралды ұсынады.
Nanopore sequencing took 25 years to fully materialize. It involved close collaboration between academia and industry. One of the first people to put forward the idea for nanopore sequencing was David Deamer. In 1989 he sketched out a plan to drive a single strand of DNA through a protein nanopore embedded into a thin membrane as part his work to synthesize RNA from scratch. Realizing that the same approach might hold potential to improve DNA sequencing, Deamer and his team spent the next decade testing it out. In 1999 Deamer and his colleagues published the first paper using the term 'nanopore sequencing' and two years later produced an image capturing a hairpin of DNA passing through a nanopore in real time. Another foundation for nanopore sequencing was laid by the work of a team led by Hagan Bayley who from the 1990s began to independently develop stochastic sensing, a technique that measures the change in an ionic current passing through a nanopore to determine the concentration and identity of a substance. By 2005 Bayley had made substantial progress with the method to sequence DNA and co founded Oxford Nanopore to help push the technology further. In 2014 the company released its first portable nanopore sequencing device. This made it possible for DNA sequencing to be carried out almost anywhere, even in remote areas with limited resources. It has been used in the COVID 19 pandemic. A quarter of all the world's SARS CoV 2 viral genomes have now been sequenced with nanopore devices. The technology also offers an important tool for combating antimicrobial resistance, a growing public health threat.
Анықтау қағидалары
Нанопоралар орналасқан биологиялық немесе қатты күйдегі мембрана электролит ерітіндісімен қоршалған. Мембрана ерітіндіні екі камераға бөледі. Мембранаға айырмашылық кернеуі қолданылады, бұл зарядталған бөлшектерді – осы жағдайда иондарды – қозғалысқа келтіретін электр өрісін тудырады. Бұл құбылыс электрофорез деп аталады. Иондардың жеткілікті жоғары концентрациясында электролит ерітіндісі жақсы таралады және кернеудің барлық түсуі нанопораның жанында және ішінде жинақталады. Бұл ерітіндідегі зарядталған бөлшектер электр өрісінен күшті тек нанопора аймағына жақын болғанда ғана сезінеді дегенді білдіреді. Бұл аймақ көбінесе ұстау аймағы деп аталады. Ұстау аймағының ішінде иондар бағытталған қозғалысқа ие, ол мембранаға жақын орналасқан электродтар арқылы тұрақты иондық ток ретінде тіркеледі. Енді бір камераға ДНК немесе белок сияқты наноөлшемді полимерді енгізейік. Бұл молекуланың да электр өрісінен күш сезінетін белгілі бір заряды бар, ол ұстау аймағында кездеседі.
The biological or solid state membrane, where the nanopore is found, is surrounded by electrolyte solution. The membrane splits the solution into two chambers. A bias voltage is applied across the membrane inducing an electric field that drives charged particles, in this case the ions, into motion. This effect is known as electrophoresis. For high enough concentrations, the electrolyte solution is well distributed and all the voltage drop concentrates near and inside the nanopore. This means charged particles in the solution only feel a force from the electric field when they are near the pore region. This region is often referred as the capture region. Inside the capture region, ions have a directed motion that can be recorded as a steady ionic current by placing electrodes near the membrane. Imagine now a nano sized polymer such as DNA or protein placed in one of the chambers. This molecule also has a net charge that feels a force from the electric field when it is found in the capture region.
Базаның идентификациясы
Нанопораның бетіндегі электр тогының тығыздығы нанопораның өлшемдеріне және нанопораны толтырып тұрған ДНК немесе РНК құрамына байланысты. ДНК-ны тізбектеу мүмкін болды, себебі үлгілер нанопора арнасынан өтетін кезде, нанопора арқылы өтетін электр тогының тығыздығында ерекше өзгерістер тудырады. Нанопора арнасынан өткен жалпы заряд, t1 және t2 уақыт аралығында нанопораның бірлік нормальдық беті бойынша электр тогының тығыздығы ағынының беттік интегралына тең.
The magnitude of the electric current density across a nanopore surface depends on the nanopore's dimensions and the composition of DNA or RNA that is occupying the nanopore. Sequencing was made possible because, passing through the channel of the nanopore, the samples cause characteristic changes in the density of the electric current flowing through the nanopore. The total charge flowing through a nanopore channel is equal to the surface integral of electric current density flux across the nanopore unit normal surfaces between times t1 and t2.
Биологиялық
Биологиялық нанопоралық секвенирлеу, әсіресе липидтік мембраналарға енген және нанометрлік масштабтағы "саңылаулармен" жабдықталған, өлшемге тәуелді кезекті беттер құру үшін трансмембраналық ақуыздарды, атап айтқанда ақуыздық токсиндерден құралған нанопораларды пайдалануға негіделген. ДНҚ немесе РНҚ липидтік мембраналардың тесіктері арқылы жылжуын жеңілдететін әртүрлі ақуыздарды қосу арқылы жеткілікті төмен транслокациялық жылдамдыққа қол жеткізу мүмкін.
Biological nanopore sequencing relies on the use of transmembrane proteins, called protein nanopores, in particular, formed by protein toxins, that are embedded in lipid membranes so as to create size dependent porous surfaces with nanometer scale "holes" distributed across the membranes. Sufficiently low translocation velocity can be attained through the incorporation of various proteins that facilitate the movement of DNA or RNA through the pores of the lipid membranes.
Альфа гемолизин
Альфа-гемолизин (αHL), бактериялардан шығатын және қызыл қан жасушаларының лизисін тудыратын нанопор, 15 жылдан астам уақыт бойы зерттеліп келеді. Осыған дейін жасалған зерттеулер αHL поры арқылы өлшенген иондық ток арқылы барлық төрт негізді анықтауға болатынын көрсетті. αHL құрылымы пор арқылы өтетін нақты негіздерді анықтауға қолайлы. αHL порының ұзындығы ~10 нм, оның ішінде екі 5 нм-лік бөлік бар. Жоғарғы бөлімі үлкен, вестибюль тәрізді құрылымнан, ал төменгі бөлімі үш мүмкін тану орнынан (R1, R2, R3) тұрады және әрбір негізді ажырата алады. Келесі ұсынылған қадам – αHL порына экзонуклеазаны байланыстыру. Фермент жеке негіздерді үнемі кесіп тұрады, бұл порға бірінен соң бірі келетін негіздерді анықтауға мүмкіндік береді. Экзонуклеазаны биологиялық порға қосу ДНК-ның пор арқылы транслокациясын баяулатып, деректерді алудың дәлдігін арттырады. Алайда, теориялық тұрғыдан алғанда, экзонуклеаза ферменттерін пайдаланып тізбектеу мүмкін емес екені көрсетілді. Бұл негізінен диффузиялық эффектілерге байланысты, ол әр нуклеотидтің кесілген кезде ұсталу ықтималдығына шектеу қояды. Нәтижесінде, нуклеотид ірі көлемге диффузияланбастан бұрын ұсталмауының немесе ретінен шығып ұсталуының жоғары ықтималдығы туындайды, сондықтан нанопор оны дұрыс тізбектей алмайды, бұл қосымша және жою қателеріне әкеледі. Демек, бұл әдіс тиімді стратегия деп есептелгенге дейін маңызды өзгерістер енгізу қажет. Жақында жасалған зерттеу αHL-нің пордың төменгі жартысындағы екі бөлек жерде нуклеотидтерді анықтауға қабілетті екенін көрсетті. R1 және R2 орындары әрбір негізді пор арқылы өтетін кезде екі рет бақылауға мүмкіндік береді, нәтижесінде 4-ке орналасқан 16 түрлі өлшенетін иондық ток мәндері пайда болады. Бұл әдіс нанопор арқылы бір рет оқуға қарағанда, нанопор бойынша оқылатын реттік орындарды екі есе көбейту арқылы жақсартады.
Alpha hemolysin (αHL), a nanopore from bacteria that causes lysis of red blood cells, has been studied for over 15 years. To this point, studies have shown that all four bases can be identified using ionic current measured across the αHL pore. The structure of αHL is advantageous to identify specific bases moving through the pore. The αHL pore is ~10 nm long, with two distinct 5 nm sections. The upper section consists of a larger, vestibule like structure and the lower section consists of three possible recognition sites (R1, R2, R3), and is able to discriminate between each base. The next proposed step is to bind an exonuclease onto the αHL pore. The enzyme would periodically cleave single bases, enabling the pore to identify successive bases. Coupling an exonuclease to the biological pore would slow the translocation of the DNA through the pore, and increase the accuracy of data acquisition. Notably, theorists have shown that sequencing via exonuclease enzymes as described here is not feasible. This is mainly due to diffusion related effects imposing a limit on the capture probability of each nucleotide as it is cleaved. This results in a significant probability that a nucleotide is either not captured before it diffuses into the bulk or captured out of order, and therefore is not properly sequenced by the nanopore, leading to insertion and deletion errors. Therefore, major changes are needed to this method before it can be considered a viable strategy. A recent study has pointed to the ability of αHL to detect nucleotides at two separate sites in the lower half of the pore. The R1 and R2 sites enable each base to be monitored twice as it moves through the pore, creating 16 different measurable ionic current values instead of 4. This method improves upon the single read through the nanopore by doubling the sites that the sequence is read per nanopore.
MspA
Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) – ДНК тізбектеу үшін қазіргі уақытта зерттеп жатқан екінші биологиялық нанопора. MspA поры αHL-ге қарағанда жақсырақ құрылымы болғандықтан, оны жақсарту мүмкіндігі ретінде анықталды. Бұл пора қалың жиегі бар келіш тәрізді, ал пораның түбіндегі диаметрі 1,2 нм-ге тең. Табиғи MspA формасы мен диаметрі ДНК тізбектеуге қолайлы болғанымен, бір тізбекті ДНК (ssDNA) транслокациясын шектеуші теріс зарядталған өзегіне ие. Транслокацияны жақсарту үшін табиғи нанопора үш теріс зарядталған аспартик қышқылының орнына бейтарап аспарагинмен алмастырылды. Мембрана арқылы нуклеотидтердің электр тогы арқылы анықталуы αHL-ге қарағанда негіздерді анықтауда он есе дәл екені көрсетілді. MspA электр тогы арқылы анықтаумен пептидтерді тізбектеуге де қолданылуы мүмкін.
Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) is the second biological nanopore currently being investigated for DNA sequencing. The MspA pore has been identified as a potential improvement over αHL due to a more favorable structure. The pore is described as a goblet with a thick rim and a diameter of 1.2 nm at the bottom of the pore. A natural MspA, while favorable for DNA sequencing because of shape and diameter, has a negative core that prohibited single stranded DNA(ssDNA) translocation. The natural nanopore was modified to improve translocation by replacing three negatively charged aspartic acids with neutral asparagines. The electric current detection of nucleotides across the membrane has been shown to be tenfold more specific than αHL for identifying bases. MspA with electric current detection can also be used to sequence peptides.
Қатты күйі
Қатты күйдегі нанопоралық тізбектеу әдістері, биологиялық нанопоралық тізбектеуден өзгеше, өз жүйелеріне ақуыздарды қоспайды. Оның орнына, қатты күйдегі нанопоралық технологияда әртүрлі металл немесе металл қорытпасынан жасалған, нанометрлік өлшемдегі тесіктерге ие субстраттар қолданылады, олар ДНК немесе РНК-ның өтуіне мүмкіндік береді. Бұл субстраттар нуклеин қышқылдарының тізбегін анықтауда маңызды рөл атқарады, себебі олар осы субстраттардың арналары арқылы жылжу кезінде танылады.
Solid state nanopore sequencing approaches, unlike biological nanopore sequencing, do not incorporate proteins into their systems. Instead, solid state nanopore technology uses various metal or metal alloy substrates with nanometer sized pores that allow DNA or RNA to pass through. These substrates most often serve integral roles in the sequence recognition of nucleic acids as they translocate through the channels along the substrates.
Туннельдеу ағыны
Нанопоралар арқылы ssДНҚ транслокацияланғанда базалар арқылы электрондық туннельдеуді өлшеу – бұл қатты күйдегі нанопораларды секвенирлеудің жетілдірілген әдісі. Көптеген зерттеулер негіздерді электрондық туннельдеу арқылы анықтау мүмкіндігін дәлелдеуге бағытталған. Бұл зерттеулер сканерлі зондты микроскопты сезімталдық электроды ретінде пайдалану арқылы жүргізілді және нақты туннельдеу тогы арқылы базаларды анықтауға болатыны көрсетілді. Принциптік зерттеулерден кейін, қатты күйдегі тесік пен сезімтал құрылғыларды байланыстыратын функционалдық жүйе құру қажет. Гарвард нанопора тобының зерттеушілері қатты күйдегі тесіктерді бір қабырғалы көміртек нанотүтіктермен, тесіктің диаметріне сәйкес етіп жасады. Тесіктер массиві құрылады және химиялық будың осаздануы арқылы массив бойынша өсетін нанотүтіктер жасалады. Нанотүтік тесік арқылы өскеннен кейін, тесіктің диаметрі қажетті өлшемге дейін реттеледі. Нанотүтік пен тесіктің сәтті жасалуы – ssДНҚ қатты күйдегі тесік арқылы транслокацияланғанда базаларды анықтауға қарай маңызды қадам. Тағы бір әдіс – тесіктің екі жағында наноэлектродтарды қолдану. Электродтар екі электрод арасында қатты күйдегі нанопораның пайда болуын қамтамасыз ету үшін арнайы жасалған. Бұл технология базаларды сезіну үшін ғана емес, сонымен қатар базалардың транслокация жылдамдығы мен бағытын басқаруға көмектеседі.
Measurement of electron tunneling through bases as ssDNA translocates through the nanopore is an improved solid state nanopore sequencing method. Most research has focused on proving bases could be determined using electron tunneling. These studies were conducted using a scanning probe microscope as the sensing electrode, and have proved that bases can be identified by specific tunneling currents. After the proof of principle research, a functional system must be created to couple the solid state pore and sensing devices. Researchers at the Harvard Nanopore group have engineered solid state pores with single walled carbon nanotubes across the diameter of the pore. Arrays of pores are created and chemical vapor deposition is used to create nanotubes that grow across the array. Once a nanotube has grown across a pore, the diameter of the pore is adjusted to the desired size. Successful creation of a nanotube coupled with a pore is an important step towards identifying bases as the ssDNA translocates through the solid state pore. Another method is the use of nanoelectrodes on either side of a pore. The electrodes are specifically created to enable a solid state nanopore's formation between the two electrodes. This technology could be used to not only sense the bases but to help control base translocation speed and orientation.
Флуоресценция
ДНҚ тізбесін анықтаудың тиімді әдісі қатты күйдегі нанопоралар мен флуоресценцияны пайдаланып жасалды. Бұл флуоресценттік реттілік әдісі әрбір негізді флуоресценттік зондқа байланатын бірнеше нуклеотидтердің ерекше белгісіне айналдырады, осылайша қос тізбекті ДНҚ (dsDNA) құрайды. Ұсынылған екі түсті жүйеде әрбір негіз екі түрлі флуоресценция арқылы анықталады және екі нақты тізбекке айналады. Зондтардың құрамында әрбір тізбектің басында флюорофор, ал соңында сөндіргіш болады. Әрбір флюорофор алдыңғы тізбектің соңындағы сөндіргішпен сөндіріледі. ДСДНҚ қатты күйдегі нанопорадан өтетін кезде зондтың тізбегі ажыратылады, соның нәтижесінде ағын бағытындағы флюорофор жарқырайды. Бұл реттілік әдісі бір пор үшін секундына 50 250 негізді анықтауға мүмкіндік береді, ал төрт түсті флюорофор жүйесі (әрбір негізді екі емес, бір тізбекке айналдыру мүмкіндігі) секундына 500-ден астам негізді тізбектей алады. Сонымен қатар, егін эпидемиологиясы және басқа да жаңа буынның реттілік технологияларымен де қолданылады.
An effective technique to determine a DNA sequence has been developed using solid state nanopores and fluorescence. This fluorescence sequencing method converts each base into a characteristic representation of multiple nucleotides which bind to a fluorescent probe strand forming dsDNA. With the two color system proposed, each base is identified by two separate fluorescences, and will therefore be converted into two specific sequences. Probes consist of a fluorophore and quencher at the start and end of each sequence, respectively. Each fluorophore will be extinguished by the quencher at the end of the preceding sequence. When the dsDNA is translocating through a solid state nanopore, the probe strand will be stripped off, and the upstream fluorophore will fluoresce. This sequencing method has a capacity of 50 250 bases per second per pore, and a four color fluorophore system (each base could be converted to one sequence instead of two), will sequence over 500 bases per second. and crop epidemiology. along with other next generation sequencing technologies.
Биологиялық: артықшылықтары мен кемшіліктері
Биологиялық нанопоралық тізбектеу жүйелерінің бірнеше маңызды ерекшеліктері бар, олар қатты күйдегі жүйелерге қарағанда артықшылықты етеді. Осы жобалау тәсілінің әрбір пайдалы ерекшелігі технологияға ақуыздарды қосу арқылы туындайды. Біркелкі тесік құрылымы, тесік арналары арқылы сынаманың транслокациясын дәл бақылау, тіпті сынамадағы жеке нуклеотидтерді анықтау әртүрлі организмдерден алынған бірегей ақуыздардың көмегімен жеңілдетілуі мүмкін. Биологиялық нанопоралық тізбектеу жүйелерінде ақуыздарды пайдалану, түрлі артықшылықтарына қарамастан, кейбір теріс сипаттамаларды да әкеледі. Бұл жүйелердегі ақуыздардың жергілікті орта стресіне сезімталдығы құрылғылардың қызмет ету мерзіміне елеулі әсер етеді. Мысалы, моторлы ақуыз тек белгілі бір pH диапазонында ғана жеткілікті жылдамдықпен сынамаларды аша алады, ал диапазоннан тыс жерлерде тиісті жылдамдықпен жұмыс істемейді. Бұл шектеу тізбектеу блогының толық функционалдығына әсер етеді. Тағы бір мысал, трансмембраналық порин бұзылуға ұшырамас бұрын белгілі бір рет жұмыс істей алады. Бұл екі мысалдың екеуі де кез келген тиімді биологиялық нанопоралық жүйені жобалау кезінде ескерілуі керек, және мұндай технологияның бағасын мүмкіндігінше төмен ұстау және басқа жүйелермен бәсекелесуді қамтамасыз ету қиын болуы мүмкін. MinION технологиясының өнімділігін жақсарту үшін алгоритмдік әдістер сияқты әртүрлі техникалар қолданылды. Соңғы кезде екіншілік құрылымға немесе босатылған мононуклеотидтерге байланысты жеке негіздердің әсері көрсетілді. 2010 жылы Хаган Бейли альфа-гемолизин тесігінде екі тану орны құру негізді тануда артықшылықтар бере алатынын ұсынды, онда процессивті фермент жеке негіздерді дұрыс ретпен нанопораға жеткізеді. Экзонуклеаза және нанопораны анықтау жүйелерін біріктірудің бір жолы осылай болып табылады. Атап айтқанда, мәселе мынада: экзонуклеаза ДНК-дағы нуклеотидтер арасындағы фосфодиэстерлік байланыстарды гидролиздегенде, содан кейін босатылған нуклеотидтің жақын маңдағы альфа-гемолизин нанопорына тікелей өтуіне кепілдік жоқ. 2009 жылы бір идея экзонуклеазаны нанопораға, мүмкін бета-баррель гемолизинге биотинилдендіру арқылы қосу болды. Ақуыздың орталық тесігі зарядталған қалдықтармен қапталған болуы мүмкін, сондықтан оң және теріс зарядтар тесіктің қарама-қарсы жақтарында орналасады. Алайда, бұл механизм негізінен дискриминациялық және нуклеотидтерді белгілі бір жолға бағыттау механизмін құрамайды.
Biological nanopore sequencing systems have several fundamental characteristics that make them advantageous as compared with solid state systems with each advantageous characteristic of this design approach stemming from the incorporation of proteins into their technology. Uniform pore structure, the precise control of sample translocation through pore channels, and even the detection of individual nucleotides in samples can be facilitated by unique proteins from a variety of organism types. The use of proteins in biological nanopore sequencing systems, despite the various benefits, also brings with it some negative characteristics. The sensitivity of the proteins in these systems to local environmental stress has a large impact on the longevity of the units, overall. One example is that a motor protein may only unzip samples with sufficient speed at a certain pH range while not operating fast enough outside of the range this constraint impacts the functionality of the whole sequencing unit. Another example is that a transmembrane porin may only operate reliably for a certain number of runs before it breaks down. Both of these examples would have to be controlled for in the design of any viable biological nanopore system something that may be difficult to achieve while keeping the costs of such a technology as low and as competitive, to other systems, as possible. Various techniques including algorithmic have been used to improve the performance of the MinION technology since it was first made available to users. More recently effects of single bases due to secondary structure or released mononucleotides have been shown. In 2010 Hagan Bayley proposed that creating two recognition sites within an alpha hemolysin pore may confer advantages in base recognition. where a processive enzyme feeds individual bases, in the correct order, into the nanopore, has been to integrate the exonuclease and the nanopore detection systems. In particular, the problem is that when an exonuclease hydrolyzes the phosphodiester bonds between nucleotides in DNA, the subsequently released nucleotide is not necessarily guaranteed to directly move into, say, a nearby alpha hemolysin nanopore. In 2009, one idea has been to attach the exonuclease to the nanopore, perhaps through biotinylation to the beta barrel hemolysin. The central pore of the protein may be lined with charged residues arranged so that the positive and negative charges appear on opposite sides of the pore. However, this mechanism is primarily discriminatory and does not constitute a mechanism to guide nucleotides down some particular path.