Т-ДНК бактерий: механизм переноса и интеграции в геном растений.

Введение

Тип ДНК в бактериальных геномах

Трансферная ДНК (сокращенно T-ДНК) – это переносимый участок ДНК опухолеиндуцирующей (Ti) плазмиды некоторых видов бактерий, таких как Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes (фактически, плазмида Ri). T-ДНК переносится из бактерии в геном ядерной ДНК растения-хозяина. Способность этой специализированной опухолеиндуцирующей (Ti) плазмиды обусловлена двумя ключевыми областями, необходимыми для переноса ДНК в клетку-хозяина. T-ДНК ограничена 25-парными повторами на каждом конце. Перенос инициируется на правой границе и завершается на левой границе и требует генов vir Ti-плазмиды. Бактериальная T-ДНК имеет длину около 24 000 пар оснований и содержит гены, экспрессируемые растениями, кодирующие ферменты, синтезирующие опины и фитогормоны. Перенося T-ДНК в геном растения, бактерия фактически перепрограммирует растительные клетки для роста опухоли и производства уникального источника питания для бактерий. Синтез растительных гормонов ауксина и цитокинина ферментами, закодированными в T-ДНК, позволяет растительной клетке чрезмерно разрастаться, тем самым формируя опухоли коронового галла, обычно вызываемые инфекцией Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium rhizogenes вызывает аналогичную инфекцию, известную как заболевание волосатого корня. Опины – это производные аминокислот, используемые бактерией в качестве источника углерода и энергии. Этот естественный процесс горизонтального переноса генов у растений используется в качестве инструмента для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии растений посредством трансформации чужеродными генами и инсерционного мутагенеза, опосредованных Agrobacterium tumefaciens. Геномы растений могут быть модифицированы с использованием Agrobacterium для доставки последовательностей, содержащихся в бинарных векторах T-ДНК.

Механизм преобразования в природе

Процесс инфицирования Т-ДНК клеткой-хозяином и интеграции в ее ядро включает несколько этапов. Сначала бактерии размножаются в раневом соке перед инфицированием, а затем прикрепляются к клеточным стенкам растения. Экспрессия генов бактериальной вирулентности, включающая примерно 10 оперонов, активируется при восприятии фенольных соединений, таких как ацетосирингон, выделяемых поврежденной растительной тканью, и после контакта клеток. Затем этот процесс продолжается с макромолекулярной транслокацией от Agrobacterium в цитоплазму клетки-хозяина, переносом Т-ДНК вместе с ассоциированными белками (называемыми Т-комплексом) в ядро клетки-хозяина, последующей разборкой Т-комплекса, стабильной интеграцией Т-ДНК в геном растения-хозяина и, в конечном итоге, экспрессией перенесенных генов. Интеграция Т-ДНК в геном хозяина включает образование одноцепочечного разрыва в ДНК на правой границе плазмиды Ti. Этот разрыв создает область одноцепочечной ДНК от левой границы гена Т-ДНК до разрезанной правой границы. Затем к одноцепочечной ДНК присоединяются белки, связывающие одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Синтез ДНК вытесняет одноцепочечную область, а затем второй разрыв в левой пограничной области высвобождает одноцепочечный фрагмент Т-ДНК. Далее этот фрагмент может быть включен в геном хозяина. Известно, что Agrobacterium развила систему контроля, которая использует факторы растения-хозяина и клеточные процессы для нескольких путей ответа защиты растения-хозяина, чтобы проникнуть в ядро клетки-хозяина. Для интеграции Т-ДНК в геном хозяина Agrobacterium осуществляет множественные взаимодействия с факторами растения-хозяина. VirE2 – это белок, связывающий одноцепочечную ДНК, который, предположительно, покрывает Т-цепочку в цитоплазме хозяина посредством кооперативного связывания. Затем он направляется в ядро посредством взаимодействия с белками клетки-хозяина, такими как импортин α, бактериальный VirE3 и белки, подобные динеину. Несколько других бактериальных факторов вирулентности, таких как VirB5, VirB7 (минорные компоненты Т-комплекса), VirD5, VirE2, VirE3 и VirF, также могут взаимодействовать с белками клеток растений-хозяев.

The infection process of T DNA into the host cell and integration into its nucleus involve multiple steps. First, the bacteria multiply in the wound sap before infection and then attach to the plant cell walls. The bacterial virulence genes expression of approximately 10 operons is activated by perception of phenolic compounds such as acetosyringone emitted by wounded plant tissue and follows cell cell contact. Then this process proceeds with the macromolecular translocation from Agrobacterium to cytoplasm of host cell, transmission of T DNA along with associated proteins (called T complex) to the host cell nucleus followed by disassembly of the T complex, stable integration of T DNA into host plant genome, and eventual expression of the transferred genes. The integration of T DNA into a host genome involves the formation of a single stranded nick in the DNA at the right border of the Ti plasmid. This nick creates a region of single stranded DNA from the left border of the T DNA gene over to the right border which was cut. Then, single stranded binding proteins attach to the single stranded DNA. DNA synthesis displaces the single stranded region and then a second nick at the left border region releases the single stranded T DNA fragment. Further this fragment can be incorporated into a host genome. Agrobacterium has been known to evolve a control system that uses plant host factors and cellular processes for several pathways of host plant defense response to invade the host cell nucleus. For the integration of T DNA into the target host genome, Agrobacterium carries out multiple interactions with host plant factors. VirE2 is the single stranded DNA binding protein that presumably coats the T strand in the host cytoplasm by cooperative binding. It is then directed into the nucleus via interactions with the host cell proteins such as importin a, bacterial VirE3, and dynein like proteins. Several other bacterial virulence effectors like VirB5, VirB7 (the minor components of the T complex), VirD5, VirE2, VirE3, and VirF that may also interact with proteins of host plant cells.

Использование в биотехнологии

Трансфер Т-ДНК, опосредованный Agrobacterium, широко используется в качестве инструмента в биотехнологии. Более двух десятилетий Agrobacterium tumefaciens используется для введения генов в растения как для фундаментальных исследований, так и для коммерческого производства трансгенных культур. В генетической инженерии гены, вызывающие образование опухолей и синтез опинов, удаляются из Т-ДНК и заменяются геном интереса и/или селекционным маркером, необходимым для определения растений, успешно подвергшихся трансформации. Примеры селекционных маркеров включают неомицинфосфотрансферазу, гигромицин B фосфотрансферазу (обе фосфорилируют антибиотики) и фосфинотрицин ацетилтрансферазу (которая ацетилирует и деактивирует фосфинотрицин, мощный ингибитор глутаминсинтетазы) или гербицидные препараты, такие как Basta или Bialophos. Другой системой отбора может быть использование метаболических маркеров, таких как фосфоманнозная изомераза. Затем Agrobacterium используется в качестве вектора для переноса модифицированной Т-ДНК в клетки растений, где она интегрируется в геном растения. Этот метод позволяет создавать трансгенные растения, несущие чужеродный ген. Agrobacterium tumefaciens способен эффективно переносить чужеродную ДНК как в монокотиледоновые, так и в двудольные растения, учитывая критически важные факторы, такие как генотип растений, тип и возраст инфицированных тканей, тип векторов, штаммы Agrobacterium, гены селекционных маркеров и селективные агенты, а также различные условия культивирования тканей. Таким образом, можно изолировать затронутый ген вместе с фланкирующими последовательностями Т-ДНК. Репортерный ген может быть связан с правым концом Т-ДНК для трансформации вместе с плазмидным репликоном и геном устойчивости к селективному антибиотику (например, гигромицину) и может проявлять примерно 30% средней эффективности, индуцируя генные слияния с успешными вставками Т-ДНК в Arabidopsis thaliana. Обратная генетика включает в себя проверку предполагаемой функции известного гена путем его инактивации и последующего наблюдения за эффектом этой индуцированной мутации на фенотип организма. Мутагенез с помощью Т-ДНК-маркировки включает скрининг популяций на наличие вставных мутаций Т-ДНК. Коллекции известных мутаций Т-ДНК предоставляют ресурсы для изучения функций отдельных генов, как это было разработано для модельного растения Arabidopsis thaliana. Примеры вставных мутаций Т-ДНК в Arabidopsis thaliana включают в себя мутации, связанные с различными классами фенотипов, включая летальные мутации для проростков, варианты размера, варианты пигментации, дефекты эмбрионального развития, снижение фертильности и морфологически или физиологически аномальные растения.

Agrobacterium mediated T DNA transfer is widely used as a tool in biotechnology. For more than two decades, Agrobacterium tumefaciens has been exploited for introducing genes into plants for basic research as well as for commercial production of transgenic crops. In genetic engineering, the tumor promoting and opine synthesis genes are removed from the T DNA and replaced with a gene of interest and/or a selection marker, which is required to establish which plants have been successfully transformed. Examples of selection markers include neomycin phosphotransferase, hygromycin B phosphotransferase (which both phosphorylate antibiotics) and phosphinothricin acetyltransferase (which acetylates and deactivates phosphinothricin, a potent inhibitor of glutamine synthetase) or a herbicide formulations such as Basta or Bialophos. Another selection system that can be employed is usage of metabolic markers such as phospho mannose isomerase. Agrobacterium is then used as a vector to transfer the engineered T DNA into the plant cells where it integrates into the plant genome. This method can be used to generate transgenic plants carrying a foreign gene. Agrobacterium tumefaciens is capable of transferring foreign DNA to both monocotyledons and dicotyledonous plants efficiently while taking care of critically important factors like the genotype of plants, types and ages of tissues inoculated, kind of vectors, strains of Agrobacterium, selection marker genes and selective agents, and various conditions of tissue culture. the affected gene, thus allowing for its isolation as T DNA flanking sequences. A reporter gene can be linked to the right end of the T DNA to be transformed along with a plasmid replicon and a selectable antibiotic (such as hygromycin) resistance gene and can explicit approximately 30% of average efficiency having successful T DNA inserts induced gene fusions in Arabidopsis thaliana. Reverse genetics involves testing the presumed function of a gene that is known by disrupting it and then looking for the effect of that induced mutation on the organismal phenotype. T DNA tagging mutagenesis involves screening of populations by T DNA insertional mutations. Collections of known T DNA mutations provide resources to study the functions of individual genes, as developed for the model plant Arabidopsis thaliana. Examples of T DNA insertion mutations in Arabidopsis thaliana include those associated many classes of phenotypes including seedling lethals, size variants, pigment variants, embryo defectives, reduced fertility, and morphologically or physiologically aberrant plants.