Введение

Устройство, используемое в генетической инженерии

В генетической инженерии генная пушка, или система доставки биолистических частиц, – это устройство, используемое для доставки экзогенной ДНК (трансгенов), РНК или белка в клетки. Покрывая частицы тяжелого металла геном, представляющим интерес, и вводя эти микропроектилы в клетки посредством механической силы, можно добиться интеграции желаемой генетической информации в нужные клетки. Метод доставки ДНК с использованием микропроектилов часто называют биолистикой, что является сокращением от "биологической баллистики". Это устройство способно трансформировать практически любой тип клеток и не ограничивается трансформацией ядра; оно также может трансформировать органеллы, включая пластиды и митохондрии.

Конструкция генного оружия

Генная пушка изначально была модифицированным пневматическим пистолетом Crosman, предназначенным для стрельбы плотными частицами вольфрама. Она была изобретена Джоном С. Санфордом, Эдом Вольфом и Нельсоном Алленом в Корнелльском университете совместно с Тедом Клейном из DuPont в период с 1983 по 1986 год. Первоначальной целью служил лук (выбранный из-за большого размера его клеток), а устройство использовалось для доставки частиц, покрытых геном-маркером, который передавал сигнал при правильной интеграции ДНК-транскрипта. Генетическая трансформация была продемонстрирована при наблюдении экспрессии гена-маркера в клетках лука. Первые изготовленные на заказ генные пушки (созданные Нельсоном Алленом) использовали патрон от гвоздезабивного пистолета калибра .22 для разгона полиэтиленового цилиндра (пули) по стволу калибра .22 Douglas. Капля вольфрамового порошка, покрытого генетическим материалом, помещалась на пулю и выстреливалась в чашку Петри, расположенную ниже. Пуля приваривалась к диску под чашкой Петри, а генетический материал разлетался по образцу с эффектом бублика – с разрушением в центре образца и кольцом успешной трансформации по периферии. Пушка была подключена к вакуумному насосу и помещалась под вакуум во время стрельбы. Ранняя конструкция была запущена в ограниченное производство компанией Rumsey Loomis (местная мастерская, расположенная на Mecklenburg Road в Итаке, штат Нью-Йорк, США). Biolistics, Inc. продала компании DuPont права на производство и распространение обновленного устройства с улучшениями, включая использование гелия в качестве не взрывоопасного пропеллента и механизм доставки с использованием нескольких дисков для минимизации повреждения тканей образца. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро, также используются для доставки генетического материала, при этом золото предпочтительнее из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями.

Дизайн биологического конструкта

Биологическая трансформация включает в себя интеграцию функционального фрагмента ДНК, известного как ДНК-конструкция, в клетки-мишени. Генная конструкция – это ДНК-кассета, содержащая все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в целевом организме. Хотя генные конструкции могут варьироваться в дизайне в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию промоторной последовательности, терминаторной последовательности, гена интереса и репортерного гена. Промоторы контролируют место и интенсивность экспрессии гена и функционируют как «руль и педаль газа» гена. Терминаторные последовательности необходимы для правильной экспрессии гена и располагаются после кодирующей области гена интереса в ДНК-конструкции. Распространенным терминатором для биолистической трансформации является NOS-терминатор, полученный из Agrobacterium tumefaciens. В связи с высокой частотой использования этого терминатора в генетически модифицированных растениях, были разработаны стратегии для обнаружения его присутствия в пищевых продуктах с целью мониторинга несанкционированных ГМ-культур. Репортерный ген – это ген, кодирующий селективный маркер, который является общим элементом в ДНК-конструкциях и используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбор селективного маркера зависит от трансформируемого вида, но обычно это ген, обеспечивающий клеткам способность к детоксикации определенных гербицидов или антибиотиков, таких как канамицин, гигромицин B или глифосат. Дополнительные элементы – необязательные компоненты ДНК-конструкции, включающие такие элементы, как последовательности cre-lox, которые позволяют контролируемо удалять конструкцию из целевого генома. Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным геном интереса.

Применение

Генные пистолеты в основном используются для работы с растительными клетками. Однако существует большой потенциал их применения и в отношении людей, и других животных.

Растения

Целью генной пушки часто является каллус из недифференцированных растительных клеток или группа незрелых зародышей, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После доставки частиц золота, покрытых ДНК, в клетки, ДНК используется как матрица для транскрипции (временной экспрессии), и иногда она интегрируется в хромосому растения ("стабильная" трансформация). Если доставленная ДНК-конструкция содержит селективный маркер, то стабильно трансформированные клетки могут быть отобраны и культивированы с использованием методов культуры тканей. Например, если доставленная ДНК-конструкция содержит ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотику или гербициду, то стабильно трансформированные клетки могут быть отобраны путем добавления этого антибиотика или гербицида в среду для культуры тканей. Трансформированные клетки можно обработать серией растительных гормонов, таких как ауксины и гиббереллины, и каждая из них может делиться и дифференцироваться в организованные, специализированные клетки тканей целого растения. Эта способность к полной регенерации называется тотипотентностью. Новое растение, полученное из успешно трансформированной клетки, может обладать новыми признаками, которые являются наследственными. Использование генной пушки можно сопоставить с использованием Agrobacterium tumefaciens и его Ti-плазмиды для введения ДНК в растительные клетки. Подробности о различных методах трансформации у разных видов см. в статье "Трансформация".

Люди и другие животные

Генные пистолеты также использовались для доставки ДНК-вакцин. Введение плазмид в нейроны крысы с помощью генного пистолета, в частности, DRG-нейронов, также применяется в качестве фармакологического прекурсора при изучении эффектов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Генный пистолет стал распространенным инструментом для мечения субпопуляций клеток в культивируемых тканях. Помимо возможности трансфекции клеток ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генный пистолет может быть адаптирован для доставки клеткам широкого спектра витальных красителей. Генная бомбардировка также использовалась для трансформации Caenorhabditis elegans в качестве альтернативы микроинъекции.

Преимущества

Биолистика доказала свою эффективность как универсальный метод генетической модификации и обычно предпочтительна для создания сельскохозяйственных культур, устойчивых к трансформации, таких как злаки. В частности, Bt-кукуруза была получена с помощью биолистики. Кроме того, не зафиксировано случаев подавления трансгена, внедренного с использованием генной пушки, хлоропластами. Более того, опытный специалист может получить два трансформированных организма у определенных видов всего одним выстрелом из генной пушки.

Ограничения

Биолистика случайным образом вводит ДНК в клетки-мишени. Таким образом, ДНК может быть трансформирована в любые геномы, присутствующие в клетке – ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя продуманная конструкция может это смягчить. Доставка и интеграция нескольких копий конструкции ДНК вполне возможны, что приводит к потенциально переменным уровням экспрессии и количеству копий вставленного гена. Это обусловлено способностью конструкций обмениваться генетическим материалом, в результате чего некоторые не содержат трансген, а другие – несколько копий; количество вставленных копий зависит как от числа копий трансгена в каждой вставленной конструкции, так и от общего числа вставленных конструкций. Кроме того, поскольку эукариотические конструкции полагаются на неаллельную рекомбинацию – процесс интеграции трансгена в геном без наличия схожих генетических последовательностей – а не на гомологичную рекомбинацию, их нельзя нацелить на конкретные участки генома, если только трансген не доставляется одновременно с инструментами для редактирования генома.