Кіріспе

Генетикалық инженерияда қолданылатын құрылғы

Генетикалық инженерияда гендік қару немесе биолистік бөлшектерді жеткізу жүйесі – жасушаларға экзогенді ДНК (трансгендер), РНК немесе белокты жеткізуге арналған құрылғы. Ауыр металл бөлшектерін қызығушылық тудыратын генмен қаптау және осы микропрожектильдерді механикалық күшпен жасушаларға жіберу арқылы қажетті генетикалық ақпаратты кез келген жасушаға енгізуге болады. ДНК-ны мұндай микропрожектильдер арқылы жеткізу әдісі көбінесе "биологиялық баллистика" деген сөздің қысқартылған түрі – биолистика деп аталады. Бұл құрылғы жасушаның кез келген түрін өзгерте алады және тек ядроны ғана емес, сонымен қатар пластидтер мен митохондрияларды қоса, органеллаларды да өзгерте алады.

Гендік қаруы

Гендік қару бастапқыда Crosman ауа пистолеті болып, тығыз вольфрам бөлшектерін атуға бейімделген. Оны Джон С. Санфорд, Эд Вольф және Нельсон Аллен Корнелл университетінде 1983 және 1986 жылдар аралығында DuPont-тың Тед Клейнімен бірлесіп ойлап тапты. Бастапқы нысана – пияз (үлкен жасуша өлшемдері үшін таңдалған), ал құрылғы ДНК транскрипті дұрыс енгізілген жағдайда сигнал беретін маркерлі генмен қапталған бөлшектерді жеткізу үшін қолданылды. Генетикалық трансформация пияз жасушаларындағы маркерлі геннің экспрессиясы байқалғанда дәлелденді. Ең алғашқы арнайы жасалған гендік қарулар (Нельсон Аллен жасаған) 22 калибрлі Douglas ұңғысына полиэтилен цилиндрін (оқты) итеру үшін 22 калибрлі шеге қағу патронын пайдаланды. Генетикалық материалмен қапталған вольфрам ұнтағының тамшысы оққа орналастырылып, төмендегі Петри табақшасына атылды. Оқ Петри табақшасының астындағы дискке біріктірілді, ал генетикалық материал үлгіге шашырады, бұл үлгінің ортасындағы қирату және шетіндегі жақсы трансформация сақинасын қамтитын «пончик» әсерін тудырды. Қару вакуумдық сорғыға қосылып, ату кезінде вакуумда орналастырылды. Алғашқы дизайн Rumsey Loomis (сол кездегі жергілікті машина жасау шеберханасы) тарапынан шектеулі өндіріске шығарылды. Biolistics, Inc компаниясы DuPont-қа гелийді жарылғыш емес итергіш ретінде пайдалану және үлгі тіндеріне зиянды азайту үшін көп дискілі соқтығысу жеткізу механизмін қоса алғанда, жаңартылған құрылғыны өндіру және тарату құқығын сатты. Генетикалық материалды жеткізу үшін алтын мен күміс сияқты басқа да ауыр металдар қолданылады, бірақ вольфрам оқ-дәрі тасымалдағыштарымен салыстырғанда алтынның цитотоксикалық әсері төмен болғандықтан артықшылыққа ие.

Биологиялық конструкция дизайны

Биолистік трансформация – ДНК-ның функционалдық фрагментінің – ДНК конструкциясы деп аталатын – мақсатты жасушаларға енуімен жүзеге асырылады. Ген конструкциясы – бұл мақсатты организмде дұрыс экспрессия үшін қажетті барлық реттеуші элементтерді қамтитын ДНК кассетасы. Ген конструкциялары трансформация процедурасының күтілетін нәтижесіне байланысты әртүрлі болуы мүмкін, бірақ барлық конструкциялар әдетте промоторлық тізбек, терминаторлық тізбек, қызығушылық тудыратын ген және репортерлік ген комбинациясын қамтиды. Промоторлар ген экспрессиясының орналасуын және деңгейін бақылайды және геннің "бағдаршамы мен газ педалы" ретінде жұмыс істейді. Терминаторлар дұрыс ген экспрессиясы үшін қажет және ДНК конструкциясында қызығушылық тудыратын геннің кодтау аймағынан кейін орналастырылады. Биолистік трансформация үшін жиі қолданылатын терминатор – Agrobacterium tumefaciens-тен алынған NOS терминаторы. Осы терминатордың генетикалық түрлендірілген өсімдіктерде жиі қолданылуына байланысты, рұқсат етілмеген ГМО дақылдарын бақылау үшін азық-түлік өнімдерінде оның болуын анықтауға бағытталған стратегиялар әзірленді. Репортерлік ген – таңдау маркерін кодтайтын ген – ДНК конструкцияларында жиі кездесетін элемент және дұрыс түрлендірілген жасушаларды іріктеу үшін қолданылады. Таңдауға алынатын маркер түрлендірілетін түрге байланысты болады, бірақ әдетте бұл клеткаларға белгілі бір гербицидтер немесе антибиотиктерге (мысалы, канамицин, гигромицин B немесе глифосат) қатысты детоксикация қабілетін беретін ген болады. Қосымша элементтер ДНК конструкциясының міндетті емес компоненттеріне мақсатты геномнан конструкцияны бақыланатын түрде жоюға мүмкіндік беретін cre-lox тізбектері сияқты элементтер кіреді. Мұндай элементтерді конструкцияны жасаушы олардың қызығушылық тудыратын негізгі генмен қатар арнайы функцияларды орындауы үшін таңдайды.

Қолдану

Гендік тапаншалар көбінесе өсімдік жасушаларымен қолданылады. Дегенмен, адамдар мен басқа жануарларда да қолдануға зор мүмкіндік бар.

Өсімдіктер

Гендік қарудың нысаны көбінесе дифференциацияланбаған өсімдік жасушаларының каллусы немесе Петри ыдысындағы гель ортасында өсіп келе жатқан дамымаған эмбриондар тобы болады. ДНҚ-мен қапталған алтын бөлшектері жасушаларға жеткізілгеннен кейін, ДНҚ транскрипция үшін матрица ретінде (уақытша экспрессия) пайдаланылады және кейде өсімдік хромосомасына ("тұрақты" трансформация) еніп кетеді. Егер жеткізілген ДНҚ құрамында таңдау маркері болса, тұрақты түрде трансформацияланған жасушаларды тіндер культурасы әдістерін қолдана отырып таңдап, өсіруге болады. Мысалы, егер жеткізілген ДНҚ құрамында антибиотиктерге немесе гербицидтерге төзімділік беретін ген болса, онда тұрақты түрде трансформацияланған жасушаларды тіндер культурасы ортасына осы антибиотиктерді немесе гербицидтерді қосу арқылы іріктеуге болады. Трансформацияланған жасушаларды ауксиндер мен гиббереллиндер сияқты өсімдік гормондарының бірнеше түрлерімен өңдеуге болады, олардың әрқайсысы бөлініп, бүтін өсімдіктің ұйымдасқан, мамандандырылған тіндеріне дифференциацияланады. Бұл толық қайта жарату қабілеті тотипотенция деп аталады. Сәтті трансформацияланған жасушадан пайда болған жаңа өсімдікте мұраға берілетін жаңа қасиеттер болуы мүмкін. Гендік қаруды *Agrobacterium tumefaciens* және оның Ti плазмидасын қолданып өсімдік жасушаларына ДНҚ енгізумен салыстыруға болады. Әртүрлі түрлерде трансформацияның әртүрлі әдістері үшін трансформация туралы қараңыз.

Адамдар мен басқа жануарлар

Гендік қарулар ДНК вакциналарын жеткізу үшін де қолданылған. Плазмидтерді егеуқұйрық нейрондарына, әсіресе DRG нейрондарына гендік қару арқылы жеткізу, Альцгеймер ауруы сияқты нейродегенеративті аурулардың әсерін зерттеуде фармакологиялық алғышарт ретінде де қолданылады. Гендік қару өсірілген тіндердегі жасушалардың белгілі бір топтарын таңбалау үшін кеңінен қолданылатын құралға айналды. Флуоресцентті ақуыздарды кодтайтын ДНК плазмидтерімен жасушаларды трансфекциялауға қоса, гендік қару жасушаларға түрлі маңызды бояуларды жеткізу үшін бейімделуге болады. Гендік қарумен бомбалау Caenorhabditis elegans-ты микроинъекцияға балама ретінде түрлендіру үшін де пайдаланылды.

Артықшылықтар

Биолистика генетикалық модификацияның әмбебап әдісі екенін дәлелдеді және трансформацияға төзімді дақылдарды, мысалы, астық дақылдарын жасау үшін көбінесе осы әдіс қолданылады. Атап айтқанда, Bt жүгерісі биолистика арқылы алынған өнім. Сонымен қатар, гендік қарумен енгізілген трансгенді хлоропласттың үндемей тұрғаны туралы ешқандай хабарлама жоқ. Бұған қоса, тәжірибелі техник бір ғана гендік қаруды қолдану арқылы кейбір түрлерде екі трансформацияланған организмді өндіре алады.

Шектеулер

Биолистика ДНК-ны мақсатты жасушаларға кездейсоқ енгізеді. Осылайша, ДНК клеткадағы кез келген геномға – ядролық, митохондриялық, плазмидалық немесе басқа да кез келген комбинацияда – трансформациялануы мүмкін, бірақ дұрыс конструкцияны жобалау бұл мүмкіндікті азайтуға көмектеседі. ДНК конструкциясының бірнеше үлгілерін жеткізу және біріктіру ықтималдығы бар, нәтижесінде енгізілген геннің экспрессия деңгейі мен көшірме саны әртүрлі болуы мүмкін. Бұл конструкциялардың басқа конструкциялардан генетикалық материал алмасу қабілетіне байланысты, кейбіреулері трансгенді мүлдем қамтымайды, ал басқалары бірнеше көшірмелерді алып жүреді; енгізілген көшірмелердің саны енгізілген конструкциядағы трансгеннің көшірмелерінің санына және енгізілген конструкциялардың жалпы санына байланысты. Сонымен қатар, эукариоттық конструкциялар гомологты рекомбинацияға емес, трансгеннің геномға ұқсас генетикалық тізбектерсіз интеграцияланатын заңды емес рекомбинацияға сүйенгендіктен, геномның белгілі бір жерлеріне бағытталмайды, егер трансген геномды өңдеу реагенттерімен бірге жеткізілмесе.