Бактериялық геномдардағы Т-ДНК және өсімдіктерде гендік өзгеріс

Кіріспе

Бактериялық геномдардағы ДНҚ түрі. Трансферлік ДНҚ (қысқаша T ДНҚ) – Agrobacterium tumefaciens және Agrobacterium rhizogenes (нақтырақ айтқанда Ri плазмиді) сияқты кейбір бактериялардың ісік тудыратын (Ti) плазмидінің көшірілген ДНҚ-сы. T ДНҚ бактериядан қонақ өсімдіктің ядролық ДНҚ-геномына көшіріледі. Бұл арнайы ісік тудыратын (Ti) плазмидтің қабілеті ДНК-ны қонақ клеткаға көшіруге қажетті екі маңызды аймаққа байланысты. T ДНҚ әр екі шетінде 25 негіз жұптарынан тұратын қайталамалармен шектеледі. Көшіру оң жақ шекарадан басталып, сол жақ шекарада аяқталады және Ti плазмидінің vir гендерін қажет етеді. Бактериялық T ДНҚ шамамен 24 000 негіз жұбынан тұрады және өсімдікте экспрессияланатын, опиндер мен фитогормондарды синтездейтін ферменттерге кодтаушы гендерді қамтиды. T ДНҚ-ны өсімдік геномына көшіру арқылы бактерия өсімдік жасушаларын қайта бағдарлайды, нәтижесінде олар ісікке айналып, бактериялар үшін ерекше тағамдық көз болады. T ДНҚ-да кодталған ферменттердің өсімдік гормондары ауксин мен цитокинин синтезіне қатысуы өсімдік жасушасының шектен тыс өсуіне мүмкіндік береді, осылайша Agrobacterium tumefaciens инфекциясынан әдетте туындайтын тақталы өт ісіктері пайда болады. Agrobacterium rhizogenes ұқсас инфекцияны – шашты тамыр ауруын тудырады. Опиндер – бактериялар көміртек және энергия көзі ретінде пайдаланатын аминқышқылдарының туындылары. Өсімдіктердегі бұл табиғи көлденең гендердік тасымалдау процесі Agrobacterium tumefaciens арқылы шетелдік гендерді трансформациялау және инсерциялық мутагенез арқылы өсімдік биологиясының негізгі және қолданбалы зерттеулерінде құрал ретінде қолданылады. Өсімдік геномдарын Агробактерияны пайдалану арқылы T ДНҚ екі векторлы жүйесінде орналасқан тізбектерді жеткізу үшін өзгертуге болады.

Табиғаттағы трансформация механизмі

Т-ДНК-ның қабылдаушы жасушаға жұғу және оның ядросына интеграциялану процесі бірнеше қадамды қамтиды. Алдымен бактериялар жараның сөлінде көбейіп, инфекциялаудан бұрын өсімдік жасушасының қабырғасына жабысады. Бактериялық вирулентті гендердің шамамен 10 оперондық экспрессиясы, жарақаттанған өсімдік тінінен бөлінетін ацетосирингон сияқты фенолды қосылыстарды сезу арқылы белсендіріледі және жасушалардың өзара байланысынан кейін жүзеге асады. Содан кейін бұл процесс Агробактериядан қабылдаушы жасушаның цитоплазмасына макромолекулалық транслокациямен, Т-ДНК-ның (Т-кешені деп аталады) қатысты ақуыздарымен бірге қабылдаушы жасуша ядросына берілуімен, одан кейін Т-кешенінің ыдырауымен, Т-ДНК-ның қабылдаушы өсімдіктің геномына тұрақты интеграциялануымен және соңында берілген гендердің экспрессиясымен жалғасады. Т-ДНК-ның қабылдаушы геномға интеграциялануы Ti плазмидінің оң жақ шекарасында ДНК-да бір жіптік үзіліс пайда болуын қамтиды. Бұл үзіліс Т-ДНК генінің сол жақ шегінен кесілген оң жақ шегіне дейін бір жіптік ДНК аймағын жасайды. Содан кейін бір жіптік байланыстыратын ақуыздар бір жіптік ДНК-ға бекітеді. ДНК синтезі бір жіптік аймақты ығыстырып, сол жақ шекаралық аймақта екінші үзіліс бір жіптік Т-ДНК фрагментін босатады. Бұдан әрі бұл фрагментті қабылдаушы геномға енгізуге болады. Агробактерияның қабылдаушы жасуша ядросына енуі үшін қабылдаушы өсімдіктің қорғаныс реакциясының бірнеше жолдары үшін қабылдаушы өсімдік факторлары мен жасушалық процестерді пайдаланатын бақылау жүйесін дамытқаны белгілі. Т-ДНК-ны мақсатты қабылдаушы геномға интеграциялау үшін Агробактерия қабылдаушы өсімдік факторларымен көптеген өзара әрекеттесулерді жүзеге асырады. VirE2 – бұл бір жіптік ДНК-мен байланысатын ақуыз, ол кооперативтік байланыс арқылы қабылдаушы жасуша цитоплазмасындағы Т-жіпті жабады деп есептеледі. Содан кейін ол импортин a, бактериялық VirE3 және динеинге ұқсас ақуыздар сияқты қабылдаушы жасуша ақуыздарымен өзара әрекеттесу арқылы ядроға бағытталады. VirB5, VirB7 (Т-кешенінің шағын компоненттері), VirD5, VirE2, VirE3 және VirF сияқты бірнеше басқа бактериялық вируленттілік факторлары қабылдаушы өсімдік жасушаларының ақуыздарымен де өзара әрекеттесе алады.

The infection process of T DNA into the host cell and integration into its nucleus involve multiple steps. First, the bacteria multiply in the wound sap before infection and then attach to the plant cell walls. The bacterial virulence genes expression of approximately 10 operons is activated by perception of phenolic compounds such as acetosyringone emitted by wounded plant tissue and follows cell cell contact. Then this process proceeds with the macromolecular translocation from Agrobacterium to cytoplasm of host cell, transmission of T DNA along with associated proteins (called T complex) to the host cell nucleus followed by disassembly of the T complex, stable integration of T DNA into host plant genome, and eventual expression of the transferred genes. The integration of T DNA into a host genome involves the formation of a single stranded nick in the DNA at the right border of the Ti plasmid. This nick creates a region of single stranded DNA from the left border of the T DNA gene over to the right border which was cut. Then, single stranded binding proteins attach to the single stranded DNA. DNA synthesis displaces the single stranded region and then a second nick at the left border region releases the single stranded T DNA fragment. Further this fragment can be incorporated into a host genome. Agrobacterium has been known to evolve a control system that uses plant host factors and cellular processes for several pathways of host plant defense response to invade the host cell nucleus. For the integration of T DNA into the target host genome, Agrobacterium carries out multiple interactions with host plant factors. VirE2 is the single stranded DNA binding protein that presumably coats the T strand in the host cytoplasm by cooperative binding. It is then directed into the nucleus via interactions with the host cell proteins such as importin a, bacterial VirE3, and dynein like proteins. Several other bacterial virulence effectors like VirB5, VirB7 (the minor components of the T complex), VirD5, VirE2, VirE3, and VirF that may also interact with proteins of host plant cells.

Биотехнологиядағы қолдану

Агробактерия арқылы жүзеге асырылатын Т-ДНК трансфері биотехнологияда кеңінен қолданылатын құрал. Екі он жылдан астам уақыт бойы Agrobacterium tumefaciens өсімдіктерге гендерді енгізу және трансгендік егістерді коммерциялық өндіру үшін пайдаланылып келеді. Генетикалық инженерияда ісік тудыратын және опин синтезін қамтамасыз ететін гендер Т-ДНК-дан алынып, қызығушылық тудыратын генмен және/немесе трансформация сәтті жүргізілген өсімдіктерді анықтауға қажетті селекциялық маркермен алмастырылады. Селекциялық маркерлерге неомицин фосфотрансферазасы, гигромицин B фосфотрансферазасы (екеуі де антибиотиктерді фосфорилейді) және фосфинотрицин ацетилтрансферазасы (глютамин синтетазаның күшті тежегіші – фосфинотрицинды ацетилдеп, белсенділігін жояды) немесе Basta немесе Bialophos сияқты гербицидтік препараттар жатады. Фосфоманноза изомеразасы сияқты метаболикалық маркерлерді қолдануға болатын тағы бір селекциялық жүйе бар. Содан кейін Агробактерия генетикалық өзгертілген Т-ДНК-ны өсімдік жасушаларына жеткізу үшін вектор ретінде қолданылады, онда ол өсімдік геномына интеграцияланады. Бұл әдіс шетелдік генді тасымалдайтын трансгендік өсімдіктерді жасауға мүмкіндік береді. Agrobacterium tumefaciens монокотиледонды және дикотиледонды өсімдіктерге шетелдік ДНК-ны тиімді түрде жеткізе алады, өсімдіктердің генотипі, инфицирленген тіндердің түрі мен жасы, векторлардың түрі, Agrobacterium штаммдары, селекциялық маркерлер гендері мен селекциялық агенттер және тіндерді өсірудің әртүрлі жағдайлары сияқты маңызды факторларды ескере отырып. Бұл әсер еткен генді оқшаулауға мүмкіндік береді, осылайша оны Т-ДНК-ның қабырғалық тізбегі ретінде анықтауға болады. Репортерлік генді Т-ДНК-ның оң жағына плазмидалық репликациямен және антибиотикке (мысалы, гигромицинге) төзімділік генімен бірге қосып, трансформациялауға болады, бұл Arabidopsis thaliana-дағы сәтті Т-ДНК енгізілуінен туындаған гендердің бірігуінің шамамен 30% тиімділігін көрсетеді. Кері генетика белгілі геннің болжамды функциясын анықтау үшін оны бұзу және содан кейін осы туындаған мутацияның организмнің фенотипіне қандай әсер ететінін анылауды қамтиды. Т-ДНК таңбалау мутагенезі Т-ДНК енгізу мутациялары арқылы популяцияларды скринингтеуді қамтиды. Белгілі Т-ДНК мутацияларының жинағы жеке гендердің функцияларын зерттеу үшін ресурстарды ұсынады, бұл үлгілік өсімдік Arabidopsis thaliana үшін әзірленген. Arabidopsis thaliana-дағы Т-ДНК енгізу мутацияларының мысалдарына көптеген фенотиптік санаттар жатады, оның ішінде көшеттердің өлімі, мөлшерінің өзгеруі, пигменттік өзгерістер, эмбриондағы ақаулар, төмендетілген өнімділік және морфологиялық немесе физиологиялық бұрмаланған өсімдіктер кіреді.

Agrobacterium mediated T DNA transfer is widely used as a tool in biotechnology. For more than two decades, Agrobacterium tumefaciens has been exploited for introducing genes into plants for basic research as well as for commercial production of transgenic crops. In genetic engineering, the tumor promoting and opine synthesis genes are removed from the T DNA and replaced with a gene of interest and/or a selection marker, which is required to establish which plants have been successfully transformed. Examples of selection markers include neomycin phosphotransferase, hygromycin B phosphotransferase (which both phosphorylate antibiotics) and phosphinothricin acetyltransferase (which acetylates and deactivates phosphinothricin, a potent inhibitor of glutamine synthetase) or a herbicide formulations such as Basta or Bialophos. Another selection system that can be employed is usage of metabolic markers such as phospho mannose isomerase. Agrobacterium is then used as a vector to transfer the engineered T DNA into the plant cells where it integrates into the plant genome. This method can be used to generate transgenic plants carrying a foreign gene. Agrobacterium tumefaciens is capable of transferring foreign DNA to both monocotyledons and dicotyledonous plants efficiently while taking care of critically important factors like the genotype of plants, types and ages of tissues inoculated, kind of vectors, strains of Agrobacterium, selection marker genes and selective agents, and various conditions of tissue culture. the affected gene, thus allowing for its isolation as T DNA flanking sequences. A reporter gene can be linked to the right end of the T DNA to be transformed along with a plasmid replicon and a selectable antibiotic (such as hygromycin) resistance gene and can explicit approximately 30% of average efficiency having successful T DNA inserts induced gene fusions in Arabidopsis thaliana. Reverse genetics involves testing the presumed function of a gene that is known by disrupting it and then looking for the effect of that induced mutation on the organismal phenotype. T DNA tagging mutagenesis involves screening of populations by T DNA insertional mutations. Collections of known T DNA mutations provide resources to study the functions of individual genes, as developed for the model plant Arabidopsis thaliana. Examples of T DNA insertion mutations in Arabidopsis thaliana include those associated many classes of phenotypes including seedling lethals, size variants, pigment variants, embryo defectives, reduced fertility, and morphologically or physiologically aberrant plants.