ДНК тізбегін анықтау процесі

ДНҚ тізбектемесі – ДНҚ-дағы нуклеотидтер ретін анықтау процесі. Биология, медицина, диагностика, биотехнология салаларында маңызды. Жылдам әдістер зерттеулерді үдетеді.

27 мин оқу

100%

Дереккөз: DNA sequencing — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Нуклеин қышқылының тізбегін анықтау процесі

ДНК секвенирлеу – ДНК-дағы нуклеотидтердің тізбегін анықтау процесі, яғни аденин, гуанин, цитозин және тимин негіздерінің реттілігін анықтау. Бұл төрт негіздің реттілігін анықтауға қолданылатын кез келген әдіс немесе технологияны қамтиды. ДНК-ны жылдам секвенирлеу әдістерінің пайда болуы биологиялық және медициналық зерттеулерді және жаңалықтарды едәуір жылдамдатты. ДНК тізбектерін білу негізгі биологиялық зерттеулерде, ДНК генографиялық жобаларында, сондай-ақ медициналық диагностика, биотехнология, сот биологиясы, вирусология және биологиялық систематика сияқты көптеген қолданбалы салаларда маңызды рөл атқарады. ДНК-ның сау және мутацияланған тізбектерін салыстыру арқасында түрлі ауруларды, оның ішінде әртүрлі қатерлі ісіктерді диагностикалауға, антидене репертуарын сипаттауға болады. ДНК-ны жылдам секвенирлеу медициналық көмекті жеделдетіп, жекелендіруге, сондай-ақ көптеген организмдерді анықтауға және тізімдеуге мүмкіндік береді. ДНК секвенирлеу оңайлатылып, едәуір жылдамдатылды.

Метагеномика

Метагеномика саласы суда, кәрізде, топырақта, ауадан сүзгіленген қоқыста немесе организмдерден алынған жағынды үлгілерде қандай организмдер бар екенін анықтауды қамтиды. Белгілі бір ортада қандай организмдердің болуын білу экология, эпидемиология, микробиология және басқа да салалардағы зерттеулер үшін маңызды. ДНК тізбектеу зерттеушілерге, мысалы, микробиомда қандай микробтар болуы мүмкін екенін анықтауға көмектеседі.

Вирусология

Вирустардың көпшілігі жарық микроскопымен көруге тым кішкентай болғандықтан, вирусты анықтау және зерттеу үшін вирусологияда секвенирлеу негізгі құралдардың бірі болып табылады. 1990 жылғы құс тұмауының жайылуы кезінде вирустық секвенирлеу арқылы тұмаудың кіші түрінің кескіл мен құстар арасындағы қайта жинақталу нәтижесінде пайда болғаны анықталды. Бұл Гонконгта тірі кескіл мен құстарды бірге сатуға тыйым салатын заң қабылдануына әкелді. Вирустық секвенирлеу молекулалық сағат әдісін қолдану арқылы вирустық жақынның қашан басталғанын бағалау үшін де пайдаланылуы мүмкін.

Медицина

Медициналық техниктер пациенттердің гендерін (немесе теориялық тұрғыдан алғанда, толық геномдарын) генетикалық аурулардың қаупін анықтау үшін тізбектейді. Бұл генетикалық тестілеудің бір түрі, бірақ кейбір генетикалық тестілеулер ДНК тізбектеуді қамтымайды. 2013 жылдан бастап ДНК тізбектеу сирек кездесетін ауруларды диагностикалау және емдеу үшін көбірек қолданыла бастады. Сирек кездесетін генетикалық ауруларды тудыратын гендердің саны арта келе, пациенттерге молекулалық диагноз қою жиі қолданылады. ДНК тізбектеу клиницистерге генетикалық ауруларды анықтауға, ауруды басқаруды жақсартуға, репродуктивтік кеңес беруге және тиімді терапиялар ұсынуға мүмкіндік береді. Гендік секвенирлеу панельдері күдікті аурудың бірнеше мүмкін генетикалық себептерін анықтау үшін қолданылады. Сондай-ақ, ДНК тізбектеу нақты бактерияларды анықтау үшін де пайдалы болуы мүмкін, бұл антибиотиктермен емдеуді дәлдеуге және бактерия популяциясында антимикробтық резистенттілік пайда болу қаупін азайтуға көмектеседі.

Сот-медициналық тергеу

ДНҚ тізбектеуді ДНҚ-ны анықтау әдістерімен қатар сот-медициналық идентификация және әкелік тестілеу үшін пайдалануға болады. ДНҚ тестілеуі соңғы ондаған жылдарда зор дамуға жетті, нәтижесінде ДНҚ іздерін зерттеліп жатқан нысанмен байланыстыру мүмкін болды. Саусақ іздері, сілекей, шаш түбірлері және т.б. ДНҚ үлгілері әрбір тірі организмді бір-бірінен ерекшелейді. ДНҚ-ны тексеру – ДНҚ тізбегіндегі белгілі геномдарды анықтап, бірегей және жеке үлгі жасауға мүмкіндік беретін техника.

Төрт каноникалық негіз

ДНҚ-ның каноникалық құрылымы төрт негізден тұрады: тимин (Т), аденин (А), цитозин (С) және гуанин (Г). ДНҚ-ның тізбектелуі – бұл ДНҚ молекуласындағы осы негіздердің физикалық реттілігін анықтау. Дегенмен, молекулада тағы да көптеген негіздер болуы мүмкін. Кейбір вирустарда (әсіресе бактериофагтарда) цитозин гидроксиметил немесе гидроксиметил глюкоза цитозинмен алмастырылуы мүмкін. Сүтқоректілердің ДНҚ-сында метил топтары немесе фосфосульфаттары бар өзгертілген негіздер кездеседі. Тізбектеу әдісіне байланысты, адамдарда жиі кездесетін 5mC (5-метилцитозин) сияқты белгілі бір өзгеріс анықталуы немесе анықталмауы мүмкін. Көбінесе барлық организмдерде ДНҚ тек 4 каноникалық негізді пайдаланып, тірі организмде (in vivo) синтезделеді; репликациядан кейін болатын өзгерістер 5-метил С сияқты басқа негіздерді жасайды. Алайда, кейбір бактериофагтар стандартты емес негізді тікелей қоса алады. Өзгерістерден басқа, ДНҚ үнемі қоршаған орта факторларының, мысалы, ультракүлгін сәулелер мен оттегі радикалдарының әсеріне ұшырайды. Қазіргі уақытта мұндай зақымдалған негіздердің болуы көптеген ДНҚ тізбектеу әдістерімен анықталмайды, бірақ PacBio бұл туралы жариялаған https://www.pacb.com/publications/direct-detection-and-sequencing-of-damaged-dna-bases/

ДНҚ құрылымы мен функциясының ашылуы

Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНК) алғаш рет 1869 жылы Фридрих Мишер тауып, оқшаулаған, бірақ көптеген онжылдықтар бойы жақсы зерттелмеді, өйткені өмірдің генетикалық жоспары ДНК-да емес, ақуыздарда сақталған деп есептелді. Бұл жағдай 1944 жылдан кейін Освальд Эвери, Колин МакЛеод және Маклин МакКарти жасаған тәжірибелердің нәтижесінде өзгерді, олар тазартылған ДНК бактериялардың бір штаммын екінші штаммға айналдыра алатынын көрсетті. ДНК жасушалардың қасиеттерін өзгерте алатыны алғаш рет осылай дәлелденді. 1953 жылы Джеймс Уотсон мен Фрэнсис Крик Розалинд Франклин зерттеген кристалдық рентген сәулелерінің құрылымдарына негізделген ДНК-ның қос спиральді моделін ұсынды. Модельге сәйкес, ДНК екі нуклеотидтік тізбектен тұрады, олар бір-біріне оралып, сутекті байланыстармен байланысқан және қарама-қарсы бағытта жүреді. Әрбір тізбек төрт толықтырылатын нуклеотидтен – адениннен (А), цитозиннен (С), гуаниннен (G) және тиминден (Т) – тұрады, бір тізбектегі А әрқашан екінші тізбектегі Т-мен, ал С әрқашан G-мен жұптасады. Олар мұндай құрылым әрбір тізбектің екіншісін қайта құруға мүмкіндік беретінін, ал бұл мұрагерлік ақпаратты ұрпақтан ұрпаққа берудің маңызды қағидасы екенін ұсынды. Ақуыздардың тізбегін анықтауға негіз салынған алғашқы жұмысты Фредерик Сангер жасады, ол 1955 жылға дейін ұйқы безі секрециялайтын кішкентай ақуыз – инсулиндегі барлық аминқышқылдарының тізбегін аяқтады. Бұл ақуыздар сұйықтықта еріген материалдың ретсіз қоспасы емес, нақты молекулалық құрылымы бар химиялық бірліктер екенін көрсететін алғашқы нақты дәлел болды. Сангердің инсулиннің тізбегін анықтаудағы жетістігі Ватсон мен Крик сияқты рентген кристаллографтарын одан әрі зерттеуге ынталандырды, олар ДНК жасуша ішінде ақуыздардың қалыптасуын қалай бақылайтынын түсінуге тырысып жатқан еді. 1954 жылдың қазан айында Фредерик Сангердің бірқатар лекцияларын тыңдағаннан кейін, Крик ДНК-дағы нуклеотидтердің орналасуы ақуыздағы аминқышқылдарының тізбегін анықтайтынын, ал бұл ақуыздың функциясын анықтауға көмектесетінін дәлелдейтін теорияны әзірлеуге кірісті. Ол бұл теорияны 1958 жылы жариялады.

Deoxyribonucleic acid (DNA) was first discovered and isolated by Friedrich Miescher in 1869, but it remained under studied for many decades because proteins, rather than DNA, were thought to hold the genetic blueprint to life. This situation changed after 1944 as a result of some experiments by Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty demonstrating that purified DNA could change one strain of bacteria into another. This was the first time that DNA was shown capable of transforming the properties of cells. In 1953, James Watson and Francis Crick put forward their double helix model of DNA, based on crystallized X ray structures being studied by Rosalind Franklin. According to the model, DNA is composed of two strands of nucleotides coiled around each other, linked together by hydrogen bonds and running in opposite directions. Each strand is composed of four complementary nucleotides – adenine (A), cytosine (C), guanine (G) and thymine (T) – with an A on one strand always paired with T on the other, and C always paired with G. They proposed that such a structure allowed each strand to be used to reconstruct the other, an idea central to the passing on of hereditary information between generations. The foundation for sequencing proteins was first laid by the work of Frederick Sanger who by 1955 had completed the sequence of all the amino acids in insulin, a small protein secreted by the pancreas. This provided the first conclusive evidence that proteins were chemical entities with a specific molecular pattern rather than a random mixture of material suspended in fluid. Sanger's success in sequencing insulin spurred on x ray crystallographers, including Watson and Crick, who by now were trying to understand how DNA directed the formation of proteins within a cell. Soon after attending a series of lectures given by Frederick Sanger in October 1954, Crick began developing a theory which argued that the arrangement of nucleotides in DNA determined the sequence of amino acids in proteins, which in turn helped determine the function of a protein. He published this theory in 1958.

РНК тізбектеу

РНК-ның тізбектелуі нуклеотидтерді тізбектеудің ең алғашқы түрлерінің бірі болды. РНК тізбектелуінің маңызды кезеңі – 1972 және 1976 жылдары Вальтер Фиерс және оның Гент университетіндегі (Гент, Бельгия) әріптестері анықтаған және жариялаған бірінші толық ген мен Бактериофаг MS2-нің толық геномы. РНК-ны дәстүрлі түрде тізбектеу үшін, тізбектелуге жарамды кДНК молекуласын жасау қажет.

ДНҚ-ны тізбектеудің алғашқы әдістері

ДНҚ тізбектерін анықтаудың алғашқы әдісі 1970 жылы Корнелл университетінде Рей Ву жасаған, нақты орнына қатысты праймерлік кеңейту стратегиясын қамтиды. Қазіргі секвенирлеу схемаларында маңызды орын алатын ДНК полимераза катализі және спецификалық нуклеотидтік белгілеу, ламбда-фаг ДНК-ның қосылатын ұштарын тізбектеу үшін қолданылды. 1970 және 1973 жылдар аралығында Ву, Р. Падманабхан және олардың әріптестері синтетикалық, нақты орнына қатысты праймерлерді пайдаланып, кез келген ДНҚ тізбегін анықтау үшін осы әдісті қолдануға болатынын көрсетті. Фредерик Сангер кейіннен бұл праймерлік кеңейту стратегиясын Кембридждегі MRC орталығында ДНҚ тізбектеудің жылдам әдістерін әзірлеу үшін пайдаланды және 1977 жылы "тізбек тоқтату ингибиторларымен ДНҚ тізбектеу" әдісін жариялады. 1973 жылы Гилберт және Максам 24 негіз жұбының тізбегін "қозғалмалы дақтарды талдау" әдісі арқылы анықтады. Тізбектеудегі жетістіктерге рекомбинантты ДНҚ технологиясының бір мезгілде дамуы көмектесті, бұл ДНҚ үлгілерін вирустардан басқа көздерден де оқшаулауға мүмкіндік берді.

Толық геномдарды секвенирлеу

1977 жылы алғаш рет толық ДНК геномы φX174 бактериофагы секвенирленді. 1984 жылы Медициналық зерттеулер кеңесінің ғалымдары Эпштейн-Барр вирусының толық ДНК тізбесін анықтады, оның құрамында 172 282 нуклеотид бар екенін тапты. Тізбектің толық аяқталуы ДНК секвенирлеуде маңызды кезең болды, себебі бұл вирустың генетикалық профилі туралы бұрынғы білімсіз жүзеге асырылды. Содан кейін GATC Biotech компаниясы "Direct Blotting Electrophoresis System GATC 1500" ДНК секвенсерін коммерциялық өнім ретінде ұсынды, ол Еуроодақтың геном секвенирлеу бағдарламасы аясында кеңінен қолданылды, нәтижесінде ашытқы Saccharomyces cerevisiae-нің II хромосомасының толық ДНК тізбегі анықталды. 1987 жылы Applied Biosystems компаниясы алғашқы толық автоматтандырылған ABI 370 секвенирлеу машинасымен және Dupont компаниясының Genesis 2000 машинасымен нарыққа шықты, ол жаңа флуоресценттік таңбалау технологиясын қолданды, бұл төрт дезоксинуклеотидті бір жолақта анықтауға мүмкіндік берді. 1990 жылы АҚШ Ұлттық денсаулық сақтау институты (NIH) Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans және Saccharomyces cerevisiae геномдарының ірі масштабты секвенирлеу сынақтарын бастады, олардың құны бір негізге 0,75 АҚШ долларына тең болды. Сол кезде Крейг Вентердің зертханасында экспрессиялық тізбектік тегтер деп аталатын адам кДНҚ тізбектерін секвенирлеу жұмысы басталды, бұл адам геномының кодтау бөлігін анықтауға бағытталған әрекет болды. 1995 жылы Вентер, Хамильтон Смит және Геномдық зерттеулер институтының (TIGR) әріптестері Haemophilus influenzae бактериясының – тіршілік ететін организмнің толық геномын жариялады. Дөңгелек хромосомасында 1 830 137 негіз бар, ал оның Science журналында жариялануы тұтас геномдық шабуылдау секвенирлеудің алғашқы жарияланған қолданылуын білдірді, бұл бастапқы картаға түсіру қажеттілігін жойды. 2001 жылы адам геномының жобалық тізбегін жасау үшін шабуылдау секвенирлеу әдістері қолданылды. 1990 жылдардың ортасы мен соңында ДНК секвенирлеудің бірнеше жаңа әдістері әзірленді және 2000 жылға қарай коммерциялық ДНК секвенирлегіштерде енгізілді. Сангер секвенирлеуі сияқты бұрынғы әдістерден ерекшелену үшін олар "келесі буын" немесе "екінші буын" секвенирлеу (NGS) әдістері деп аталды. Бірінші буын секвенирлеуден айырмашылығы, NGS технологиясы әдетте жоғары масштабты болып табылады, бұл бүкіл геномды бірден секвенирлеуге мүмкіндік береді. Әдетте, бұл геномды кішкентай фрагменттерге бөлу, фрагментті кездейсоқ түрде таңдау және оны төменде сипатталған әртүрлі технологиялардың бірімен секвенирлеу арқылы жүзеге асырылады. Бүкіл геномды секвенирлеуге мүмкіндік туады, себебі бірнеше фрагменттер бір уақытта секвенирленеді ("массивті параллель" секвенирлеу деп аталады) автоматтандырылған процесте. NGS технологиясы зерттеушілерге денсаулық туралы жаңа түсініктер табуға, антропологтарға адам тегін зерттеуге және "Жеке медицина" қозғалысын дамытуға үлкен мүмкіндік берді. Дегенмен, ол қателіктерге де жол ашты. NGS деректерінің есептеулік талдауын жүргізу үшін көптеген бағдарламалық құралдар бар, олар көбінесе CSI NGS порталы сияқты онлайн-платформаларда жинақталады, олардың әрқайсысының өзіндік алгоритмі бар. Тіпті бір бағдарламалық пакеттің ішіндегі параметрлер де талдау нәтижесін өзгерте алады. Сонымен қатар, ДНК секвенирлеу арқылы алынған үлкен деректер көлемі тізбек талдауы үшін жаңа әдістер мен бағдарламаларды әзірлеуді қажет етті. Осы қиындықтарды шешу үшін NGS саласында стандарттарды әзірлеуге бірнеше әрекеттер жасалды, олардың көпшілігі жеке зертханалардан туындаған шағын ауқымды әрекеттер болды. Соңғы уақытта FDA қаржыландырған үлкен, ұйымдастырылған жұмыс BioCompute стандартына айналды. 1990 жылдың 26 қазанында Роджер Циен, Пепи Росс, Маргарет Фанесток және Аллан Дж Джонстон ДНК массивтеріндегі (блоктар мен бір ДНК молекулалары) 3' блокерлерін алып тастау арқылы қадамдық ("негізден негізге") секвенирлеуді сипаттайтын патентке өтініш берді. 1996 жылы Пал Ньерен және оның студенті Мостафа Ронаги Стокгольмдегі Корольдік технология институтында пиросекуенттеу әдісін жариялады. 1997 жылдың 1 сәуірінде Паскаль Майер мен Лоран Фаринелли Дүниежүзілік зияткерлік меншік ұйымына ДНК колониясының тізбесін сипаттайтын патенттерге өтініш берді. Осы патентте сипатталған ДНК үлгісін дайындау және кездейсоқ полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) массивтеу әдістері, Роджер Циен және басқалардың "негізден негізге" секвенирлеу әдісімен бірге, қазір Illumina компаниясының HiSeq геномдық секвенирлегіштерінде қолданылады. 1998 жылы Вашингтон университетінің Фил Грин мен Брент Юинг секвенсерлік деректерді талдау үшін олардың phred сапалық бағасын сипаттады, бұл кеңінен қолданылған маңызды талдау техникасы және секвенирлеу платформасының дәлдігін бағалау үшін ең көп қолданылатын өлшемшарт болып табылады. Lynx Therapeutics 2000 жылы массивті параллель қолтаңбалық секвенирлеуді (MPSS) жариялады және сатты. Бұл әдіс параллельделген, адаптер/лигацияға негізделген, будақ негізіндегі секвенирлеу технологиясын қамтыды және бірінші коммерциялық қолжетімді "келесі буын" секвенирлеу әдісі болды, бірақ тәуелсіз зертханаларға ДНК секвенирлегіштері сатылмады.

The first full DNA genome to be sequenced was that of bacteriophage φX174 in 1977. Medical Research Council scientists deciphered the complete DNA sequence of the Epstein Barr virus in 1984, finding it contained 172,282 nucleotides. Completion of the sequence marked a significant turning point in DNA sequencing because it was achieved with no prior genetic profile knowledge of the virus. Followed by the commercialization of the DNA sequencer "Direct Blotting Electrophoresis System GATC 1500" by GATC Biotech, which was intensively used in the framework of the EU genome sequencing programme, the complete DNA sequence of the yeast Saccharomyces cerevisiae chromosome II. This was followed by Applied Biosystems' marketing of the first fully automated sequencing machine, the ABI 370, in 1987 and by Dupont's Genesis 2000 which used a novel fluorescent labeling technique enabling all four dideoxynucleotides to be identified in a single lane. By 1990, the U. S. National Institutes of Health (NIH) had begun large scale sequencing trials on Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, and Saccharomyces cerevisiae at a cost of US$0.75 per base. Meanwhile, sequencing of human cDNA sequences called expressed sequence tags began in Craig Venter's lab, an attempt to capture the coding fraction of the human genome. In 1995, Venter, Hamilton Smith, and colleagues at The Institute for Genomic Research (TIGR) published the first complete genome of a free living organism, the bacterium Haemophilus influenzae. The circular chromosome contains 1,830,137 bases and its publication in the journal Science marked the first published use of whole genome shotgun sequencing, eliminating the need for initial mapping efforts. By 2001, shotgun sequencing methods had been used to produce a draft sequence of the human genome.]] Several new methods for DNA sequencing were developed in the mid to late 1990s and were implemented in commercial DNA sequencers by 2000. Together these were called the "next generation" or "second generation" sequencing (NGS) methods, in order to distinguish them from the earlier methods, including Sanger sequencing. In contrast to the first generation of sequencing, NGS technology is typically characterized by being highly scalable, allowing the entire genome to be sequenced at once. Usually, this is accomplished by fragmenting the genome into small pieces, randomly sampling for a fragment, and sequencing it using one of a variety of technologies, such as those described below. An entire genome is possible because multiple fragments are sequenced at once (giving it the name "massively parallel" sequencing) in an automated process. NGS technology has tremendously empowered researchers to look for insights into health, anthropologists to investigate human origins, and is catalyzing the "Personalized Medicine" movement. However, it has also opened the door to more room for error. There are many software tools to carry out the computational analysis of NGS data, often compiled at online platforms such as CSI NGS Portal, each with its own algorithm. Even the parameters within one software package can change the outcome of the analysis. In addition, the large quantities of data produced by DNA sequencing have also required development of new methods and programs for sequence analysis. Several efforts to develop standards in the NGS field have been attempted to address these challenges, most of which have been small scale efforts arising from individual labs. Most recently, a large, organized, FDA funded effort has culminated in the BioCompute standard. On 26 October 1990, Roger Tsien, Pepi Ross, Margaret Fahnestock and Allan J Johnston filed a patent describing stepwise ("base by base") sequencing with removable 3' blockers on DNA arrays (blots and single DNA molecules). In 1996, Pål Nyrén and his student Mostafa Ronaghi at the Royal Institute of Technology in Stockholm published their method of pyrosequencing. On 1 April 1997, Pascal Mayer and Laurent Farinelli submitted patents to the World Intellectual Property Organization describing DNA colony sequencing. The DNA sample preparation and random surface polymerase chain reaction (PCR) arraying methods described in this patent, coupled to Roger Tsien et al. 's "base by base" sequencing method, is now implemented in Illumina's Hi Seq genome sequencers. In 1998, Phil Green and Brent Ewing of the University of Washington described their phred quality score for sequencer data analysis, a landmark analysis technique that gained widespread adoption, and which is still the most common metric for assessing the accuracy of a sequencing platform. Lynx Therapeutics published and marketed massively parallel signature sequencing (MPSS), in 2000. This method incorporated a parallelized, adapter/ligation mediated, bead based sequencing technology and served as the first commercially available "next generation" sequencing method, though no DNA sequencers were sold to independent laboratories.

Максам-Гилберт реттілігі

Аллан Максам мен Уолтер Гилберт 1977 жылы ДНК-ның химиялық модификациясына және белгілі бір негіздердегі келесі шалынуына негізделген ДНК тізбектеу әдісін жариялады. Химиялық секвенирлеу деп те аталатын бұл әдіс, екі тізбекті ДНК-ның тазартылған үлгілерін қосымша клондаусыз пайдалануға мүмкіндік берді. Бұл әдістің радиоактивті таңбалауды қолдануы және оның техникалық қиындығы, Сангер әдістері жетілдірілгеннен кейін кеңінен қолдануға кедергі келтірді. Максам-Гилберт тізбектеуі үшін ДНК-ның бір 5' ұшында радиоактивті таңбалау және тізбектелетін ДНК фрагментін тазарту қажет. Химиялық өңдеу содан кейін төрт реакцияның әрқайсысында (G, A+G, C, C+T) төрт нуклеотидтік негіздің бірінің немесе екеуінің шағын бөлігінде үзілістер тудырады. Модификациялайтын химиялық заттардың концентрациясы, әдетте бір ДНК молекуласына бір модификация енгізу үшін реттеледі. Осылайша, радиоактивті таңбаланған ұшынан бастап, әрбір молекуладағы алғашқы "үзілген" орнына дейін таңбаланған фрагменттердің тізбегі пайда болады. Төрт реакциядағы фрагменттер өлшем бойынша бөлу үшін денатурацияланған акриламид гельдерінде қатар электрофорезденеді. Фрагменттерді көру үшін гель авторадиография үшін рентген пленкасына қойылады, нәтижесінде радиобелгіленген ДНК фрагментіне сәйкес келетін қара жолақтар тізбегі пайда болады, олардан тізбек анықталады.

Тізбекті аяқтау әдістері

Фредерик Сангер және оның әріптестері 1977 жылы жасаған тізбек тоқтату әдісі, салыстырмалы түрде оңай және сенімді болғандықтан, тез арада басты әдіс ретінде танылды. Осы әдіс ойлап табылған кезде, Максам мен Гилберт әдісіне қарағанда тізбек тоқтату әдісі аз мөлшердегі уытты химиялық заттар мен радиоактивтілік қолданды. Оның салыстырмалы оңайлығының арқасында Сангер әдісі көп кешікпей автоматтандырылды және ДНК тізбектеудің бірінші буынындағы құрылғыларда қолданылды. Сангер тізбектеуі 1980 жылдардан 2000 жылдардың ортасына дейін басым әдіс болды. Осы кезеңде флуоресценттік белгілеу, капиллярлық электрофорез және толық автоматтандыру сияқты әдісте үлкен жетістіктерге қол жеткізілді. Бұл жетістіктер тізбектеуді әлдеқайда тиімді етуге және шығындарды төмендетуге мүмкіндік берді. Сангер әдісі – 2001 жылы алғашқы адам геномын жасауға мүмкіндік берген технология, ол геномика дәуірін бастады. Дегенмен, он жылдықтың соңында түбегейлі жаңа тәсілдер нарыққа шығып, геном құны 2001 жылы 100 миллион доллардан 2011 жылы 10 000 долларға дейін төмендеді.

Синтез арқылы реттілік

Синтез арқылы тізбектеп оқу (SBS) мақсаты – ДНК полимеразасымен нуклеотидтерді қосуды анықтау арқылы ДНК үлгісінің тізбегін анықтау болып табылады. Инженерлік полимераза ДНК-ның бір тізбегінің көшірмесін синтездеу үшін пайдаланылады және әрбір нуклеотидтің қосылуы қадағаланады. Синтез арқылы нақты уақыт реттілігінің принципі алғаш рет 1993 жылы сипатталды, ал кейінгі жылдары жетілдірілген нұсқалары жарияланды. SBS-тің барлық түрлері үшін негізгі бөліктер өте ұқсас және мыналарды қамтиды: 1) ДНК-ны күшейту (кейінгі сигналды арттыру үшін) және тізбектелетін ДНК-ны қатты тірекке бекіту, 2) қатты тіректе бір тізбекті ДНК жасау, 3) инженерлік полимеразаны пайдаланып нуклеотидтерді қосу және 4) нуклеотидтердің қосылуын нақты уақытта анықтау. 3- және 4-қадамдар қайталанады және тізбек 4-қадамда алынған сигналдардан құрастырылады. Синтез арқылы нақты уақыт реттілігінің осы принципі 454, PacBio, IonTorrent, Illumina және MGI сияқты барлық жапсарылған параллельді тізбектеп оқу құралдарында қолданылған.

Үлкен масштабтағы және de novo реттілік

Үлкен масштабтағы тізбектеу көбінесе хромосомалар сияқты өте ұзын ДНК бөліктерін тізбектеуге бағытталған, бірақ фаг дисплейінде кездесетін қысқа тізбектердің көп санын жасау үшін де қолданылуы мүмкін. Хромосомалар сияқты ұзын нысаналар үшін, кең таралған тәсілдерге үлкен ДНК фрагменттерін шектеу ферменттерімен кесу немесе механикалық күштермен бөлу арқылы қысқарақ фрагменттерге айналдыру кіреді. Фрагменттелген ДНК кейін ДНК векторына клондалып, Escherichia coli сияқты бактериялық жақта күшейтеді. Жеке бактериялық колониялардан тазартылған қысқа ДНК фрагменттері жеке-жеке тізбектеліп, электрондық түрде біртұтас, үздіріссіз тізбекке жинастырылады. Зерттеулер көрсеткендей, геномды жинастырудың тиімділігі мен дәлдігін арттыру үшін біркелкі өлшемді ДНК фрагменттерін іріктеу қадамын қосу мүмкіндігі бар. Бұл зерттеулерде автоматты өлшеу, қолмен гельде өлшеуге қарағанда, көбірек қайталанатын және дәл нәтижелер берді. "De novo sequencing" термині бұрын белгілі болмаған ДНК тізбегін анықтауға қолданылатын әдістерді білдіреді. "De novo" латын тілінен аударғанда "бастапқыдан" деген мағынаны береді. Жиналған тізбектегі үзілістерді праймерлік жүріс арқылы толтыруға болады. Әртүрлі стратегиялардың жылдамдығы мен дәлдігі әртүрлі; үлкен геномдарды тізбектеу үшін көбінесе "shotgun" әдісі қолданылады, бірақ оның жинастырылуы күрделі және қиын, әсіресе тізбектердің қайталануы геномды жинастыруда олқылықтарға себеп болуы мүмкін. Көптеген тізбектеу тәсілдері жеке ДНК молекулаларын күшейтеді, өйткені олардың молекулалық анықтау әдістері жеке молекулалық тізбектеу үшін жеткілікті сезімтал емес. Эмульсиялық ПТР (ЭПТР) май фазасындағы сулы тамшылардағы жеке ДНК молекулаларын және праймермен қапталған буындарды оқшаулайды. Полимераза тізбектік реакция (ПТР) әр буынды ДНК молекуласының клоналды көшірмелерімен жабады, содан кейін оларды кейінірек тізбектеу үшін бекітеді. Эмульсиялық ПТР Margulis және авторлар әзірлеген әдістерде қолданылады (454 Life Sciences компаниясымен коммерцияландырылған), Shendure және Porreca және басқалар (сонымен қатар "polony sequencing" деп те аталады) және SOLiD тізбектеу (Agencourt, кейін Applied Biosystems, қазір Life Technologies әзірлеген). Эмульсиялық ПТР 10x Genomics әзірлеген GemCode және Chromium платформаларында да қолданылады.

Large scale sequencing often aims at sequencing very long DNA pieces, such as whole chromosomes, although large scale sequencing can also be used to generate very large numbers of short sequences, such as found in phage display. For longer targets such as chromosomes, common approaches consist of cutting (with restriction enzymes) or shearing (with mechanical forces) large DNA fragments into shorter DNA fragments. The fragmented DNA may then be cloned into a DNA vector and amplified in a bacterial host such as Escherichia coli. Short DNA fragments purified from individual bacterial colonies are individually sequenced and assembled electronically into one long, contiguous sequence. Studies have shown that adding a size selection step to collect DNA fragments of uniform size can improve sequencing efficiency and accuracy of the genome assembly. In these studies, automated sizing has proven to be more reproducible and precise than manual gel sizing. The term "de novo sequencing" specifically refers to methods used to determine the sequence of DNA with no previously known sequence. De novo translates from Latin as "from the beginning". Gaps in the assembled sequence may be filled by primer walking. The different strategies have different tradeoffs in speed and accuracy; shotgun methods are often used for sequencing large genomes, but its assembly is complex and difficult, particularly with sequence repeats often causing gaps in genome assembly. Most sequencing approaches use an in vitro cloning step to amplify individual DNA molecules, because their molecular detection methods are not sensitive enough for single molecule sequencing. Emulsion PCR isolates individual DNA molecules along with primer coated beads in aqueous droplets within an oil phase. A polymerase chain reaction (PCR) then coats each bead with clonal copies of the DNA molecule followed by immobilization for later sequencing. Emulsion PCR is used in the methods developed by Marguilis et al. (commercialized by 454 Life Sciences), Shendure and Porreca et al. (also known as "polony sequencing") and SOLiD sequencing, (developed by Agencourt, later Applied Biosystems, now Life Technologies). Emulsion PCR is also used in the GemCode and Chromium platforms developed by 10x Genomics.

Қаруларды тізбектеу

Shotgun секвенирлеу – 1000 негіз жұбынан ұзын ДНК тізбектерін, тіпті толық хромосомаларды да талдауға арналған секвенирлеу әдісі. Бұл әдіс мақсатты ДНК-ны кездейсоқ фрагменттерге бөлуді қажет етеді. Жеке фрагменттерді тізбекті тоқтату әдісі арқылы тізбектелгеннен кейін, олардың өзара жапсарлас аймақтары негізінде тізбектерді қайта құрастыру мүмкін.

Бір молекулалы нақты уақыт реттілігі (SMRT)

SMRT реттілеуі синтез әдісіне негіделген. ДНҚ нөлдік режимдегі толқын жетекшілерінде (ZMW) – ұңғыманың түбінде орналасқан шағын, ұңғыма тәрізді контейнерлерде синтезделеді. Реттілеу өзгертілмеген полимеразаны (ZMW түбіне бекітілген) және ерітіндіде еркін ағып жатқан флуоресценттік таңбаланған нуклеотидтерді пайдалану арқылы жүзеге асырылады. Ұңғымалар осылай құрылған, ұңғыманың түбінде пайда болатын флуоресценция ғана анықталады. Нуклеотид ДНҚ тізбегіне қосылғаннан кейін флуоресценттік таңба одан ажыратылады, нәтижесінде өзгертілмеген ДНҚ тізбегі қалады. SMRT технологиясын әзірлеуші Pacific Biosciences (PacBio) компаниясының мәлімдемесіне сәйкес, бұл әдіс нуклеотидтік модификацияларды (мысалы, цитозин метилирлеуін) анықтауға мүмкіндік береді. Бұл полимераза кинетикасын бақылау арқылы жүзеге асырылады. Бұл тәсіл 20 000 немесе одан да көп нуклеотидті оқуға мүмкіндік береді, орташа оқу ұзындығы 5 килобазаны құрайды. 2015 жылы Pacific Biosciences компаниясы PacBio RS II құралындағы 150 000 ZMW-мен салыстырғанда 1 миллион ZMW-ге ие Sequel System деп аталатын жаңа реттілеу құралын іске қосылғанын хабарлады. SMRT реттілеуі «үшінші буын» немесе «ұзақ оқу» реттілеуі деп аталады.

Нанопоралық ДНК тізбектеу

Нанопорадан өтетін ДНҚ иондық тогын өзгертеді. Бұл өзгеріс ДНК-ның пішініне, мөлшеріне және ұзындығына байланысты. Әрбір нуклеотид түрі ион ағынын тесіктен әртүрлі уақытқа тоқтатады. Бұл әдіс өзгертілген нуклеотидтерді қажет етпейді және нақты уақытта жүзеге асырылады. Нанопоралық секвенирлеу SMRT секвенирлеумен қатар "үшінші буын" немесе "ұзақ оқылым" секвенирлеуі деп аталады. Бұл әдісті зерттеудің алғашқы өндірістік жұмыстары "экзонуклеазалық секвенирлеу" деп аталатын техникаға негізделген, онда электр сигналдарын оқу циклодекстринмен ковалентті байланысқан альфа (α) гемолизин поры арқылы өтетін нуклеотидтер арқылы жүзеге асырылды. Бірақ кейіннен коммерциялық әдіс – "жіп секвенирлеуі" – ДНК негіздерін толық жіпте секвенирледі. Нанопоралық секвенирлеудің дамуындағы екі негізгі бағыт – қатты күйдегі нанопоралық секвенирлеу және белокқа негізделген нанопоралық секвенирлеу. Белоктық нанопоралық секвенирлеуде α гемолизин, MspA (Mycobacterium smegmatis Porin A) немесе CssG сияқты мембраналық белок кешендері пайдаланылады, олар жеке және нуклеотидтер тобын ажырату қабілетіне байланысты үлкен үміттер береді. Керісінше, қатты күйдегі нанопоралық секвенирлеуде кремний нитриді және алюминий оксиді сияқты синтетикалық материалдар қолданылады және олардың жоғары механикалық қабілеті мен жылулық және химиялық тұрақтылығы үшін артықшылыққа ие. Осы типтегі секвенирлеу үшін жасау әдісі маңызды, себебі нанопоралық массивтің диаметрі сегіз нанометрден кіші жүздеген пораларды қамтуы мүмкін.

Массивті параллельді қолтаңбалар тізбектеу (MPSS)

Жоғары өнімділікті тізбектеу технологияларының алғашқысы, жаппай параллель қолтаңба тізбектеу (немесе MPSS, сондай-ақ жаңа буын тізбектеу деп аталады) 1990 жылдары Lynx Therapeutics компаниясында жасалды, ал бұл компанияны 1992 жылы Сидней Бреннер мен Сэм Элетр құрған. MPSS – бұл төрт нуклеотидтік қадамдармен тізбекті оқу арқылы адаптерлерді қосып, содан кейін адаптерлерді декодтауды қолданатын, шариктерге негізделген әдіс. Бұл әдіс оны нақты тізбектерге қатысты бұрмалауға немесе нақты тізбектерді жоғалтуға осал етті. Технологияның өте күрделі болғандықтан, MPSS тек Lynx Therapeutics компаниясының өз ішінде орындалды және тәуелсіз зертханаларға ДНК тізбектеу машиналары сатылмады. Lynx Therapeutics 2004 жылы Solexa компаниясымен бірікті (кейін Illumina сатып алды), бұл синтез арқылы тізбектеуді дамытуға әкелді, бұл Manteia Predictive Medicine компаниясынан алынған қарапайым тәсіл болды және MPSS-ті қолданыстан шығарды. Дегенмен, MPSS нәтижелерінің маңызды қасиеттері кейінгі жоғары өнімді дерек түрлеріне тән болды, оның ішінде жүздеген мың қысқа ДНК тізбектері. MPSS жағдайында олар әдетте гендік экспрессия деңгейін өлшеу үшін кДНК тізбегін анықтау үшін қолданылды. Ол in vitro жұптасқан тегтер кітапханасын, эмульсиялық ПТР, автоматтандырылған микроскоппен және лигацияға негізделген тізбектеу химиясымен біріктіріліп, *E. coli* геномын >99,9999% дәлдікпен және Сангер тізбектеуіне қарағанда шамамен 1/9 бөлігіне тең құнмен тізбектеуге мүмкіндік берді. Ол Solexa компаниясында тиісті патенттерде аталған адамдармен ішкі түрде жасалды. 2004 жылы Solexa компаниясы 1997 жылы Паскаль Майер мен Лоран Фаринелли ойлап тапқан жаппай параллель тізбектеу технологиясын алу үшін Manteia Predictive Medicine компаниясын сатып алды.

Комбинациялық зондты бекіту синтезі (cPAS)

Бұл әдіс 2013 жылы қытайлық BGI геномдық компаниясының құрамына енген Complete Genomics компаниясы сипаттаған комбинаторлық зондты якорлау технологиясының (cPAL) жаңартылған түрі болып табылады. Екі компания да технологияны жетілдіріп, оқу ұзақтығын ұзартты, реакция уақытын қысқартты және нәтижелерге жедел қол жеткізуді қамтамасыз етті. Сонымен қатар, деректер енді стандартты FASTQ файл форматында үздіріліссіз, толық ұзындығындағы оқылымдар түрінде жасалады және көптеген қысқа оқылымға негізделген биоинформатикалық талдау жүйелерінде өзгеріссіз қолданылуы мүмкін. Бұл жоғары өнімді секвенирлеу технологиясының негізін құрайтын екі технология – ДНК нанодоптар (ДНБ) және нанодоптарды қатты бетке бекітуге арналған үлгілі массивтер. Нәтижесінде, Illumina секвенирлеуге ұқсас мөлшердегі және ұзындықтағы тізбектер алынады.

ДНК наношарлар тізбесін анықтау

ДНҚ нанодоп тізбектеуі – организмнің толық геномдық тізбесін анықтауға қолданылатын жоғары өнімді тізбектеу технологиясының бір түрі. Complete Genomics компаниясы тәуелсіз зерттеушілерден алынған үлгілерді тізбектеу үшін осы технологияны пайдаланады. Әдіс геномдық ДНҚ-ның шағын фрагменттерін ДНҚ нанодоптарына көбейту үшін дөңгелек репликацияны қолданады. Тізбектелмеген лигация арқылы тізбектеу әдісі нуклеотидтік тізбекті анықтау үшін қолданылады. Дегенмен, әрбір ДНҚ нанодопынан ДНҚ-ның тек қысқа тізбектері ғана анықталады, бұл қысқа оқылымдарды эталондық геноммен салыстыруды қиындатады. Оқылымдардың ұзындығы шамамен 35 базалық жұпты құрайды. Бұл технологияны ерекшелендіргені – ол бұл кластағы алғашқы технология болып, күшейтілмеген ДНҚ-ны тізбектеп, күшейту кезеңдерімен байланысты қателердің пайда болуын болдырмады. 2009 жылы Heliscope құрылғысы арқылы адам геномы тізбектелді, бірақ 2012 жылы компания банкротқа ұшырады.

Микротірістік жүйелер

ДНҚ тізбектеу үшін екі негізгі микрофлюидтік жүйе қолданылады: тамшылық микрофлюидтер және цифрлық микрофлюидтер. Микрофлюидтік құрылғылар қазіргі тізбектеу массивтерінің көптеген шектеулерін шешеді. Абате және авторлар тобы ДНК тізбектеу үшін тамшылық микрофлюидтік құрылғыларды қолдануды зерттеді. Бұл құрылғылар секундына мыңдаған рет пиколитрлік тамшыларды қалыптастырып, өңдей алады. Құрылғылар полидиметилсилоксаннан (PDMS) жасалған және тамшыларда қамтылған ДНК тізбектерін оқу үшін Форстердің резонанстық энергия беру (FRET) талдауларын қолданды. Массивтегі әрбір позиция нақты 15 негіздік тізбек үшін тексерілді. Маңызды артықшылықтарына құрылғының тасымалдануы, реагент көлемі, талдау жылдамдығы, жаппай өндіріс мүмкіндігі және жоғары өнімділік жатады. Бұл зерттеу цифрлық құрылғыларды пиросеквенттеу үшін қолдануға болатындығын көрсететін концепциялық дәлел ұсынды; зерттеу ферменттерді кеңейтуді және таңбаланған нуклеотидтерді қосуды қамтитын синтезді пайдалануды қамтыды. Олар электрлік ылғалдану құрылғысын қолданып, тамшыларды жасады, араластырды және бөлді. Тізбектеу үшін үш ферменттік протокол және магниттік гранулалармен бекітілген ДНК үлгілері пайдаланылды. Құрылғы екі протокол бойынша сыналып, шикі пирограмма деңгейіне сүйенген 100% дәлдік көрсетті. Бұл цифрлық микрофлюидтік құрылғылардың артықшылықтары – көлемі, құны және функционалдық интеграцияның қол жетімді деңгейлері. Бұл ДНК тізбектеудің көптеген әдістерін одан әрі қолдануға және геномдар мен транскриптомдар туралы толығырақ білуге мүмкіндік береді.

Дамудағы әдістер

Қазіргі уақытта даму үстінде жатқан ДНК тізбектеу әдістеріне ДНК таспасы наносаңылаулар арқылы өтетін кезде тізбекті оқу (бұл әдіс қазір коммерциялық қолданыста, бірақ қатты күйдегі наносаңылаулар сияқты келесі буын технологиялары әлі де дамытылуда) және атомдық күш микроскопиясы немесе беріліс электронды микроскопиясы сияқты микроскопияға негізделген әдістер жатады. Бұл әдістер ұзын ДНК фрагменттеріндегі (>5,000 bp) жеке нуклеотидтердің орналасқан жерін анықтау үшін ауыр элементтермен (мысалы, галогендермен) нуклеотидтерді белгілеу арқылы визуальды анықтау және тіркеу үшін қолданылады. Үшінші буын технологиялары артық реагенттерді қолдану қажеттілігін жойып, ДНК полимеразаның процессивтілігін пайдалану арқылы өнімділікті арттыруға, нәтиже алу уақытын қысқартуға және құнын төмендетуге бағытталған.

Туннельдік тоқтар ДНК тізбесін анықтау

Тағы бір тәсіл, бір таспалы ДНК арна арқылы жылжып өтетін кезде электрлік туннельдік тоқтарды өлшеуді пайдаланады. Әр базаның электрондық құрылысына байланысты, олар туннельдік токқа әртүрлі әсер етеді, бұл әртүрлі базаларды ажыратуға мүмкіндік береді. Туннельдік тоқтарды қолдану, иондық тоқ әдістерімен салыстырғанда, ДНК тізбегін бірнеше есе жылдам анықтауға мүмкіндік береді және бірнеше ДНК олигомерлері мен микро РНК тізбегінің нәтижелеріне қол жеткізілді.

Гибридтеу арқылы реттілік

Гибридтеу арқылы секвенирлеу – ДНК микромассивін пайдаланатын ферменттік емес әдіс. Секвенирленетін ДНК-ның бір ғана жиынтығы флуоресценттік маркамен белгіленеді және белгілі тізбектерді қамтитын массивке гибридтеледі. Массивтегі нақты бір нүктеден алынған күшті гибридтеу сигналы, секвенирленетін ДНК-дағы оның тізбегін анықтайды. Бұл секвенирлеу әдісі мақсатты ДНК тізбегін қайта құру үшін қысқа, бір тізбекті ДНК молекулаларының (олигонуклеотидтер) кітапханасының байланысу қасиеттерін пайдаланады, олар ДНК зондтары деп те аталады. Бөгде гибридтер жуу арқылы жойылады және мақсатты ДНК элюцияланады. Гибридтер ДНК тізбегін қайта құруға мүмкіндік беретіндей етіп қайта реттеледі. Бұл секвенирлеу түрінің артықшылығы – біртекті жабылумен көптеген нысаналарды анықтау мүмкіндігі. Әдетте, көп мөлшерде химиялық заттар мен бастапқы ДНК қажет болады. Алайда, ерітіндідегі гибридтеудің дамуымен жабдық пен химиялық заттардың қажетті мөлшері азайды. MS негізделген әдістермен қамтамасыз етілген ДНК фрагменттерінің жоғары ажыратымдылығы сот-медициналық сарапшылар үшін ерекше қызығушылық тудырады, себебі олар адам ДНК үлгілеріндегі жеке нуклеотидтік полиморфизмдерді анықтап, жеке тұлғаларды сәйкестендіруге тырысады. Бұл үлгілер нашарлаған болуы мүмкін, сондықтан сот-медициналық сарапшылар көбінесе митохондриялық ДНК-ны оның жоғары тұрақтылығы және генеалогиялық зерттеулердегі қолданылуы үшін жақсы көреді. MS негізделген секвенирлеу әдістері Федералдық Тергеу бюросының дерекқорындағы үлгілердегі және Бірінші дүниежүзілік соғысының жаппай қабірлерінен табылған сүйектердегі адам митохондриялық ДНК тізбектерін салыстыру үшін қолданылған. Жедел тізбектеу тоқтату және TOF MS әдістері 100 базалық жұпқа дейінгі оқу ұзындықтарын көрсетті. Зерттеушілер осы орташа оқу мөлшерінен асып түсе алмады; тізбектеуді тоқтату секвенирлеуі сияқты, MS негізделген ДНК секвенирлеуі үлкен de novo секвенирлеу жобаларына қолайлы болмауы мүмкін. Дегенмен, жақында жүргізілген зерттеуде қысқа тізбек оқулары мен массалық спектроскопия патогенді Streptococcus штаммдарындағы жеке нуклеотидтік полиморфизмдерді салыстыру үшін қолданылды.

Микрофлюидтық Сангер реттілігі

Микрофлюидті Сангер секвенирлеуде ДНК фрагменттерінің толық термоциклдік күшейтілуі және олардың электрофорез арқылы бөлінуі бір шыны пластинкада (шамамен 10 см диаметрлі) жүзеге асырылады, бұл реагенттердің қолданылуын және шығындарды азайтады. Кейбір жағдайларда зерттеушілер микрочиптерді пайдалану арқылы дәстүрлі секвенирлеудің өнімділігін арттыра алатынын көрсеткен. Бұл технологияны тиімді ету үшін қосымша зерттеулер қажет.

Микроскопияға негізделген әдістер

Бұл тәсіл электронды микроскопия арқылы ДНК молекулаларының тізбегін тікелей көрсетеді. Ферменттік түрде атомдық саны жоғары атомдарды қамтитын модификацияланған негіздерді енгізу арқылы, бұрынғы толық ДНК молекулаларының ішіндегі ДНК негіздерінің жұптарын анықтау, сондай-ақ синтетикалық 3272 негіз жұпты ДНК молекуласы мен 7249 негіз жұпты вирустық геномда жекелеген таңбаланған негіздерді тікелей визуализациялау және анықтау мүмкіндігі көрсетілді.

РНҚЖ тізбектеу

Бұл әдіс полистирол бөлшегіне бекітілген РНК полимеразасын (РНКП) пайдалануға негізделген. Секуенциялануға тиіс ДНК-ның бір ұшы екінші бөлшекке жалғастырылады, ал екі бөлшек те оптикалық тұзақтарға орналастырылады. Транскрипция кезінде РНКП-ның қозғалысы бөлшектерді жақындастырады және олардың арақашықтығы өзгереді, бұл өзгеріс бір нуклеотидтік дәлдікпен тіркеледі. Тізбек, Сангер әдісіне ұқсас, төрт нуклеотид түрінің әрқайсысының төмендетілген концентрациясымен алынған төрт мәлімет негізінде анықталады. Белгілі тізбек аймақтарымен белгісіз тізбек аймақтарын салыстыру арқылы аймақтар арасында салыстыру жүргізіледі және тізбек туралы ақпарат шығарылады.

Вирусты жоғары өнімділікпен ин витро секвенирлеу

454 пиросекуенттеу және in vitro жағдайында вирус мРНК-ны көрсету әдісін қолдана отырып, ақуыздық өзара әрекеттесулердің толық жиынтығын талдауға арналған әдіс әзірленді. Атап айтқанда, бұл әдіс қызығушылық тудыратын ақуыздарды оларды кодтайтын мРНК-ға ковалентті байланыстырады, содан кейін кері транскрипциялы ПТР арқылы мРНК фрагменттерін анықтайды. МРНК-ны күшейту және тізбектеу мүмкін. Бұл біріктірілген әдіс IVV HiTSeq деп аталды және оны жасушасыз жағдайда жүргізуге болады, бірақ оның нәтижелері in vivo жағдайларын толық көрсете бермейді.

Нарықтық үлесі

ДНҚ-ны тізбектеудің көптеген әртүрлі тәсілдері болғанымен, нарықта тек бірнешеуі ғана басымдық танытады. 2022 жылы Illumina нарықтың шамамен 80 пайызын құрады; қалған бөлігін бірнеше компания (PacBio, Oxford, 454, MGI) бөліседі.

Үлгілерді дайындау

Кез келген ДНК тізбектеу протоколының табысы қызығушылық тудыратын биологиялық материалдан алынған ДНК немесе РНК үлгісін алу және дайындауға байланысты. ДНК-ны сәтті алу нәтижесінде ұзын, бүлінбеген тізбектер алынады. РНК-ны сәтті алу РНК-ны кері транскриптазаны (РНК-ның бар тізбектеріне негізделген комплементарлы ДНК-ны ПТР-ға ұқсас тәсілмен синтездейтін ДНК полимеразасын пайдалана отырып) комплементарлы ДНК-ға (cDNA) түрлендіруге мүмкіндік береді. Содан кейін комплементарлы ДНК геномдық ДНК сияқты өңделеді. ДНК немесе РНК алудан кейін, тізбектеу әдісіне байланысты үлгіні одан әрі дайындау қажет болуы мүмкін. Сангер тізбектеуі үшін тізбектеуден бұрын клондау немесе ПТР процедуралары қажет. Келесі буын тізбектеу әдістерінде өңдеуден бұрын кітапхананы дайындау қажет. Алудан кейін де, кітапхана дайындаудан кейін де нуклеин қышқылының сапасы мен санын бағалау, ыдыраған, фрагменттелген және тазалығы төмен үлгілерді анықтайды және жоғары сапалы тізбектеу деректерін қамтамасыз етеді. Қазіргі ДНК/РНК тізбектеу технологияларының жоғары өнімділігі үлгіні дайындау әдісінің масштабын кеңейтуге қиындық туғызады. Үлгіні көп мөлшерде дайындау және қолмен жұмыс уақытын азайту үшін бірнеше сұйықтықтарды өңдеу құралдары қолданылады:
КомпанияСұйықтықтарды өңдеу құралдары / АвтоматтандыруТөменгі шегі (USD)Жоғарғы шегі (USD)Сілтеме URL
OpentronsOpenTrons OT 2$6,500$20,000https://www.opentrons.com/
GilsonGilson Pipetmax$20,000$40,000https://gb.gilson.com/GBSV/system-pipetmax.html
NeotecNeotec EzMate$25,000$45,000http://neotec.co.il/pipetting-device/
FormulatrixFormulatrix Mantis$40,000$60,000https://formulatrix.com/liquid-handling-systems/mantis-liquid-handler/
Hudson RoboticsHudson Robotics SOLO$40,000$50,000https://hudsonrobotics.com/products/applications/automated-solutions-next-generation-sequencing-ngs/
HamiltonHamilton Microlab NIMBUS$40,000$80,000https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/platforms/microlab-nimbus#specifications
TTP LabtechTTP Labtech Mosquito HV Genomics$45,000$80,000https://www.sptlabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hv-genomics/
Beckman CoulterBiomek 4000$50,000$65,000https://www.mybeckman.uk/liquid-handlers/biomek-4000/b22640
HamiltonHamilton Genomic STARlet$50,000$100,000https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/assay-ready-workstations/genomic-starlet
EppendorfEppendorf epMotion 5075t$95,000$110,000https://www.eppendorf.com/epmotion/
Beckman CoulterBeckman Coulter Biomek i5$100,000$150,000https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i5
HamiltonHamilton NGS STAR$100,000$200,000http://www.hamiltonrobotics.com/
PerkinElmerPerkinElmer Sciclone G3 NGS and NGSx Workstation$150,000$220,000https://www.perkinelmer.com/uk/product/sciclone-g3-ngs-workstation-cls145321
AgilentAgilent Bravo NGS$170,000$290,000https://www.agilent.com/en/products/automated-liquid-handling/automated-liquid-handling-applications/bravo-ngs
Beckman CoulterBeckman Coulter Biomek i7$200,000$250,000https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i7
LabcyteEcho 525 Beckman Coulter Labcyte Echo 525$260,000$300,000https://www.labcyte.com/products/liquid-handling/echo-525-liquid-handler
TecanTecan NGS$270,000$350,000https://lifesciences.tecan.com/ngs-sample-preparation

The success of any DNA sequencing protocol relies upon the DNA or RNA sample extraction and preparation from the biological material of interest. A successful DNA extraction will yield a DNA sample with long, non degraded strands. A successful RNA extraction will yield a RNA sample that should be converted to complementary DNA (cDNA) using reverse transcriptase—a DNA polymerase that synthesizes a complementary DNA based on existing strands of RNA in a PCR like manner. Complementary DNA can then be processed the same way as genomic DNA. After DNA or RNA extraction, samples may require further preparation depending on the sequencing method. For Sanger sequencing, either cloning procedures or PCR are required prior to sequencing. In the case of next generation sequencing methods, library preparation is required before processing. Assessing the quality and quantity of nucleic acids both after extraction and after library preparation identifies degraded, fragmented, and low purity samples and yields high quality sequencing data. The high throughput nature of current DNA/RNA sequencing technologies has posed a challenge for sample preparation method to scale up. Several liquid handling instruments are being used for the preparation of higher numbers of samples with a lower total hands on time:
companyLiquid handlers / Automationlower mark USDupper mark USDlanding urlOpentronsOpenTrons OT 2$6,500$20,000https://www. opentrons. com/GilsonGilson Pipetmax$20,000$40,000https://gb. gilson. com/GBSV/system pipetmax. htmlNeotecNeotec EzMate$25,000$45,000http://neotec. co. il/pipetting device/FormulatrixFormulatrix Mantis$40,000$60,000https://formulatrix. com/liquid handling systems/mantis liquid handler/Hudson RoboticsHudson Robotics SOLO$40,000$50,000https://hudsonrobotics. com/products/applications/automated solutions next generation sequencing ngs/HamiltonHamilton Microlab NIMBUS$40,000$80,000https://www. hamiltoncompany. com/automated liquid handling/platforms/microlab nimbus#specificationsTTP LabtechTTP Labtech Mosquito HV Genomics$45,000$80,000https://www. sptlabtech. com/products/liquid handling/mosquito hv genomics/Beckman CoulterBiomek 4000$50,000$65,000https://www. mybeckman. uk/liquid handlers/biomek 4000/b22640HamiltonHamilton Genomic STARlet$50,000$100,000https://www. hamiltoncompany. com/automated liquid handling/assay ready workstations/genomic starletEppendorfEppendorf epMotion 5075t$95,000$110,000https://www. eppendorf. com/epmotion/Beckman CoulterBeckman Coulter Biomek i5$100,000$150,000https://www. beckman. com/liquid handlers/biomek i5HamiltonHamilton NGS STAR$100,000$200,000http://www. hamiltonrobotics. com/PerkinElmerPerkinElmer Sciclone G3 NGS and NGSx Workstation$150,000$220,000https://www. perkinelmer. com/uk/product/sciclone g3 ngs workstation cls145321AgilentAgilent Bravo NGS$170,000$290,000https://www. agilent. com/en/products/automated liquid handling/automated liquid handling applications/bravo ngsBeckman CoulterBeckman Coulter Biomek i7$200,000$250,000https://www. beckman. com/liquid handlers/biomek i7Labcyte Echo 525Beckman Coulter Labcyte Echo 525$260,000$300,000https://www. labcyte. com/products/liquid handling/echo 525 liquid handlerTecanTecan NGS$270,000$350,000https://lifesciences. tecan. com/ngs sample preparation

Даму бастамалары

2006 жылдың қазан айында X Prize Foundation толық геномды секвенирлеу технологияларын дамытуға бағытталған бастама құрды, ол Archon X Prize деп аталды. Бұл бастаманың мақсаты – 100 адам геномын 10 күн немесе одан кем уақыт ішінде секвенирлей алатын құрылғыны жасаған және пайдаланған алғашқы командаға 10 миллион доллар сыйлық беру еді. Секвенирлеу кезінде әр 100 000 базаның арасында тек бір қателікке дейін рұхсат етіледі, геномның кем дегенде 98% -ы дәл жабылуы керек, ал әр геномды секвенирлеудің қайталама құны 10 000 АҚШ долларынан аспауы тиіс. Ұлттық Адам Геномдық Зерттеу Институты (NHGRI) жыл сайын геномика саласындағы жаңа зерттеулер мен жетістіктерді қолдау үшін гранттар ұсынады. 2010 жылғы гранттар мен 2011 жылғы үміткерлердің арасында микрофлюидтік, полоний және базалық секвенирлеу әдістемелері бойынша жұмыстарды жалғастыру көрініс тапты.

Есептеулік қиындықтар

Мұнда сипатталған тізбектеу технологиялары толық геномдар сияқты ұзын тізбектерге құрастырылуы тиіс шикі деректерді шығарады (тізбек құрастыру). Бұл үшін көптеген есептеу қиындықтары бар, мысалы, Phred және Phrap сияқты бағдарламалар мен алгоритмдер арқылы жүзеге асырылатын шикі тізбек деректерін бағалау. Басқа да қиындықтар бар, олар геномның көптеген жерлерінде кездесетін қайталанатын тізбектермен байланысты, бұл толық геномдық құрастыруға кедергі келтіреді. Осының салдарынан көптеген тізбектер нақты хромосомаларға жатқызылмауы мүмкін. Шикі тізбек деректерін алу – оның егжей-тегжейлі биоинформатикалық талдауының тек бастамасы ғана. Дегенмен, жаңа тізбектеу және тізбектеу қателерін түзету әдістері әзірленді.

Этика мәселелері

Адам генетикасы 1970-ші жылдардың басынан бері биоэтика саласына енгізілді және ДНК тізбектеудің (әсіресе жоғары өнімді тізбектеу) қолданылуының артуы бірқатар этикалық мәселелерді тудырды. Бір маңызды мәселе – жеке адамның ДНК-сы және осы ДНК тізбектеу кезінде алынған деректерге меншік құқығы. ДНК молекуласының өзіне қатысты, осы тақырып бойыншағы бас заңдық іс, Moore v. Regents of the University of California (1990) адамдардың тасталған жасушаларға немесе осы жасушаларды пайдаланудан алынған табысқа меншік құқығы жоқ екенін шешті (мысалы, патенттелген жасуша штаммы ретінде). Дегенмен, жеке адамдар жасушаларды алу және пайдалану туралы толыққанды хабардар болуға және келісім беруге құқылы. ДНК тізбектеу арқылы алынған деректерге қатысты, Moore жеке адамға оның ДНК-сынан алынған ақпаратқа ешқандай құқық бермейді. Мысалы, сақтандыру компаниялары жеке адамның геномдық деректерін, оның ДНК-сына сүйене отырып, болашақтағы денсаулығына байланысты тарифін өзгерту үшін пайдалануы мүмкін деген алаңдаушылық бар. 2008 жылдың мамыр айында АҚШ-та «Генетикалық ақпаратты кемсітуге қарсы заң» (GINA) қабылданды, ол денсаулық сақтану және жұмысқа орналасу кезінде генетикалық ақпарат негізінде кемсітуге тыйым салады. 2012 жылы АҚШ Президентінің биоэтикалық мәселелерді зерттеу комиссиясы GINA және Денсаулық сақтану сақтандыруының портативтілігі және жауапкершілік туралы заң сияқты ДНК тізбектеу деректері үшін қолданыстағы құпиялылық заңнамасы жеткіліксіз екенін хабарлады, толық геном тізбектеу деректерінің ерекше сезімтал екенін атап өтті, себебі оны деректерді жасаған адамды ғана емес, сонымен қатар оның туыстарын анықтау үшін де пайдалануға болады. АҚШ-тың көп бөлігінде «тасталған» ДНК, мысалы, сілекейленген маркадан немесе конверттен, кофе кесесінен, темекіден, шайнама сағыздан, үй қоқысынан немесе қоғамдық тротуарда түскен шаштан табылған ДНК-ны полиция, жеке тергеушілер, саяси қарсыластар немесе әкелік дауларына қатысы бар адамдар, соның ішінде кез келген адам заңды түрде жинап, тізбектеп ала алады. 2013 жылдың соңына қарай он бір штат «ДНК ұрлауын» тыйым салатын заңдарға ие. 23andMe сияқты компаниялардың нәрестелерде де, ересектерде де генетикалық өзгерістерді тексерудің кеңінен қолданылуы этикалық мәселелерді тудырды. Генетикалық өзгерістерді тексерудің зиянды болуы мүмкін екендігі, ауруға бейімділігі жоғары адамдарда алаңдаушылықты күшейтуі мүмкін екендігі айтылды. Мысалы, Time журналында жазылған бір жағдайда, дәрігерлер ауырған баланың генетикалық түрін тексергенде, ата-анасына зияткерлік кемшілікпен байланысты емес түрдің табылуын хабарламауды шешті, себебі бұл ата-анаға зиян келтіруі мүмкін еді. Алайда, 2011 жылы The New England Journal of Medicine журналында жарияланған зерттеуде ауру қаупін бағалаудан өткен адамдардың алаңдаушылығының арта қоймағаны көрсетілді.

Human genetics have been included within the field of bioethics since the early 1970s and the growth in the use of DNA sequencing (particularly high throughput sequencing) has introduced a number of ethical issues. One key issue is the ownership of an individual's DNA and the data produced when that DNA is sequenced. Regarding the DNA molecule itself, the leading legal case on this topic, Moore v. Regents of the University of California (1990) ruled that individuals have no property rights to discarded cells or any profits made using these cells (for instance, as a patented cell line). However, individuals have a right to informed consent regarding removal and use of cells. Regarding the data produced through DNA sequencing, Moore gives the individual no rights to the information derived from their DNA. For instance, one concern is that insurers may use an individual's genomic data to modify their quote, depending on the perceived future health of the individual based on their DNA. In May 2008, the Genetic Information Nondiscrimination Act (GINA) was signed in the United States, prohibiting discrimination on the basis of genetic information with respect to health insurance and employment. In 2012, the US Presidential Commission for the Study of Bioethical Issues reported that existing privacy legislation for DNA sequencing data such as GINA and the Health Insurance Portability and Accountability Act were insufficient, noting that whole genome sequencing data was particularly sensitive, as it could be used to identify not only the individual from which the data was created, but also their relatives. In most of the United States, DNA that is "abandoned", such as that found on a licked stamp or envelope, coffee cup, cigarette, chewing gum, household trash, or hair that has fallen on a public sidewalk, may legally be collected and sequenced by anyone, including the police, private investigators, political opponents, or people involved in paternity disputes. As of 2013, eleven states have laws that can be interpreted to prohibit "DNA theft". Ethical issues have also been raised by the increasing use of genetic variation screening, both in newborns, and in adults by companies such as 23andMe. It has been asserted that screening for genetic variations can be harmful, increasing anxiety in individuals who have been found to have an increased risk of disease. For example, in one case noted in Time, doctors screening an ill baby for genetic variants chose not to inform the parents of an unrelated variant linked to dementia due to the harm it would cause to the parents. However, a 2011 study in The New England Journal of Medicine has shown that individuals undergoing disease risk profiling did not show increased levels of anxiety.