Введение
Техника секвенирования ДНК / РНК.
Нанопоровое секвенирование – это технология третьего поколения, используемая для секвенирования биополимеров, в частности полинуклеотидов в форме ДНК или РНК. С помощью нанопорового секвенирования можно секвенировать одну молекулу ДНК или РНК без необходимости ПЦР-амплификации или химической маркировки образца. Нанопоровое секвенирование обладает потенциалом для обеспечения относительно недорогого генотипирования, высокой мобильности при проведении тестов и быстрой обработки образцов с возможностью отображения результатов в реальном времени. В публикациях, посвященных этому методу, описано его применение для быстрой идентификации вирусных патогенов, мониторинга вируса Эбола, экологического мониторинга, контроля безопасности пищевых продуктов, секвенирования генома человека, секвенирования генома растений, мониторинга устойчивости к антибиотикам, гаплотипирования и других областей применения.
Разработка
Нанопоровое секвенирование потребовало 25 лет для полной реализации. Его развитие стало возможным благодаря тесному сотрудничеству между научными учреждениями и промышленностью. Одним из первых, кто предложил идею нанопорового секвенирования, был Дэвид Димер. В 1989 году он разработал план проталкивания одноцепочечной ДНК через белковый нанопор, встроенный в тонкую мембрану, в рамках своей работы по синтезу РНК с нуля. Понимая, что аналогичный подход может улучшить секвенирование ДНК, Димер и его команда в течение следующего десятилетия занимались его тестированием. В 1999 году Димер и его коллеги опубликовали первую статью, в которой использовался термин «нанопоровое секвенирование», а два года спустя получили изображение, запечатлевшее прохождение шпильки ДНК через нанопор в реальном времени. Еще одним фундаментом для нанопорового секвенирования стала работа команды под руководством Хагана Бейли, который с 1990-х годов независимо разрабатывал стохастическое зондирование – метод, измеряющий изменение ионного тока, проходящего через нанопор, для определения концентрации и идентификации вещества. К 2005 году Бейли добился существенного прогресса в применении этого метода для секвенирования ДНК и основал компанию Oxford Nanopore, чтобы способствовать дальнейшему развитию технологии. В 2014 году компания представила свое первое портативное устройство для нанопорового секвенирования. Это позволило проводить секвенирование ДНК практически в любом месте, даже в отдаленных районах с ограниченными ресурсами. Оно использовалось во время пандемии COVID-19. Четверть всех геномов вируса SARS-CoV-2 в мире на сегодняшний день секвенирована с использованием нанопоровых устройств. Эта технология также является важным инструментом в борьбе с антимикробной устойчивостью, представляющей собой растущую угрозу общественному здоровью.
Принципы обнаружения
Биологическая или твердотельная мембрана, в которой находится нанопора, окружена раствором электролита. Мембрана разделяет раствор на две камеры. На мембрану подается напряжение, создающее электрическое поле, которое заставляет заряженные частицы, в данном случае ионы, двигаться. Этот эффект известен как электрофорез. При достаточно высоких концентрациях раствор электролита хорошо распределен, и всё падение напряжения концентрируется вблизи и внутри нанопоры. Это означает, что заряженные частицы в растворе ощущают силу электрического поля только когда они находятся вблизи поры. Этот участок часто называют областью захвата. Внутри области захвата ионы движутся направленно, что можно зарегистрировать в виде устойчивого ионного тока, разместив электроды рядом с мембраной. Теперь представьте себе наноразмерный полимер, например ДНК или белок, помещенный в одну из камер. Эта молекула также имеет собственный заряд, который ощущает силу электрического поля, когда она оказывается в области захвата.
Идентификация базы
Величина плотности электрического тока на поверхности нанопоры зависит от размеров нанопоры и состава ДНК или РНК, находящихся в нанопоре. Секвенирование стало возможным благодаря тому, что образцы, проходя через канал нанопоры, вызывают характерные изменения плотности электрического тока, протекающего через неё. Полный заряд, протекающий через канал нанопоры, равен поверхностному интегралу потока плотности электрического тока по нормалям к поверхности нанопоры в интервале времени от t1 до t2.
Биологические
Биологическое секвенирование нанопор основано на использовании трансмембранных белков, называемых белковыми нанопорами, в частности, формируемых белковыми токсинами, которые внедряются в липидные мембраны для создания пористых поверхностей, проницаемость которых зависит от размера, с нанометровыми "отверстиями", распределенными по мембранам. Достаточно низкая скорость транслокации может быть достигнута за счет включения различных белков, облегчающих перемещение ДНК или РНК через поры липидных мембран.
Альфа-гемолизин
Альфа-гемолизин (αHL), нанопора из бактерий, вызывающая лизис красных кровяных телец, изучается уже более 15 лет. К настоящему моменту исследования показали, что все четыре основания можно идентифицировать, измеряя ионный ток через пору αHL. Структура αHL благоприятна для идентификации специфических оснований, перемещающихся через пору. Длина поры αHL составляет около 10 нм, с двумя различными участками по 5 нм. Верхний участок состоит из более крупной структуры, напоминающей вестибюль, а нижний участок содержит три возможных сайта распознавания (R1, R2, R3) и способен различать каждое основание. Следующим предлагаемым шагом является связывание экзонуклеазы с порой αHL. Фермент будет периодически расщеплять отдельные основания, позволяя поре идентифицировать последовательные основания. Соединение экзонуклеазы с биологической порой замедлит транслокацию ДНК через пору и повысит точность сбора данных. Примечательно, что теоретические исследования показали, что секвенирование с использованием экзонуклеазных ферментов, как описано здесь, не представляется возможным. Это в основном связано с эффектами диффузии, которые ограничивают вероятность захвата каждого нуклеотида в момент его расщепления. Это приводит к значительной вероятности того, что нуклеотид либо не будет захвачен до диффузии в основной объем, либо будет захвачен в неправильном порядке, и, следовательно, не будет правильно секвенирован нанопорой, что приведет к ошибкам вставки и делеции. Таким образом, прежде чем этот метод можно будет рассматривать как жизнеспособную стратегию, необходимо внести существенные изменения. Недавнее исследование показало, что αHL способен обнаруживать нуклеотиды в двух отдельных сайтах в нижней половине поры. Сайты R1 и R2 позволяют отслеживать каждое основание дважды по мере его прохождения через пору, создавая 16 различных измеримых значений ионного тока вместо 4. Этот метод улучшает однократное считывание через нанопору, удваивая количество сайтов, где последовательность считывается нанопорой.
МспА
Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) — второй биологический нанопор, который в настоящее время исследуется для секвенирования ДНК. Нанопор MspA был идентифицирован как потенциальное улучшение по сравнению с αHL благодаря более благоприятной структуре. Пора описывается как кубок с толстым ободком и диаметром 1,2 нм в нижней части. Нативный MspA, несмотря на благоприятные форму и диаметр для секвенирования ДНК, имеет отрицательно заряженный центр, препятствующий транслокации одноцепочечной ДНК. Нативный нанопор был модифицирован для улучшения транслокации путем замены трех отрицательно заряженных аспарагиновых кислот на нейтральные аспарагины. Электрическое детектирование нуклеотидов при прохождении через мембрану оказалось в десять раз более специфичным, чем у αHL, для идентификации оснований. MspA с электрическим детектированием также может быть использован для секвенирования пептидов.
Твердое состояние
Подходы к секвенированию нанопоров в твердом состоянии, в отличие от биологического секвенирования нанопоров, не содержат белки в своих системах. Вместо этого технология твердотельных нанопор использует различные металлические или металлические сплавы с нанометровыми порами, через которые проходит ДНК или РНК. Эти субстраты зачастую выполняют ключевую роль в распознавании последовательности нуклеиновых кислот при их транслокации по каналам в составе субстрата.
Туннельный ток
Измерение туннелирования электронов через основания при транслокации одноцепочечной ДНК (ssDNA) через нанопору является усовершенствованным методом секвенирования нанопоров в твердом состоянии. Большинство исследований были направлены на подтверждение возможности определения оснований с помощью туннелирования электронов. Эти исследования проводились с использованием сканирующего зондового микроскопа в качестве измерительного электрода и показали, что основания могут быть идентифицированы по специфическим туннельным токам. После подтверждения принципиальной возможности необходимо создать функциональную систему для интеграции твердотельных пор и измерительных устройств. Исследователи из Гарвардской группы по нанопорам разработали твердотельные поры с одностенными углеродными нанотрубками, пересекающими диаметр поры. Создаются массивы пор, а химическое осаждение из газовой фазы используется для выращивания нанотрубок, перекрывающих массив. После того, как нанотрубка перекроет пору, диаметр поры регулируется до необходимого размера. Успешное создание нанотрубки, интегрированной с порой, является важным шагом к идентификации оснований при транслокации ssDNA через твердотельную нанопору. Другой подход заключается в использовании наноэлектродов с обеих сторон поры. Электроды специально разработаны для формирования нанопоры твердого состояния между ними. Эта технология может быть использована не только для определения оснований, но и для контроля скорости и ориентации их транслокации.
Флуоресценция
Разработан эффективный метод определения последовательности ДНК с использованием твердотельных нанопор и флуоресценции. Этот метод флуоресцентного секвенирования преобразует каждое основание в характерное представление нескольких нуклеотидов, которые связываются с флуоресцентной нитью зонда, формируя двухцепочечную ДНК (дсДНК). В предложенной двухцветной системе каждое основание идентифицируется двумя различными флуоресценциями и, следовательно, преобразуется в две специфические последовательности. Зонды состоят из флюорофора и тушителя, расположенных соответственно в начале и в конце каждой последовательности. Каждый флюорофор гасится тушителем в конце предшествующей последовательности. Когда двухцепочечная ДНК транслоцируется через твердотельную нанопору, нить зонда отщепляется, и флюорофор, расположенный выше по потоку, начинает флуоресцировать. Этот метод секвенирования обладает пропускной способностью 50 250 оснований в секунду на одну пору, а четырехцветная система флюорофоров (когда каждое основание может быть преобразовано в одну последовательность вместо двух) позволит секвенировать более 500 оснований в секунду, наряду с другими технологиями секвенирования нового поколения, и использоваться в эпидемиологии сельскохозяйственных культур.
Биологические: преимущества и недостатки
Системы секвенирования биологических нанопор обладают рядом фундаментальных характеристик, которые делают их более выгодными по сравнению с системами на твердом состоянии, причем каждое преимущество данного подхода к проектированию обусловлено включением белков в их технологию. Однородная структура пор, точный контроль транслокации образца через каналы пор и даже обнаружение отдельных нуклеотидов в образцах могут быть облегчены уникальными белками различных типов организмов. Использование белков в биологических системах секвенирования нанопор, несмотря на многочисленные преимущества, также влечет за собой определенные недостатки. Чувствительность белков в этих системах к локальным экологическим стрессам существенно влияет на срок службы устройств в целом. Например, моторный белок может эффективно расплетать образцы только в определенном диапазоне pH, работая недостаточно быстро за его пределами – это ограничение сказывается на функциональности всей системы секвенирования. Другой пример: трансмембранный порин может надежно функционировать лишь в течение определенного числа прогонов, прежде чем выйдет из строя. Оба этих фактора необходимо учитывать при разработке любой жизнеспособной биологической системы нанопор – что может быть затруднительно, стремясь при этом сохранить стоимость технологии как можно ниже и обеспечить ее конкурентоспособность по сравнению с другими системами. Различные методы, включая алгоритмические, использовались для повышения производительности технологии MinION с момента ее появления у пользователей. В последнее время были продемонстрированы эффекты отдельных оснований, обусловленные вторичной структурой или высвобождаемыми мононуклеотидами. В 2010 году Хаган Бейли предположил, что создание двух центров распознавания внутри поры альфа-гемолизина может дать преимущества в распознавании оснований, где процессивный фермент последовательно подает отдельные основания в нанопору, интегрируя экзонуклеазу и систему детектирования нанопор. В частности, проблема заключается в том, что при гидролизе фосфодиэфирных связей между нуклеотидами в ДНК экзонуклеазой, высвободившийся нуклеотид не обязательно гарантированно сразу же перемещается, например, в расположенную поблизости нанопору альфа-гемолизина. В 2009 году была предложена идея присоединить экзонуклеазу к нанопоре, возможно, посредством биотинилирования к бета-баррельному гемолизину. Центральная полость белка может быть выстлана заряженными остатками, расположенными таким образом, чтобы положительные и отрицательные заряды находились на противоположных сторонах поры. Однако этот механизм носит преимущественно дискриминационный характер и не обеспечивает направляющего механизма для нуклеотидов по определенному пути.